Method Article

Оценка целостности контрольной точки сборки шпинделя в ооцитах мыши

DOI:

10.3791/64459

⸱

September 13th, 2022

 ,  , 
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ошибка в сегрегации хромосом является общей чертой в ооцитах. Поэтому изучение контрольной точки сборки веретена дает важные подсказки о механизмах, необходимых для производства здоровых яиц. Настоящий протокол описывает три дополнительных анализа для оценки целостности контрольных точек сборки веретена в ооцитах мыши.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анеуплоидия является ведущей генетической аномалией, вызывающей ранний выкидыш и неудачу беременности у людей. Большинство ошибок в сегрегации хромосом, которые приводят к анеуплоидии, происходят во время мейоза в ооцитах, но почему мейоз ооцитов подвержен ошибкам, до сих пор не до конца понятно. Во время деления клеток клетки предотвращают ошибки в сегрегации хромосом, активируя контрольную точку сборки веретена (SAC). Этот механизм управления основан на обнаружении кинетохорных (КТ)-микротрубочек (МТ) креплений и зондировании напряжения, создаваемого волокнами шпинделя. Когда КТ не прикреплены, SAC активируется и предотвращает прогрессирование клеточного цикла. SAC активируется сначала киназой MPS1, которая запускает набор и формирование комплекса митотических контрольных точек (MCC), состоящего из MAD1, MAD2, BUB3 и BUBR1. Затем MCC диффундирует в цитоплазму и изолирует CDC20, активатор анафаз-стимулирующего комплекса/ циклосомы (APC / C). Как только KTs прикрепляются к микротрубочкам и хромосомы выравниваются на метафазной пластине, SAC заглушается, CDC20 высвобождается, а APC / C активируется, вызывая деградацию циклина B и Securin, тем самым позволяя анафазному началу. По сравнению с соматическими клетками, SAC в ооцитах не так эффективен, потому что клетки могут подвергаться анафазе, несмотря на наличие неприкрепленных КТ. Понимание того, почему SAC является более разрешительным и является ли эта разрешительность одной из причин ошибок сегрегации хромосом в ооцитах, все еще нуждается в дальнейшем изучении. Настоящий протокол описывает три метода всесторонней оценки целостности SAC в ооцитах мыши. Эти методы включают использование нокодазола для деполимеризации МТ для оценки реакции SAC, отслеживание глушения SAC путем отслеживания кинетики разрушения Securin и оценку набора MAD2 в KTs путем иммунофлуоресценции. Вместе эти методы исследуют механизмы, необходимые для производства здоровых яйцеклеток, обеспечивая полную оценку целостности SAC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анеуплоидия, которая возникает из-за ошибок в сегрегации хромосом, является основной причиной ранних выкидышей и тесно связана с ошибками в мейозе1. Мейоз отличается от митоза тем, что он состоит из двух раундов деления клеток без промежуточного этапа репликации ДНК. При мейозе I гомологичные хромосомы разделяются, в то время как сестринские хроматиды остаются вместе. В ооцитах этот этап подвержен ошибкам, что приводит к производству анеуплоидных яиц2.

Чтобы предотвратить ошибки сегрегации хромосом, большинство типов клеток активируют механизм наблюдения, который приостанавливает клеточный цик....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все мыши, используемые в этих протоколах, были размещены и выращены в соответствии с руководящими принципами Комитета по институциональному использованию и уходу за животными Университета Рутгерса (Протокол 201702497) и Национальными институтами здравоохранения. Эти регулирующие органы одобрили все экспериментальные процедуры, связанные с исследованиями на животных. Все мыши, использованные в настоящем исследовании, были 6-8-недельными самками CF-1.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Прежде чем начать оценку SAC, соберите мышиные ооциты в соответствии с ранее опубликованным отчетом12. Разделит....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка чувствительности SAC при лечении нокодазолом
Целью данного эксперимента является оценка активации и силы SAC. При использовании нокодазола для деполимеризации микротрубочек веретена все кинетохоры будут не прикреплены, что вызовет остановку клеточного цикла, опосредованную SAC. В настоящей системе визуализации контрольные ооциты, обработанные ДМСО, экструдировали полярное тело примерно через 14 ч после высвобождения из милринона (рисунок 1, верхние панели). В соотв.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Контрольная точка сборки веретена является критическим механизмом управления во время деления клеток, предназначенным для предотвращения ошибок сегрегации хромосом. Это позволяет ячейке иметь достаточно времени для исправления неправильных насадок KT-MT. Мейоз в ооцитах является подверженным ошибкам процессом, при котором большая часть неправильного разделения хромосом происходит во время мейоза I, что приводит к генерации анеуплоидных яйцеклеток, которые являются основной причиной ранних выкидыше.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов для раскрытия.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование этого проекта было предоставлено Национальными институтами здравоохранения (R35GM136340 to KS).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Бычий сывороточный альбумин (БСА)SigmaA4503
DAPILife TechnologiesD1306
Диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaD5879
Осел-анти-кролик-Alexa-568Life TechnologiesA10042
EVOS FL Автоматическая система визуализацииLife TechnologiesФлуоресцентный микроскоп
EVOS Onstage ИнкубаторLife TechnologiesКамера инкубатора
Стеклянное дно 96-луночные пластины N 1.5 без покрытияMatTek CorporationP96G-1.5-5-F
коза-анти-человек-Alexa-633Life TechnologiesA21091
HEPESSigmaH3537
Антитела человека против ACAIncorporated15-234Разведение 1/30
ImageJNIH
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Leica SP8 оснащен объективом погружения в масло 63&3&1.40 NALeica
MgSO4· 7H20SigmaM7774
MilrinoneSigmaM4659
Na2HPO4SigmaS2429
NaClSigmaS5886
NaN3SigmaS2002
NocodazoleSigmaM1404
Параформальгид (PFA)SigmaP6148
PIPESSigmaP6757
Rabbit anti-MAD2Biolegend924601разведение 1/1000; ранее Covance #PRB-452C
ReversineCayman Chemical10004412
Triton-XSigma274348
Tween-20SigmaX100
VectashieldVector laboratoriesH-1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spindle Assembly CheckpointMouse OocytesChromosome SegregationAneuploidy MechanismsSAC IntegrityLive ImagingImmunofluorescence AnalysisSecurin DegradationMAD2 RecruitmentConfocal Microscopy

Related Articles