Для наблюдения за нарушениями желчных протоков новорожденных требуется интактный желчный проток и эффективная подготовка. Поэтому был успешно разработан новый подход к выделению всей внепеченочной системы желчных протоков у новорожденных мышей при сохранении целостности желчного протока.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Внепеченочный желчный проток и рассечение желчного пузыря у новорожденных девятидневных мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Рассечение мышиных неонатальных желчных протоков было описано как трудное. Основной целью описанной стандартной операционной процедуры является выделение внепеченочного желчного протока (EBD) у новорожденных мышей без повреждения желчного протока во время подготовки. Из-за его исключительно близкой подготовки по сравнению с клеточной линией холангиоцитов и сбором всей внепеченочной системы желчных протоков (EBDS), описанный подход чрезвычайно полезен при исследовании животных моделей нарушений желчных протоков новорожденных, таких как атрезия желчевыводящих путей. После эвтаназии была получена доступ к брюшной полости, а система желчных протоков, двенадцатиперстная кишка и печень были извлечены с помощью уникальной En-bloc-resection (EbR). Извлеченный образец помещают на пенопластовый мат, а EBD рассекают от загрязняющих клеток атравматично без необходимого прикосновения. Рассечение всей EBDS является существенным преимуществом этого метода. Следует соблюдать осторожность из-за небольшого размера и количества ткани желчных протоков. При использовании описанной методики не происходит повреждения холангиоцитов. Далее чистота методики воспроизводима (n = 10). Таким образом, можно собрать оптимально сопоставимые образцы. Кроме того, ткань желчных протоков не повреждается, потому что любого контакта с системой желчных протоков можно избежать во время приготовления, оставив желчную жидкость внутри желчного пузыря. Самое главное, что при выполнении заключительного рассечения желчного пузыря и желчных протоков атравматические микроинструменты использовались лишь незначительно латерально от желчного протока, не сдавливая его. Это ключ к чистому и неповрежденному образцу и необходим для дальнейшего гистологического исследования или выделения холангиоцитов. Подводя итог, можно сказать, что описанная инновационная методика вскрытия позволяет особенно неопытным операторам с необходимым оборудованием максимально четко изолировать EBDS.
Введение
Генезис и прогрессирование холангиопатий, таких как билиарная атрезия, первичный склерозирующий холангит (PSC) и первичный билиарный холангит (PBC), либо неизвестны, либо неполны 1,2. Ограниченное понимание происхождения и прогрессирования этих заболеваний приводит к нехватке вариантов терапии3. Самым сложным препятствием в изучении неонатальных нарушений желчных протоков является получение молекулярного понимания патофизиологии. Одним из важных ключей к лучшему пониманию молекулярной патологии является наилучшее наблюдение за пораженной тканью. Чтобы избежать снижения сопоставимости и расхождений между исследованиями, таких как наблюдение за потенциальной вирусной этиологией атрезии желчевыводящихпутей 4, возникает необходимость в наилучшей возможной подготовке и совместном использовании выполненных методов диссекции. Чистая подготовка ткани-мишени необходима для последующих микроскопических исследований или разведения клеточных и 3D-органоидных культур. Однако при неонатальных заболеваниях мышей образцы тканей встречаются редко и встречаются только в небольшом количестве из-за очень маленького размера. Что касается нарушений желчных протоков, то описаны трудности в чистой подготовке желчных протоков у новорожденных мышей5. Из-за неонатальной стадии развития дифференцировка тканей не слишком развита, что затрудняет подготовку и увеличивает сложность по сравнению с подготовкой взрослых образцов. Поэтому операционная рабочая группа исследовала новую стратегию подготовки EBDS в модели неонатальной мыши. В настоящем исследовании этот метод позволяет эффективно распределять каждый образец.
Система желчных протоков внутрибрюшинно размещается в правой верхней части живота, возникая из печени. Желчный пузырь расположен под висцеральной поверхностью правой доли печени. Желчный проток вместе с воротной веной и печеночной артерией внедряется в гепатодуоденальную связку. Он соединяет печень и двенадцатиперстную кишку непосредственно и дренирует желчную жидкость в двенадцатиперстную кишку6. Анатомически желчный проток делится на правый и левый печеночный протоки, общий печеночный проток, кистозный проток и Ductus choledochus, который образуется слиянием кистозного протока и общего печеночного протока7. Этот в конечном итоге опорожняет желчную жидкость и слюну из протока поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку через ампулу Фатера.
Холангиоциты выстилают желчный проток внутри- и экстрагепатически, обитая в сложной анатомической нише, где они помогают в производстве желчи и гомеостазе8. Желчная жидкость ежедневно проходит через эти специализированные эпителиальные клетки в высоких концентрациях. В частности, поддержание зонтика HCO3 очень важно для защиты от токсичности желчных кислот9. Холангиоциты являются первой линией обороны в гепатобилиарной системе против, например, просветных микроорганизмов10. Защитная эффективность холангиоцитов от токсических атак может быть ослаблена генетической предрасположенностью. Токсическая перегрузка вызывает повреждение и разрушение и, следовательно, может привести к холангиопатии. Кроме того, развивающийся желчный проток не полностью способен ко всем самозащитным механизмам, что приводит к более высокой восприимчивости к токсинам окружающей среды в желчных протоках новорожденных11.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
После этического одобрения (N045/2021) новорожденные самцы и самки мышей C57BL/6 наблюдались до 9-дневного возраста. Животные были рождены и предоставлены для экспериментальных целей учреждением для животных Университетской медицинской клиники Гамбург-Эппендорф, Гамбург, Германия. Новорожденных помещали в клетку вместе с родительскими животными. Условия окружающей среды контролировались при температуре (20-24 °C), цикле 12:12 ч свет-темнота и относительной влажности 40%-70%.
1. Экспериментальная подготовка
- Подготовить необходимое оборудование для хирургической операции, включая ножницы, щипцы и т.д. (см. Таблицу материалов).
- Поместите продезинфицированные и автоклавные инструменты на стерильную поверхность рядом с операционным столом.
- Быстро усыплите неонатальную мышь P9-возраста путем обезглавливания с помощью операционных ножниц. Поместите тело усыпленной неонатальной мыши на стерильное операционное поле. Рассечение EBDS у 9-дневных новорожденных мышей (шаг 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная процедура рассечения дает любому ученому надлежащие инструменты для удаления EBDS у неонатальных и пожилых мышей. Чем старше мышь, тем легче подготовка.
2. Доступ к брюшной полости
- Обхватите кожу над расположением мочевого пузыря щипцами. Вырежьте отверстие диаметром 2 мм в кожу ножницами, не повреждая брюшину и нижележащие структуры. Разверните разрез до места обезглавливания, следуя левой передней подмышечной линии. Снимите кожу слева на правую сторону атравматическими щипцами.
- Возьмите в руки брюшину, окружающую селезенку. Осторожно поднимите его вверх, пока брюшина не станет похожа на шатровую структуру, и вырежьте отверстие диаметром 1 мм в центре. Подождите, пока «перитонеальная палатка» наполнится воздухом. Используйте 10-кратное микроскопическое увеличение для этого и следующих шагов.
- Отрежьте брюшину в окне, обрамленном нижними ребрами, как боковыми областями живота, так и областью нижнего мочевого пузыря, чтобы обеспечить полный доступ к печени, системе желчных протоков, желудку, тонкому кишечнику и толстой кишке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения доступа к печени может быть выполнен дополнительный разрез, удаляя три нижних ребра, оставляя мечевидный отросток, фальциформную связку, печень и структуры желчных протоков нетронутыми. Вид печени легко получить.
3. Обследование желчного пузыря и желчных протоков
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что образец должен оставаться влажным на регулярной основе в течение всех следующих этапов.
- Осторожно вытяните мечевидный отросток в черепно-вентральное положение, чтобы осмотреть желчный пузырь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение на фальциформной связке увеличивается с этим движением, и присоединенный желчный пузырь становится видимым.- Выполняйте лишь незначительное растяжение, чтобы избежать неконтролируемого разрыва фальциформной связки, что может привести к разрыву желчного пузыря из системы желчных протоков. Отпустите притяжение мечевидного процесса перед следующим шагом.
- Осторожно потяните вниз двенадцатиперстную кишку, чтобы освободить систему желчных протоков.
ПРИМЕЧАНИЕ: По мере увеличения напряжения на гепатодуоденальной связке становится видимой ткань желчного протока.
4. Эн-блок-резекция
- Выполните нижнюю блочную мобилизацию, выполнив следующие действия.
- Определите дуоденальный сосочек, который соединяет систему желчных протоков с двенадцатиперстной кишкой.
- Прорежьте двенадцатиперстную кишку примерно на 2 см от правой боковой стороны сосочка.
- Прорежьте пилорическую область. Убедитесь, что содержимое желудка присутствует в пилорической области между местом разреза и дуоденальным сососком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг для последующей безопасности ориентации для правильного расположения ротовой и аборальной дуоденальной частей.
- Выполните верхнюю ан-блок-мобилизацию.
- Осторожно потяните мечевидный отросток и получите доступ к фальциформной связке.
- Выполните разрез длиной 1 см через фальциформную связку, максимально приближенную к мечевидному отростку, между желчным пузырем и мечевидным отростком. Следите за тем, чтобы не повредить желчный пузырь.
- Прорежьте следующие соединительные структуры между печенью и грудной клеткой: пищевод, нижняя полая вена, грудная аорта, все связки, которые окружают голую область печени, и все дорсально оставшиеся тканевые соединения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец en-bloc полностью рассечен. Он содержит печень, систему желчных протоков и двенадцатиперстную кишку, которая связана с пилорической областью желудка.
5. Окончательное рассечение желчного пузыря и желчных протоков
- Выполните комплексную подготовку, выполнив следующие действия.
- Поместите образец en-bloc на пенопластовую прокладку, обычно используемую для обезвоживания. Используйте 20-кратное микроскопическое увеличение и два микрохирургических атравматических щипца с максимальным размером наконечника 6 мм для этого и следующих шагов.
- Соберите образец на поролоновой прокладке. Реорганизуйте образец в правильном анатомическом положении. Сгладить ротовую и аборальную часть двенадцатиперстной кишки, выполнив нежное движение.
- Начните движение в двенадцатиперстной кишке и продолжайте к режущим краям с помощью атравматических щипцов. Разгладьте белое пульповое содержимое желудка, которое будет возникать только в ротовой части двенадцатиперстной кишки. Убедитесь, что идентифицирована оральная и аборальная часть двенадцатиперстной кишки, чтобы исключить вероятное вращение желчных протоков.
- Отрежьте крупные остатки печеночной ткани, чтобы начать рассечение желчного протока.
- Выполните окончательную изоляцию.
- Аккуратно вдавите оставшуюся печеночную ткань в поры пенопластового мата. Убедитесь, что движения соскоба начинаются с системы желчных протоков и приводят к границам печени.
- Переместите образец в более чистое положение на пенопластовом коврике после нескольких скребковых движений в различных направлениях. Используйте преимущество менее сжатой ткани печени на заднем плане, чтобы оптимизировать вид для наилучшей возможной дифференциации между EBDS и нежелательными клетками. Соскоблите печеночную ткань из желчного протока до тех пор, пока ничего или как можно меньше от печеночной ткани не останется.
- Обрабатывайте гепатодуоденальную связку до тех пор, пока не останется изолированная EBDS. Удалите интралигаментозные кровеносные сосуды, такие как печеночная артерия, воротная вена и небольшие остатки. Удалите эту нежную нить, с легким натяжением и высоким уходом, с левой боковой стороны. Этот этап рассечения, возможно, уже начался непреднамеренно или частично завершен во время предварительного удаления печеночной ткани, что в конечном итоге приводит к тому же результату.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кровеносные сосуды проявляются в виде белой и очень нежной нити примерно в 3-5 мм перорально дуоденального сосочка и соединяются с гепатодуоденальной связкой с левой боковой стороны, накапливаясь с желчным протоком к глиссонианской триаде. По завершении этого этапа окончательный образец полностью изолируется. Если есть необходимость в записи, изображения могут быть получены после организации структур желчных протоков в их анатомическое положение (рисунок 1). Рекомендуется делать последние шаги подготовки на пенопластовом коврике, потому что образец не будет прилипать так сильно к поверхности рабочего поля. Если поры влажные, желчный проток левитирует или плавает. При перемещении образца он не будет прилипать так же прочно, как при подготовке на операционной ткани, что приводит к отсутствию разрыва при перемещении образца.
6. Подготовка к гистологическому анализу
- Поместите изолированный образец в буферный раствор, специальную среду или формалинсодержащие фиксаторы (см. Таблицу материалов) как можно скорее после рассечения.
- Выберите подходящее решение для хранения в зависимости от дальнейших запланированных этапов обработки.
ВНИМАНИЕ: Используйте формалинсодержащие фиксаторы только под вентиляционным отверстием из-за острой токсичности, коррозионной активности и различных опасностей для здоровья.
ПРИМЕЧАНИЕ: В представленном исследовании образцы EBDS были вставлены в параформальдегид, обезвожены и внедрены в парафин. Они хранятся при комнатной температуре и охлаждаются перед секционированием. В нагревательном шкафу 2 мкм ломтики хранились в течение ночи и окрашивались с использованием обычного гематоксилина и эозина4 (см. Таблицу материалов).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 1А показана EBDS новорожденного мыша, которая была рассечена с помощью описанной методики. Микроскопически больше печеночной ткани не видно. Печеночная ткань была удалена во время заключительных этапов выделения протокола и может быть легко отличима от ткани желчных протоков в отношении цвета и консистенции. На рисунке 1B показан изолированный образец в сравнении с миллиметровой шкалой. Длина EBD (измеряется от желчного пузыря до дуоденального сосочка...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой статье сообщалось и обсуждалось создание и валидация нового хирургического подхода к удалению EBDS усыпленных неонатальных мышей. Микроскопические и гистологические данные показывают, что подход быстро обнаруживает ЭБД и рассекает их вблизи краев протока, даже у неонатальных мышей. Для описываемого протокола требуются только хирургические инструменты и микроскоп с 20-кратным увеличением. Кроме того, этот подход позволяет изолировать всю EBDS. Техника очень эффективна, проста и проста в воспроизведении.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Авторы выражают признательность Йоханне Хагенс, Паулине Шупперт, Кларе Филиппи, доктору медицинских наук Кристиану Томушату, Свенье Варнке, доктору Диане Линднер, профессору доктору Дирку Вестерманну, Мириам Томчак, Николь Людер, Надин Курзаве, доктору рер нат. Лайе Пагеролс Ралуй, Биргит Аппль и Магдалене Трохимюк за их вклад. Ганс Христиан Шмидт получил финансовую поддержку от стипендии Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME (2021_EKPK.10), UKE, Гамбург.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-Пропанол | CHEMSOLUTE | 11365000 | используется в качестве обезвоживающего агента |
| 30 г канюли | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | канюля для гидратации образца |
| Вентиляционное отверстие | C + P Mö belsysteme GmbH & Co. KG, Брайденбах, Германия | Tec-Ononmic AZ 1200 | применение вентиляционного отверстия помогает избежать вдыхания формалинсодержащих фиксаторов |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Германия | 2351744 | физиологического раствора; Контейнер: Mini-Plasco connect, 20 x 10 мл, стерильный |
| Большие микрохирургические щипцы | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | прямой, 180 мм (7"), наконечник платформы, круглая ручка, ширина: 0,800 мм, покрытый алмазной пылью, нестерильный, многоразовый дополнительный инструмент для наблюдения и каждого этапа подготовки, кроме самой окончательной подготовки; Секущая кожа брюшины |
| Камера» SmartCAM 5" | Basler and Vision Engineering, Send, Россия | EVC131A | дополнительный модуль камеры Lynx Exo: тип сенсора: CMOS, разрешение 2560 x 1920 пикселей, размер сенсора: 1/2"; Используется для видеопроизводства и технической оценки |
| Дегидратационная машина/Тканевый процессор Citadel 2000 | Fisher Scientific GmbH, Шверте, Германия | 12612613 | используется для автоматического обезвоживания, короткая программа (ок. 4,8 ч). |
| Губка Carl Roth, Карлсруэ, Германия | TT56.1 | для заключительного этапа препарирования, также подходят другие губки/поролоновые подушечки с минимальным размером пор 60 пор на дюйм, рекомендуется использование двух поролоновых прокладок на одну встраиваемую кассету для покрытия образца снизу и сверху для предотвращения скольжения через перфорацию встраиваемых кассет | |
| Dulbecco´ s Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) | Gibco | 14190-144 | не вызывает острых проблем; t содержат кальций или магний, 500 мл |
| Встраиваемые кассеты | Engelbrecht GmbH, Edermü nde, Германия | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Бургдорф, Германия | 41-6660-00 | раствор для окрашивания, готовый к использованию |
| Тонкие ножницы CeramaCut | FST, Гейдельберг Германия | 14959-09 | Наконечники: Острый-Острый, Сплав / Материал: Нержавеющая сталь с керамическим покрытием, Зубчатый:, Да; Особенность: CeramaCut, Форма кончика: Прямой, Режущая кромка: 22 мм, Длина: 9 см; Разрез кожи, разрез брюшинного окна |
| Graefe Chipps | FST, Гейдельберг Германия | 11051-10 | Длина: 10 см, Форма наконечника: изогнутый, зубчатый, Ширина наконечника: 0.8 мм, Размеры наконечника: 0.8 x 0.7 мм, Сплав/Материал: Нержавеющая сталь |
| Гематоксилин | MEDITE Medical GmbH, Бургдорф, Германия | 41-5130-00 | раствор для окрашивания, готовый к использованию |
| высокорезоционный микроскоп | Vision Engineering, Отправить Великобритания | EVO503 | Способен к увеличению до 60-кратного увеличения, использовалось только 6-20-кратное увеличение |
| Микроскоп | Olympus Optical CO, Ltd., Гамбург, Германия | BX60F5 | |
| Чехол для микроскопа Glases | Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Германия | 101244 | шириной 60 мм, изготовлен из стекла SCHOTT D 263 |
| Микроскоп Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nuß loch, Германия | SM2010R | Инструмент для секционирования (2 & микро; m-slices) |
| Omnifix-F 1 мл шприц | B Braun, Мельзунген, Германия | 9161406V | шприц без канюли |
| Парафин | Sakura Finetec, Торранс, США | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, без машины |
| заделки парафина | ДМСО MEDITE MEDICAL GmbH, Бургдорф, Германия | TES 99 | Встраиваемая машина, использованная в этом исследовании, содержала следующие три отдельных модуля: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. Образец следует погружать в парафин сразу после обезвоживания, не следует проводить промежуточное хранение в холодильнике из-за возможной усадки и влаги в холодильнике |
| Параформальдегид (PFA) | Морфисто | 1176201000 | Приготовьте 1 мл аликвот в 2 мл конических пробирок Eppendorf для образцов печени и 0,5 мл аликвот в 1 мл конических пробирок Eppendorf для образцов внепеченочных желчных протоков, 4% в PBS ph 7.4 |
| Малые микрохирургические щипцы | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bü tthard, Bayern, Германия | (00)165 | Круглая ручка, прямая, наконечник 0,3 мм, инструмент для наблюдения и каждого этапа подготовки, особенно полезен при окончательной подготовке |
| Линейка из нержавеющей стали | Agntho's AB, Lidingö, Швеция | 30085-15 | 150 мм с метрической и Хирургические ножницы с дюймовой градуировкой |
| – Остро-тупой для обезглавливания | FST, Гейдельберг Германия | 14001-14 | Устройство для обезглавливания |
| Шкаф для подогрева | Haraeus, Hanau, Германия | T 6060 | нарезанные образцы должны храниться в шкафу для подогрева для обеспечения прикрепления образца к предметным стеклам микроскопа |
Ссылки
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369(2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621(2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226(2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
