Моделирование развития мозжечка человека in vitro в 2D структуре

Deniz A. Madencioglu; Karina A. Kruth; Thomas H. Wassink; Vincent A. Magnotta; John A. Wemmie; Aislinn J. Williams

doi:10.3791/64462

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Моделирование развития мозжечка человека in vitro в 2D структуре

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64462

⸱

16 сентября 2022 г.

Deniz A. Madencioglu¹^,³^,⁴^,⁵ , Karina A. Kruth¹^,³^,⁴^,⁵ , Thomas H. Wassink¹^,³ , Vincent A. Magnotta¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , John A. Wemmie¹^,³^,⁴^,⁵ , Aislinn J. Williams¹^,³^,⁴^,⁵

¹Department of Psychiatry, University of Iowa, ²Department of Radiology, University of Iowa, ³Carver College of Medicine, University of Iowa, ⁴Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, ⁵Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол объясняет генерацию 2D-монослоя мозжечковых клеток из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для исследования ранних стадий развития мозжечка.

Аннотация

Точное и своевременное развитие мозжечка имеет решающее значение не только для точной координации и равновесия движений, но и для познания. Кроме того, нарушение развития мозжечка было связано со многими расстройствами нервного развития, включая аутизм, синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ) и шизофрению. Исследования развития мозжечка у людей ранее были возможны только с помощью посмертных исследований или нейровизуализации, но этих методов недостаточно для понимания молекулярных и клеточных изменений, происходящих in vivo во время раннего развития, когда возникают многие нарушения нервного развития. Появление методов генерации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из соматических клеток и способность к дальнейшей редифференцировке иПСК в нейроны проложили путь для моделирования in vitro раннего развития мозга. Настоящее исследование предлагает упрощенные шаги к созданию мозжечковых клеток для приложений, требующих 2-мерной (2D) монослойной структуры. Мозжечковые клетки, представляющие ранние стадии развития, получают из человеческих ИПСК с помощью следующих этапов: сначала эмбриоидные тела создаются в 3-мерной (3D) культуре, затем их обрабатывают FGF2 и инсулином для содействия спецификации мозжечковой судьбы, и, наконец, они терминально дифференцируются как монослой на поли-l-орнитиновых (PLO) / ламининовых субстратах. Через 35 дней дифференцировки культуры мозжечковых клеток, полученные из iPSC, экспрессируют мозжечковые маркеры, включая ATOH1, PTF1α, PAX6 и KIRREL2, предполагая, что этот протокол генерирует глутаматергические и ГАМКергические предшественники мозжечковых нейронов, а также предшественников клеток Пуркинье. Кроме того, дифференцированные клетки демонстрируют отчетливую морфологию нейронов и являются положительными для иммунофлуоресцентных маркеров нейронной идентичности, таких как TUBB3. Эти клетки экспрессируют аксональные направляющие молекулы, включая семафорин-4C, плексин-B2 и нейропилин-1, и могут служить моделью для исследования молекулярных механизмов роста нейритов и синаптической связности. Этот метод генерирует мозжечковые нейроны человека, полезные для последующих применений, включая экспрессию генов, физиологические и морфологические исследования, требующие 2D-монослойных форматов.

Введение

Понимание развития мозжечка человека и критических временных окон этого процесса важно не только для расшифровки возможных причин нарушений развития нервной системы, но и для выявления новых целей терапевтического вмешательства. Моделирование развития мозжечка человека in vitro было сложной задачей, но со временем появилось множество протоколов, дифференцирующих человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) или IPSCs с судьбами мозжечковой линии^, ^{1,2,3,4,5,6,7,8}