Методическая статья

Микроинженерные 3D-коллагеновые гидрогели с выравниванием волокон на большом расстоянии

DOI:

10.3791/64457

⸱

7 сентября 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует использование микрофлюидного канала с изменяющейся геометрией вдоль направления потока жидкости для создания растяжения (растяжения) для выравнивания волокон в 3D-гидрогеле коллагена (толщина <250 мкм). Результирующее выравнивание простирается на несколько миллиметров и зависит от скорости деформации растяжения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выровненные волокна коллагена I (COL1) управляют подвижностью опухолевых клеток, влияют на морфологию эндотелиальных клеток, контролируют дифференцировку стволовых клеток и являются отличительной чертой тканей сердца и опорно-двигательного аппарата. Для изучения реакции клеток на выровненные микроокружения in vitro было разработано несколько протоколов для создания матриц COL1 с определенным выравниванием волокон, включая магнитные, механические, клеточные и микрофлюидные методы. Из них микрофлюидные подходы предлагают расширенные возможности, такие как точный контроль потоков жидкости и клеточного микроокружения. Однако микрофлюидные подходы к созданию выровненных матриц COL1 для передовых платформ культивирования in vitro были ограничены тонкими «матами» (толщиной <40 мкм) волокон COL1, которые простираются на расстояния менее 500 мкм и не способствуют применению 3D-клеточных культур. Здесь мы представляем протокол для изготовления 3D-матриц COL1 (толщиной 130-250 мкм) с областями миллиметрового масштаба с определенным выравниванием волокон в микрофлюидном устройстве. Эта платформа предоставляет расширенные возможности клеточных культур для моделирования структурированных микроокружений тканей, предоставляя прямой доступ к микроинженерной матрице для клеточной культуры.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки находятся в сложной 3D-волокнистой сети, называемой внеклеточным матриксом (ECM), основная часть которой состоит из структурного белка коллагена I типа (COL1)1,2. Биофизические свойства ECM обеспечивают направляющие сигналы клеткам, и в ответ клетки реконструируют микроархитектуру ECM 3,4,5. Эти взаимные взаимодействия между клетками и матрицами могут приводить к образованию выровненных волоконных доменов6 COL1, которые способствуют ангиогенезу и клеточной инвазии в опухолевой среде 7,8,9 и влияют на морфологию клеток 10,11,12, поляризацию 13 и дифференцировку 14. Выровненные коллагеновые волокна также способствуют заживлению ран 15, играют ключевую роль в развитии тканей 16 и способствуют межклеточной коммуникации на большом расстоянии17,18. Таким образом, репликация нативной микроархитектуры волокна COL1 in vitro является важным шагом на пути к разработке структурированных моделей для изучения реакции клеток на выровненные микросреды.

Микрофлюидные системы клеточных культур были установлены в качестве предпочтительной технологии для разработки микрофизиологических систем (MPS)19,20,21,22,23. Используя благоприятные микромасштабные эффекты масштабирования, эти системы обеспечивают точный контроль над потоками жидкости, поддерживают контролируемое введение механических сил и определяют биохимическое микроокружение в микроканале 21,24,25,26,27. Платформы МПС использовались для моделирования тканеспецифических микросред и изучения межорганных взаимодействий28. В то же время гидрогели были широко исследованы для повторения 3D-механики и биологического влияния ECM, которые наблюдаются in vivo29,30. С растущим акцентом на интеграцию 3D-культуры с микрофлюидными платформами многочисленные подходы могут комбинировать гидрогели COL1 в микрофлюидных устройствах31,32,33. Однако методы выравнивания гидрогелей COL1 в микрофлюидных каналах были ограничены тонкими 2D-«матами» (толщиной <40 мкм) в каналах шириной <1 мм, что дает ограниченный потенциал для моделирования клеточных реакций в выровненных 3D-микросредах31,34,35,36.

Для достижения выровненных 3D-гидрогелей COL1 в микрофлюидной системе было показано, что, когда самоорганизующийся раствор COL1 подвергается воздействию локальных экстенсиональных потоков (изменение скорости вдоль направления потока), полученные гидрогели COL1 демонстрируют степень выравнивания волокон, которая прямо пропорциональна величине скорости растяжения, которую они испытывают37, 38. Конструкция микроканала в этом протоколе уникальна по двум причинам; во-первых, сегментированная конструкция вносит локальную растяжительную деформацию в решение COL1, а во-вторых, его «двухкомпонентная» конструкция позволяет пользователю выровнять волокна COL1, а затем разобрать канал для прямого доступа к выровненным волокнам в открытом формате. Этот подход может быть в дальнейшем использован для разработки модульных микрофлюидных платформ, которые разрабатывают микрофизиологические системы с упорядоченными матрицами COL1. Следующий протокол описывает процесс изготовления сегментированных микроканалов и подробно описывает использование каналов для выравнивания коровьего атело COL1. Этот протокол также содержит инструкции по культивированию клеток на COL1 в формате открытой скважины и обсуждает добавление функциональности к платформе с использованием модульного магнитного базового слоя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление двухсекционного швеллера и модульной платформы

ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидный канал построен с использованием двух частей — микрофлюидного канала «вырез», который вырезан бритвой из листа полидиметилсилоксана (PDMS) определенной толщины, и крышки канала, которая обратимо связывается с вырезом и образует канал. Канал окружен каркасом из полиметилметакрилата (ПММА), который будет действовать как резервуар среды (рис. 1). Рама из ПММА также может использоваться для магнитной фиксации специализированных модулей для дополнительной функциональности.

  1. Каналы для резки бритвы из листов PDMS:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция микрофлюидного канала для этого этапа представлена на дополнительном рисунке 1. Канал состоит из пяти сегментов длиной 5 мм каждый и шириной 10 мм, 5 мм, 2,5 мм, 1,25 мм и 0,75 мм. Скорость раствора коллагена, вводимого с постоянной скоростью потока (50-400 мкл · мин-1), локально увеличивается вдоль канала по мере уменьшения ширины канала для создания экстенсионального потока.
    1. Установите лист PDMS толщиной 250 мкм на пластиковый несущий лист и нарежьте микрофлюидную конструкцию бритвой с помощью резака для рукоделия с глубиной лезвия 0,5 мм, скоростью 1 см·с−1 и высокой силой.
    2. С помощью ультразвуковой ванны очистите вырезы микрофлюидных каналов в течение 5 минут. Промойте ультразвуковые каналы в деионизированной (DI) воде и высушите их на чистой конфорке при температуре 100 ° C в течение 5 минут.
    3. Храните каналы в чистой, закрытой чашке Петри до использования.
  2. Изготовление покрытия PDMS и пассивации поверхности:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для выреза канала из раздела 1.1 требуется крышка, которая может быть помещена поверх него, чтобы создать закрытый канал, в который можно вводить раствор COL1 (дополнительный рисунок 1). Крышку можно снять после самостоятельной сборки COL1. Чтобы свести к минимуму вероятность связывания COL1 в канале с оболочкой, оболочку пассивируют с помощью бычьего сывороточного альбумина (BSA). Предусмотрена конструкция пресс-формы для крышки PDMS. Форма должна быть толщиной не менее 2 мм и иметь посадочную площадь, равную площади выреза микрофлюидного канала. В этом протоколе след пресс-формы составлял 35 мм x 15 мм.
    1. Чтобы подготовить форму, прикрепите лист чувствительного к давлению клея (PSA) к листу ПММА толщиной 2,5 мм и вырежьте лазером желаемую форму формы.
    2. Очистите форму из ПММА, вырезанную лазером, влажной безворсовой салфеткой и снимите подложку с пленки PSA. Прикрепите форму к силиконовой пластине диаметром 100 мм, плотно прижимаясь.
    3. Подготовьте PDMS в соотношении 10:1 (основание: сшивающий агент). Энергично перемешивайте в течение 1 мин, чтобы обеспечить правильное перемешивание, и дегазируйте смесь в вакуумной камере для удаления пузырьков воздуха.
    4. Вылейте дегазированный раствор PDMS в форму из ПММА/кремния и отверждайте на конфорке при 100 °C в течение 20 минут. Дайте форме остыть, удалите отвержденный PDMS и обрежьте излишки лезвием бритвы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что стороны силиконовой пластины (плоские стороны) крышек PDMS обращены вверх на протяжении всех следующих шагов.
    5. Используйте пуансон для биопсии диаметром 1 мм для создания входных и выходных отверстий, соответствующих концам микрофлюидного канала. Вырез канала из шага 1.1 можно использовать в качестве шаблона для определения положения отверстий.
    6. Обработайте крышку изопропанолом (IPA) в течение 5 минут, промойте деионизированной водой, высушите с помощью источника сжатого воздуха, а затем храните в чистой, закрытой чашке Петри. Поместите чашку Петри в камеру УФ-стерилизации (без крышки) на 1 минуту для стерилизации.
    7. Накройте крышкой и перенесите в шкаф биобезопасности (BSC).
    8. Пипетка 300 мкл 40 мг • мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1x фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) на крышки PDMS и равномерно распределите раствор с помощью наконечника пипетки. Перед употреблением поместить в холодильник при температуре 4 °C не менее чем на 4 часа.
    9. Переместите крышки из холодильника в BSC, вымойте 5 раз с помощью 1x PBS и дайте им высохнуть на воздухе в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крышки PDMS можно хранить в холодильнике до 1 недели после покрытия BSA.
  3. Глутаровый альдегид обработки покровных стекол
    ПРИМЕЧАНИЕ: Функционализация покровных стекол глутаровым альдегидом ковалентно связывает COL1 с покровным стеклом и предотвращает отслоение гидрогеля.
    1. Приготовьте 2% (об./об.) раствор аминопропилтриэтоксисилана (APTES) в стеклянном стакане, добавив 1 мл APTES к 49 мл ацетона.
    2. Разбавьте 25% раствор глутарового альдегида до 5% в деионизированной воде. Сделайте 2 мл раствора на каждое покровное стекло размером 24 мм x 50 мм. Для покровных стекол размером 24 мм x 24 мм или 22 мм x 22 мм сделайте по 1 мл раствора для каждого.
    3. Очистите покровные стекла в ультразвуковом аппарате для ванны в течение 5 минут, используя IPA. Смойте IPA с покровных стекол водой DI. IPA полностью промывается, когда на покровном стекле видна гладкая пленка воды.
    4. Высушите покровные стекла на конфорке в течение 5 минут при температуре 100 °C. Поместите высушенные покровные стекла в чистые чашки Петри, следя за тем, чтобы они не перекрывались.
    5. Используя трубку для коронного разряда, подвергните покровные стекла коронному разряду в течение 1 минуты каждое.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует выполнять в хорошо проветриваемом помещении или химическом колпаке.
    6. Снимите покровные стекла с чашки Петри, а затем погрузите в раствор APTES на 10 с в течение 5 минут после воздействия короны, убедившись, что покровное стекло погружено в воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно следите за тем, какая сторона была обработана плазмой, и держите ее обращенной вверх.
    7. Затем погрузите покровное стекло в ацетон на 10 с и высушите сжатым воздухом. Поместите сухое покровное стекло обратно в чашку Петри обработанной стороной вверх.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаги 1.3.5-1.3.7 для всех покровных листов.
    8. Пипеткой нанесите 1 мл раствора глутарового альдегида на поверхность каждого покровного стекла. Покройте как можно большую поверхность, не допуская, чтобы раствор переливался через край покровного стекла. При необходимости можно добавить больше раствора глутарового альдегида. Следите за тем, чтобы не поцарапать поверхность наконечником пипетки.
    9. Оставьте покровные стекла на контакт с раствором в течение 30 минут, а затем промойте деионизированной водой в течение 20 с. Высушите покровные стекла сжатым воздухом и поместите их обратно в чашки Петри плазменной обработкой стороной вверх.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покровные стекла можно хранить до 1 недели при комнатной температуре (RT).
  4. Лазерная резка модульной магнитной основы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция модульного магнитного основания представлена на дополнительном рисунке 1. Модульное основание служит колодцем для удержания носителей, а также может использоваться для магнитного крепления специализированных модулей, как описано в ранее опубликованных работах 22,37,38,39.
    1. Вырежьте рисунки из слоя ПММА, используя соответствующие настройки лазера, такие как количество проходов и мощность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки лазера должны быть отрегулированы таким образом, чтобы магниты можно было прижать к слою ПММА. Каждый лазер индивидуален, и параметры резки должны быть оптимизированы экспериментально. Для лазера мощностью 45 Вт рекомендуется 100% скорость, 100% мощность и 3 прохода для резки ПММА толщиной от 2 мм до 2 мм.
    2. Вымойте вырезанную лазером деталь водой с мылом, чтобы удалить мусор от процесса лазерной резки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте растворители для очистки деталей, вырезанных лазером. Растворители могут привести к распространению микротрещин на краях, вырезанных лазером.
  5. Сборка платформы
    1. Вставьте магниты (3/16 в диаметре, 1/16 в толщину) вручную в основание, вырезанное лазером. Мягкий молоток или конец отвертки можно использовать, чтобы помочь вдавить магнит. Толщина магнитов должна быть меньше толщины основания из ПММА, чтобы магниты находились на одном уровне с поверхностью основания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Магниты позволяют пользователю добавить функциональность платформе, прикрепив дополнительные модули.
    2. Снимите подложку с листа PSA и прикрепите основание к обработанному глутаровым альдегидом покровному стеклу функциональной стороной вверх.
    3. Аккуратно поместите вырез канала PDMS в полость, определенную рамой. Надавите пинцетом с широким наконечником, чтобы удалить пузырьки воздуха и обеспечить конформный контакт.
    4. Поместите крышку канала, обработанную BSA, поверх выреза канала стороной BSA вниз. Убедитесь, что впускные и выпускные отверстия для жидкости совмещены с каналом.
    5. Устройство готово к инъекции COL1.

2. Впрыскивание раствора COL1 в микроканал и снятие крышки для клеточных культур

  1. Приготовление раствора COL1
    1. Поместите все необходимые реагенты (исходный раствор COL1 [6 мг·мл-1], сверхчистая вода, 10x PBS, 0,1 М NaOH) на лед в шкафу биобезопасности.
    2. Рассчитайте объем реагентов следующим образом
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
      figure-protocol-3
      figure-protocol-4
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следовательно, чтобы получить 1 мл 2,5 мг · мл 1 нейтрализованного коллагена из 6 мг · мл - 1 запаса, добавьте 416,67 мкл коллагена, 429,16 мкл деионизированной воды, 100 мкл 10x PBS и 54,16 мкл 0,1 М NaOH для конечного pH 7. Добавьте 20 мкл 0,1 М NaOH для достижения рН 9,0.
    3. Добавьте реагенты в пустой флакон объемом 5 мл в следующем порядке: i) запас COL1, ii) деионизированная вода, iii) 10x PBS, iv) 0,1 М NaOH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вытесняющую пипетку для обработки раствора COL1. При использовании обычной пипетки может произойти значительная потеря образца, что приведет к колебаниям концентрации конечного раствора.
    4. Поднимите рН раствора до желаемого рН (обычно в пределах 7-9).
  2. Впрыскивание раствора COL1
    1. Поместите шприцевой насос, охлажденный стерильный шприц, охлажденный нейтрализованный раствор COL1 и стерильную иглу Luer с угловым наконечником 20 G 90° в шкаф биобезопасности. Загрузите раствор COL1 в шприц, стараясь избежать появления пузырьков.
    2. Прикрепите наконечник иглы 90° 20 G к шприцу, загрузите шприц в шприцевой насос иглой лицевой стороной вниз и заправьте иглу раствором COL1.
    3. Установите шприцевой насос на требуемую скорость потока, в пределах 50-2,000 мкл / мин.
    4. Поместите подготовленные каналы PDMS (раздел 1) на лабораторный домкрат и выровняйте с иглой.
    5. Вставьте иглу во входное отверстие канала PDMS (широкая сторона). Вводите канал до тех пор, пока капля COL1 ~ 30 мкл не соберется на выходной стороне.
    6. Опустите лабораторный домкрат и аккуратно отделите иглу от только что заполненного канала.
    7. Повторяйте шаги 2.2.5-2.2.9 до тех пор, пока все каналы не будут заполнены раствором COL1.
    8. Загрузите заполненные каналы в чашки Петри вместе с чистой безворсовой салфеткой, пропитанной деионизированной водой, чтобы предотвратить обезвоживание вновь образованного геля COL1.
    9. Накройте чашку Петри крышкой и поместите загруженные каналы в инкубатор (37 °C, влажность 95%) на 2 часа перед этапом отслаивания.
  3. Отслаивание и уравновешивание среды
    1. Обнажьте полимеризованный гель COL1, сняв крышку PDMS с помощью пинцета. Обработка BSA предотвращает прикрепление COL1 к крышке.
    2. Добавьте в лунку 650 мкл EGM.
    3. Оставьте устройства в инкубаторе (37 °C, влажность 95%) минимум на 4 часа, чтобы сбалансировать гель и среду. Замените носитель перед посевом в ячейки
  4. Посевные ячейки
    1. Поместите теплый 0,25% трипсин и питательные среды вместе с необходимым количеством пипеток по 5 мл и 10 мл в шкаф биобезопасности.
    2. Культивирование эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) до 80% слияния в эндотелиальных питательных средах (EGM) при 37 °C, влажности 95%. Поместите колбу для культивирования тканей, содержащую HUVEC, в BSC после проверки слияния под микроскопом.
    3. Выбросьте носитель в колбу T25 и промойте ячейки 2 раза с помощью 1x PBS. Добавьте 1 мл трипсина в колбу и поместите ее в инкубатор (37 ° C, влажность 95%) на 3 мин.
    4. Проверьте колбу под микроскопом через 3 мин, чтобы убедиться, что клетки полностью отделены от поверхности.
    5. Добавьте 3 мл EGM (с сывороткой) в колбу для нейтрализации трипсина. Затем переведите клеточный раствор с помощью пипетки объемом 5 мл в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугу конической пробирки, содержащей ячейки в 150 x g в течение 5 мин.
    6. Поместите коническую трубку в шкаф биобезопасности и выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Ресуспендируют клетки в 1 мл свежих питательных сред.
    7. Добавьте и смешайте 15 мкл трипанового синего и 15 мкл ресуспендированного клеточного раствора в конической пробирке объемом 1 мл.
    8. Введите трипановый синий и клеточный раствор с обеих сторон предметного стекла для подсчета клеток и вставьте предметное стекло в устройство для подсчета клеток.
    9. Разбавьте клеточный раствор в эндотелиальных питательных средах до требуемой концентрации, основанной на концентрации клеток, полученной из устройства для подсчета клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колба T25 с HUVEC при 80% слиянии даст ~ 750 000 клеток · мл-1 при разведении в 1 мл среды. Объем клеточной суспензии, подлежащей высеванию, рассчитывается как площадь поверхности культуры × плотность клеток/концентрация клеточной суспензии. Пример: Чтобы посеять 20 000 клеток·см-2 в лунку размером 35 мм x 15 мм, потребуется ~ 140 мкл клеточной суспензии.
    10. Аспирируйте носитель на сконструированную матрицу COL1.
    11. Добавьте необходимый объем клеточного раствора на субстрат COL1 и дайте клеткам отстояться в течение как минимум 4 часов перед визуализацией.
  5. Маркировка клеточного ядра и цитоскелета
    1. Аспирируйте носитель из ячеек и промывайте 3 раза с 1x PBS, 500 мкл в каждой стирке. Покройте клеточный слой 4% параформальдегидом в течение 15 минут при RT.
    2. Аспирируйте параформальдегид и промойте 1x PBS Tween-20 в течение 5 мин.
    3. Проникают в клеточную мембрану, используя 500 мкл 0,1% раствора Triton-X в PBS в течение 15 мин. Стирайте с 1x PBS Tween-20 в течение 5 минут.
    4. Блокировать неспецифические сайты связывания с 500 мкл 4% BSA в PBS в течение 30 мин при ЛТ.
    5. Разбавьте раствор флуоресцентной метки фаллоидин-актина в 4% BSA (1 мкл запаса в 400 мкл BSA).
    6. Аспирируйте раствор BSA, добавьте раствор фаллоидина в клетки и подождите 30 минут при ЛТ.
    7. Разбавьте ядерное окрашивание в 4% BSA (1 мкл в 500 мкл), аспирируйте фаллоидин, добавьте рабочий раствор ядерного пятна и подождите 15 минут при RT.
    8. Аспирируйте рабочий раствор ядерного пятна, промойте PBS Tween-20 3 раза по 5 минут каждый и замените его 1x PBS перед визуализацией.
    9. Изображение с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с использованием канала FITC (ex 491 нм/em 516 нм) и канала DAPI (ex 360 нм/em 460 нм) с 40-кратным объективом. Визуализируйте коллаген с помощью лазерного сканирующего конфокального изображения в режиме отражения с использованием лазерной линии 488 нм (мощность 15%) и объектива с 40-кратным погружением в воду.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Когда самоорганизующийся раствор COL1 течет через канал с уменьшающейся площадью поперечного сечения, скорость потока (v x) раствора COL1 локально увеличивается на величину ∂v x по длине сужения между двумя сегментами (∂x), что приводит к скорости деформации растяжения (ε̇), где ε̇ = ∂v x/∂x. Скорость деформации растяжения может быть рассчитана на основе скорости жидкости, которая измеряется с помощью скорости изображения частиц (PIV), как показано на рисунке 2

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколы генерации матриц COL1 с выровненными волокнами были описаны с использованием магнитных методов, прямого применения механической деформации и микрофлюидных методов47. Микрофлюидные подходы обычно используются для создания микрофизиологических систем из-за их четко определенных характеристик потока и переноса, которые позволяют точно контролировать биохимическую микросреду. Поскольку выровненные волокна COL1 обеспечивают ключевые инструктивные сигналы во время патофизиологических процессов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения под номером R21GM143658 и Национальным научным фондом под номером 2150798. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения финансирующих агентств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(3-Аминопропил)триэтоксисилан, 99% (APTES)Sigma Aldrich440140-100ML
20 калибр Серия IT Угловой дозирующий наконечникJensen GlobalJG-20-1.0-90
3/16" диаметр x 1/16" толщина никелированный магнитKJ MagneticsD31
3M (TC) 12X12-6-467MPDigiKey3M9726-ND
АЦЕТОН ACS РЕАГЕНТ ≥ 99,5%Signa Aldrich179124-4L
ЛАБОРАТОРНЫЙ CORONA TREATERElectro-Technic Products12051A
Бычья сыворотка Альбумин (BSA), фракция V, 98%, Реагент Класс, Alfa AesarVWRAAJ64100-09
Прозрачный литой акриловый листMcMaster-Carr8560K181
Corning 100 мл трипсина 10x, 2,5% трипсина в HBSS [-] кальций, магний, фенол красный, свиной парвовирус протестированVWR45000-666
Countess II Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
программное обеспечение CT-FIRE LOCI- Университет Висконсина
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 млLonzaCC-3162
Глутаральдегид 50% в водном растворе, Реагент Класс, Упаковка = Флакон из полиэтилена высокой плотности, Размер = 100 млVWRVWRV0875-100 мл
Graphtec CELITE-50GraphtecCE LITE-50
HEPES (1 М)Thermo Fisher Scientific15-630-080
Силиконовый каучук высокой чистоты .010" Толщина, 6" x 8" Лист, 55А ДюрометрMcMaster-Carr87315K62
Эндотелиальные клетки пупочной вены человекаThermo Fisher ScientificC0035C
Invitrogen  Трипан синее пятно (0,4%)Thermo Fisher ScientificT10282
ИзопропанолFisher ScientificA4154
Лазерный резакполного спектра20x12 H-series
Microfluidics Шприцевой насосNew Era Шприцевые насосыNE-1002X
Microman E Одноканальный пипеттор, Gilson, модель M1000EGilsonFD10006
Молекулярные зонды Alexa Fluor 488 ФаллоидинThermo Fisher ScientificA12379
Молекулярные зонды Hoechst 33342, тригидрохлорид, тригидратThermo Fisher ScientificH3570
Nutragen Bovine Atelo CollagenAdvanced BioMatrix5010-50ML
Pbs (10x), pH 7,4VWR70011044,00
PBS pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010049.00
Фосфатно-солевой буфер (PBS, 10x), с Triton X-100Alfa AesarJ63521
Сменный несущий лист для графтекового крафта ROBO CC330L-20USCUTTERGRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Пластиковый шприц 1 мл Luer SlipRestek22766.00
Силиконовая пластинаУниверситетская пластина452
Гидроксид натрия, ACS, упаковка = поли флакон, размер = 500 гVWRBDH9292-500 г
Sylgard 184VWR102092-312
Thermo Scientific  Пирс 20x PBS Твин 20Thermo Fisher Scientific28352.00
BD-20AC

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
  3. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  4. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  5. Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (12), 005058(2011).
  6. Piotrowski-Daspit, A. S., Nerger, B. A., Wolf, A. E., Sundaresan, S., Nelson, C. M. Dynamics of tissue-induced alignment of fibrous extracellular matrix. Biophysical Journal. 113 (3), 702-713 (2017).
  7. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38(2006).
  8. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 11(2008).
  9. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  10. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  11. Gruschwitz, R., et al. Alignment and cell-matrix interactions of human corneal endothelial cells on nanostructured collagen type I matrices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (12), 6303-6310 (2010).
  12. Wang, W. Y., et al. Extracellular matrix alignment dictates the organization of focal adhesions and directs uniaxial cell migration. APL Bioengineering. 2 (4), 046107(2018).
  13. Wang, W. Y., Lin, D., Jarman, E. H., Polacheck, W. J., Baker, B. M. Functional angiogenesis requires microenvironmental cues balancing endothelial cell migration and proliferation. Lab on a Chip. 20 (6), 1153-1166 (2020).
  14. Lanfer, B. The growth and differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells cultured on aligned collagen matrices. Biomaterials. 30 (30), 5950-5958 (2009).
  15. Brauer, E., et al. Collagen fibrils mechanically contribute to tissue contraction in an in vitro wound healing scenario. Advanced Science. 6 (9), 1801780(2019).
  16. Ingber, D. E. From mechanobiology to developmentally inspired engineering. PhilosophicalTransactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1759), 20170323(2018).
  17. Wang, H., Abhilash, A. S., Chen, C. S., Wells, R. G., Shenoy, V. B. Long-range force transmission in fibrous matrices enabled by tension-driven alignment of fibers. Biophysical Journal. 107 (11), 2592-2603 (2014).
  18. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical Journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  19. Ahadian, S., et al. Organ-on-a-chip platforms: A convergence of advanced materials, cells, and microscale technologies. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), 1700506(2018).
  20. Hou, X., et al. Interplay between materials and microfluidics. Nature Reviews Materials. 2 (5), 17016(2017).
  21. Abhyankar, V. V., et al. A platform for assessing chemotactic migration within a spatiotemporally defined 3D microenvironment. Lab on a Chip. 8 (9), 1507-1515 (2008).
  22. Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A reversibly sealed, easy access, modular (SEAM) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLoS One. 11 (5), 0156341(2016).
  23. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360(2019).
  24. Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12, 10769(2022).
  25. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a Chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
  26. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  27. Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015(2018).
  28. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Physical Chemistry. 1, 423-449 (2008).
  29. Ma, Y., et al. Viscoelastic cell microenvironment: Hydrogel-based strategy for recapitulating dynamic ECM mechanics. Advanced Functional Materials. 31 (24), 2100848(2021).
  30. Ma, Y., et al. 3D spatiotemporal mechanical microenvironment: A hydrogel-based platform for guiding stem cell fate. Advanced Materials. 30 (49), 1705911(2018).
  31. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomedical Microdevices. 8 (1), 35-41 (2006).
  32. Del Amo, C., Borau, C., Movilla, N., Asín, J., García-Aznar, J. M. Quantifying 3D chemotaxis in microfluidic-based chips with step gradients of collagen hydrogel concentrations. Integrative Biology. 9 (4), 339-349 (2017).
  33. Shi, N., et al. A 3D, magnetically actuated, aligned collagen fiber hydrogel platform recapitulates physical microenvironment of myoblasts for enhancing myogenesis. Small Methods. 5 (6), 2100276(2021).
  34. Lanfer, B., et al. Aligned fibrillar collagen matrices obtained by shear flow deposition. Biomaterials. 29 (28), 3888-3895 (2008).
  35. Saeidi, N., Sander, E. A., Ruberti, J. W. Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials. 30 (34), 6581-6592 (2009).
  36. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomaterialia. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  37. Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186(2021).
  38. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019(2022).
  39. Mansouri, M., et al. The modular µSiM reconfigured: Integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. , (2022).
  40. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: a potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  41. Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools. Journal of Visualized Experiments. (165), e61931(2020).
  42. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28(2014).
  43. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007(2014).
  44. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology. 8 (8), 821-835 (2016).
  45. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  46. Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), 1112-1124 (2021).
  47. Mohammadi, H., Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Lateral boundary mechanosensing by adherent cells in a collagen gel system. Biomaterials. 35 (4), 1138-1149 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Microfluidic Device3D Cell CultureCollagen I MatrixTumor MicroenvironmentEndothelial CellsPDMS ChannelMagnetic AlignmentCell Motility

Похожие статьи