Методическая статья

In Vitro Метод изучения половых различий в бокаловидных клетках конъюнктивы

DOI:

10.3791/64456

⸱

28 июля 2023 г.

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Среда, не содержащая фенола красного/фетального бычьего сыворотки, является лучшим вариантом, чем продвинутый RPMI, для элиминации экзогенных гормонов без изменения нормальной функции бокаловидных клеток конъюнктивы при изучении половых различий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синдром сухого глаза является многофакторным заболеванием, влияющим на здоровье глазной поверхности, с гораздо более высокой распространенностью среди женщин. Разрушение гелеобразующего муцина, который секретируется бокаловидными клетками конъюнктивы (CGC) на поверхности глаза, способствует возникновению множественных заболеваний глазной поверхности. Элиминация экзогенных половых гормонов имеет важное значение для получения устойчивых результатов при исследовании in vitro половых различий в CGC. В данной работе описан метод минимизации присутствия экзогенных гормонов при изучении половых различий в CGC при сохранении их физиологической функции. CGC от посмертных доноров обоих полов культивировали из кусочков конъюнктивы в среде RPMI с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (называемой полной средой) до слияния. Примерно за 48 ч до начала экспериментов CGC переводили в среду RPMI без фенолового красного или FBS, но с 1% BSA (так называемая среда без фенол-красного). Нормальную клеточную функцию изучали путем измерения увеличения внутриклеточного [Ca2+] ([Ca2+]i) после стимуляции карбахолом (Cch, 1 x 10-4 M) с помощью фура-2/ацетоксиметиловой (AM) микроскопии. Результат показывает, что CGC сохраняли нормальную функцию в средах, не содержащих фенол-красного, через 48 ч. Не было выявлено существенной разницы в ответе [Ca2+]i между средой RPMI, не содержащей фенолового красного, и полной средой при стимуляции Cch. Поэтому мы рекомендуем использовать свободную от фенола красную среду RPMI с 1% БСА для элиминации экзогенных гормонов без изменения нормальной функции CGC при исследовании половых различий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Половые различия влияют на множественные процессы глазной поверхности 1,2,3. Клиническим проявлением этих половых различий является разница в распространенности многих заболеваний глазной поверхности у мужчин и женщин, таких как сухость глаз и конъюнктивит 4,5,6. Фактические данные свидетельствуют о том, что половые различия возникают на нескольких биологических уровнях, включая различные профили генов на X- и Y-хромосомах7 и влияние гормонов8. Изучение молекулярных основ половых различий может обеспечить лучшее понимание болезней и, в конечном итоге, улучшить персонализированную медицину.

Глазная поверхность состоит из вышележащей слезной пленки, роговицы и конъюнктивы. Половые различия наблюдаются во многих компонентах глазной поверхности, включая слезную пленку 9,10, роговицу 11, слезную железу 12,13 и мейбомиевые железы, которые также выделяют слезы 12. В многочисленных механистических исследованиях изучалось влияние половых гормонов на роговицу и связанные с ней компоненты14,15; Тем не менее, мало что известно о половых различиях в конъюнктиве и ее бокаловидных клетках. Конъюнктива – это слизистая оболочка, которая покрывает склеру и внутреннюю поверхность века. Эпителий конъюнктивы состоит из неороговевающих, многослойных, слоистых плоскоклеточных клеток16.

Среди многослойных плоскоклеточных клеток конъюнктивы имеются бокаловидные клетки (CGC), вкрапленные на апикальной поверхности эпителия. Эти бокаловидные клетки характеризуются большим количеством секреторных гранул, расположенных на апикальном полюсе17. CGC синтезируют и секретируют гелеобразующий муцин MUC5AC для увлажнения глазной поверхности и смазывания ее во время моргания17. Секреция муцина жестко регулируется внутриклеточным [Ca2+] ([Ca2+]i) и активацией Ras-зависимой внеклеточной сигнально-регулируемой киназы (ERK1/2)18. Неспособность выделять муцин приводит к сухости глазной поверхности и последствиям патологических отклонений. Однако на воспаленной глазной поверхности обширная секреция муцина, стимулируемая медиаторами воспаления, приводит к восприятию липкости и зуда в глазах19. Эти состояния с нарушенной секрецией муцина в конечном итоге приведут к ухудшению состояния глазной поверхности.

Роль бокаловидных клеток как основного источника глазного муцина давно признана20, однако половые различия в регуляции муцина как при физиологических, так и при патологических состояниях остаются неоткрытыми. Система in vitro была бы полезна для мониторинга функции бокаловидных клеток без гормонального эффекта или с точно контролируемым уровнем половых гормонов. Несмотря на то, что сформировалась клеточная линия эпителия конъюнктивы 21, не существует бокаловиднойклеточной линии с функциональной секрецией муцина. Таким образом, мы модифицировали разработанную нами первичную культуру CGC человека, чтобы создать метод анализа половых различий in vitro16, и представили его следующим образом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вся человеческая ткань была передана в глазной банк с предварительного информированного согласия и разрешения донора для использования в научных исследованиях. Использование тканей конъюнктивы человека было рассмотрено Массачусетским комитетом по изучению глаз и ушей и определено как исключенное и не соответствующее определению исследований с участием людей.

1. Первичная культура бокаловидных клеток человека

  1. Из банка глаз получить ткань конъюнктивы человека16.
  2. Приготовьте питательную среду, питательную среду RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ глютамина, 2 мМ заменимых аминокислот (NEAA), 2 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина и 2 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновой кислоты (HEPES).
  3. Проведите первичную клеточную культуру, как описано ниже.
    1. Стерильным скальпелем измельчите ткань на3 кусочка размером 1 мм и выложите семена на культуральные планшеты в колпаке. Высевают по четыре штуки в каждую лунку 6-луночного планшета в 1 мл полной среды RPMI. Несмотря на то, что ориентация кусочка ткани не влияет на рост клеток, убедитесь, что кусочки прилегают к культуральной пластине, чтобы обеспечить рост с помощью лезвия скальпеля.
    2. Поместите кусочки ткани в инкубатор, содержащий 95% воздуха и 5%CO2 при температуре 37 °C. Обновляйте одну и ту же питательную среду через день до тех пор, пока бокаловидные клетки не достигнут 70%-80% слияния примерно через 14 дней. Снимите тканевую пробку примерно через 72 часа после посева.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителий конъюнктивы человека в основном содержит слоистые плоскоклеточные клетки и бокаловидные клетки. RPMI является селективной средой для бокаловиков. В редких случаях в культуре CGC у человека фибробласты могут расти примерно на 7-й день. Способ очистки культуры был описан в предыдущей публикации 22.
    3. Проверяют чистоту культуры ГХ с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (ИФМ), нацеленной на цитокератин (КФК)7 и лектин Helix pomatia-1 (HPA-1)22 в соответствии со стандартным методом ИФМ, описанным в19; Смотрите репрезентативные результаты.

2. Пассаж бокаловидных клеток конъюнктивы человека и экспериментальная подготовка

  1. Промойте клетки PBS (pH = 7,4) и отделите клетки с помощью трипсинизации с использованием 0,05% трипсина в 1x ЭДТА. Каждую минуту наблюдайте за клетками под микроскопом. После того, как клетки отделятся от дна, деактивируйте трипсин, используя полную среду RPMI.
  2. Центрифугируют клетки при 150 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируйте клеточные гранулы в полной питательной среде RPMI и пересадите в чашки для культивирования со стеклянным дном для измерения [Ca2+]i . Общий объем среды составляет 300 мкл на чашку. Держите носитель в центре стеклянной части блюда.
  3. Элиминация гормонов в питательных средах: питательная среда может содержать половые гормоны, особенно FBS. Поскольку феноловый краситель, содержащийся в RPMI-1640, обладает эстрогенной активностью 23,24, замените среду RPMI на среду RPMI, не содержащую фенолового красного, и отрегулируйте pH до 7,45 с помощью pH-полосок после приготовления полной среды. HEPES, содержащийся в полной среде, поддерживает pH в относительно небольшом диапазоне.

3. Анализ фура-2/ацетоксимил (АМ) для измерения [Ca2+]i

  1. Выполните загрузку Fura-2/AM, как описано ниже.
    1. Инкубируют клетки в чашках со стеклянным дном в течение 1 ч при температуре 37 °C, атмосфере окружающей среды и защищают от света бикарбонатным буфером Кребса-Рингера (KRB; содержащий 119 мМ NaCl, 4,8 мМ KCl, 1,0 мМ CaCl 2, 1,2 мМ MgSO4 и 25 мМ NaHCO3) с 0,5% HEPES (таблица 1), плюс 0,5% БСА, 0,5 мкМ фура-2/AM, 8 мкМ плуроновой кислоты F127 и 250 мкМ сульфинпиразона.
    2. Перед использованием отрегулируйте pH до 7,45 с помощью pH-метра. После загрузки фура-2/AM промыть ячейки KRB, содержащим 250 мкМ сульфинпиразона, непосредственно перед измерением [Ca2+]i .
  2. Выполните измерение [Ca2+]i , как описано ниже.
    1. Поместите чашки с клетками, загруженными фурой-2, под микроскоп, найдите репрезентативное поле, содержащее от 20 до 50 клеток, при 200-кратном увеличении и используйте функцию Freehand , чтобы нарисовать контур вокруг каждой ячейки, чтобы указать программному обеспечению, что является фоновой флуоресценцией, а что нет.
    2. Подождите, пока программное обеспечение автоматически вычтет фоновую флуоресценцию из измерения, и нажмите кнопку «Начать эксперимент ».
    3. Затем подождите от 8 до 15 с, чтобы установить базальный уровень кальция в клетках, прежде чем осторожно пипетировать интересующий агонист. Продолжайте измерение в течение не менее 120 с после добавления агониста или до тех пор, пока уровень кальция не вернется к исходному уровню.
  3. Выполните анализ данных, как описано ниже.
    1. Используйте изменение пика [Ca2+]i для представления действия стимулов. Рассчитайте средний базальный уровень кальция в каждой клетке за первые 8-15 секунд измерений. Если это число равно или превышает 500 нМ, удалите эту клетку из набора данных, так как она подвергается апоптозу или некрозу.
    2. После того, как базальный уровень каждой клетки будет рассчитан, вычтите это количество из максимального измеренного значения [Ca2+]i для той же клетки. Усредните изменение пика [Ca2+]I для всех клеток в данной чашке.
    3. Чтобы обеспечить согласованность, запишите ответы на каждый стимул в двух экземплярах и вычислите среднее значение изменений пика [Ca2+]i , полученное из дубликатов, как одну точку данных из индивидуальной выборки человека. Сравните данные из разных групп, используя соответствующий метод анализа данных, основанный на дизайне исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CGC человека в первичной культуре вырастают до 80% слияния примерно за 14 дней. Тип клеток подтверждали иммунофлуоресцентным окрашиванием антителами к маркерам бокаловидных клеток CK7 и HPA-125 (рис. 1). Несмотря на то, что удаление FBS из среды может устранить половые гормоны, недостаток FBS потенциально может повлиять на клеточный ответ. Для верификации метода элиминации гормонов в качестве стимула использовали холинергический агонист (карбахол, Cch 1 × 10-4

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение половых различий в тканях глаза помогает понять процессы заболеваний, особенно синдрома сухого глаза и аллергического конъюнктивита, которые непропорционально поражают один пол 4,5,6. Несмотря на то, что для этих исследований можно использовать животные модели, данные, полученные непосредственно из тканей человека, имеют важное значение из-за высочайшего сходства с человеческими клетками in vivo. Ткани конъюнкт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфликт интересов у авторов отсутствует.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа финансируется за счет гранта Национального института глаза EY019470 (D.A.D.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% трипсин с 1x EDTAGibco (Гранд-Айленд, Нью-Йорк)25300-054
4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтансульфоновая кислотаFisher Bioreagent (Питтсбург, Пенсильвания)BP310-500
Advanced RPMI mediaGibco (Гранд-Айленд, Нью-Йорк)12633020
карбахоломCayman Chemical (Анн-Арбор, Мичиган)144,86
Фетальная сыворотка БовинаНИР D (Миннеаполис, Миннесота)S11150H
Фура-2-ацетоксиметиловый эфир Thermo Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс, США)F1221
Ткань конъюнктивы человекаEversight Eye Bank (Анн-Арбор, Мичиган)Н/А
неорганическая соль для буфера KRBSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)Подойдет любая марка
с L-глютамином Lonza Group (Базель, Швейцария)17-605F
заменимые аминокислотыGibco (Гранд-Айленд, Нью-Йорк)11140-050
пенициллин/стрептомицинGibco (Гранд-Айленд, Нью-Йорк)15140-122
фенол без красных RPMI media Gibco (Гранд-Айленд, Нью-Йорк)11835055
Плуроновая кислота F127MilliporeSigma (Берлингтон, Массачусетс, США)P2443-250G
RPMI-1640 питательная средаGibco (Гранд-Айленд, Нью-Йорк)21875034
скальпельThermo Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс, США)12460451Любой стерильный хирургический скальпель может работать
пируват натрияGibco (Гранд-Айленд, Нью-Йорк)11360-070
сульфинпиразонMilliporeSigma (Берлингтон, Массачусетс, США)S9509-5G

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
  2. Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
  3. Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
  4. Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
  5. Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
  6. Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
  7. Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3(2020).
  8. Yang, J. -H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
  9. Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
  10. Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
  11. Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
  12. Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
  13. Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
  14. Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
  15. Suzuki, T., et al. Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
  16. Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
  17. Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
  18. Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
  19. Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
  20. Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
  21. García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220(2022).
  22. Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
  23. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
  24. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
  25. García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
  26. Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
  27. Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
  28. Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
  29. Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
  30. Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Conjunctival Goblet CellsSex Based DifferencesDry Eye DiseaseIntracellular Calcium MeasurementPrimary Cell CulturePhenol Red Free MediumMucin SecretionImmunofluorescent StainingCarbachol StimulationHuman Conjunctiva

Похожие статьи