Здесь мы представляем протокол измерения активности бурой жировой ткани после еды у людей и лабораторных животных.
Методическая статья
Здесь мы представляем протокол измерения активности бурой жировой ткани после еды у людей и лабораторных животных.
Измерение активности бурой жировой ткани (БАТ) с помощью позитронно-эмиссионной томографии, компьютерной томографии (ПЭТ-КТ) путем накопления 18F-фтордезоксиглюкозы (ФДГ) после еды или у пациентов с ожирением или диабетом не является методом выбора. Основная причина заключается в том, что 18F-FDG конкурирует с постпрандиальной высокой концентрацией глюкозы в плазме за тот же переносчик глюкозы на мембране клеток BAT. Кроме того, BAT также использует жирные кислоты в качестве источника энергии, который не виден при ПЭТ-КТ и может быть изменен вместе с концентрацией глюкозы у пациентов с ожирением и диабетом. Поэтому для оценки физиологической значимости НДТ у животных и человека применяется новый метод инфракрасной термографии, используемый в последних публикациях.
После ночного голодания активность BAT измерялась с помощью инфракрасной термографии до и после еды у добровольцев и самок мышей дикого типа. Программное обеспечение камеры вычисляет температуру объекта, используя расстояние от объекта, коэффициент излучения кожи, отраженную комнатную температуру, температуру воздуха и относительную влажность. У мышей выбритая область над НДТ была областью интереса, для которой измерялись средние и максимальные температуры. Фазу эстрального цикла у самок мышей определяли после эксперимента по мазкам влагалища, окрашенным раствором красителя крезильной фиалки (0,1%). У здоровых добровольцев были выбраны два участка кожи шеи: надключичная область (над ключицей, где присутствуют клетки БАТ) и межключичная область (между ключицами, где ткань БАТ не обнаружена). Активность BAT определяется вычитанием этих двух значений. Кроме того, средняя и максимальная температура участков кожи может быть определена у животных и людей.
Было показано, что изменения активности НДТ после еды, измеренные с помощью инфракрасной термографии, неинвазивного и более чувствительного метода, зависят от пола, возраста и фазы эстрального цикла у лабораторных животных. Также было доказано, что активация БАТ у людей в рамках термогенеза, вызванного диетой, зависит от пола, возраста и индекса массы тела. Дальнейшее определение патофизиологических изменений активности БАТ после еды будет иметь большое значение для участников с высокими концентрациями глюкозы в плазме (ожирение и сахарный диабет 2 типа), а также у разных лабораторных животных (нокаутированные мыши). Этот метод также является вариативным инструментом для определения возможных активирующих препаратов, которые могут омолодить активность БАТ.
Бурая жировая ткань (BAT), в отличие от белой жировой ткани (WAT), не накапливает, а тратит энергию. При симпатической стимуляции BAT использует жирные кислоты и глюкозу и выделяет тепло путем активации разъединяющего белка 1 (UCP1). Функция UCP1 состоит в том, чтобы использовать градиент H+ между двумя митохондриальными мембранами для производства тепла вместо АТФ. Функция НДТ заключается в увеличении выработки тепла в холодных условиях, что приводит к увеличению расхода энергии1. После воздействия холода сенсорные входы от кожи ингибируют чувствительные к теплу нейроны в срединном преоптическом (MnPO) ядре гипоталамической преоптической области (POA), что уменьшает ингибирующее действие нейронов POA на ростральный бледный раф (rRPa). Активация нейронов rRPa повышает симпатическую активность, что сопровождается повышением активности BAT 2,3. Индуцированная холодом активация BAT улучшает чувствительность к инсулину у людей4, и эта активность снижается у людей с повышенным индексом массы тела (ИМТ) и возрастом 1,5,6,7.
Помимо его роли в термогенезе, вызванном холодом, после еды поглощение глюкозы в НДТ увеличивается у худого мужского населения, способствуя индуцированному диетой термогенезу (DIT), который выше у BAT-положительных мужчин 8,9. Современным методом, используемым для измерения активности БАТ, является позитронно-эмиссионная томография, компьютерная томография, известная как ПЭТ-КТ. Этот метод определяет активность БАТ путем измерения накопления радиоактивного индикатора фтордезоксиглюкозы (18F-FDG). Тем не менее, ПЭТ-КТ терпит неудачу в качестве метода выбора для обнаружения активации БАТ после еды. Одна из причин заключается в том, что после еды 18F-FDG конкурирует с постпрандиальной гипергликемией за один и тот же переносчик глюкозы, что делает его непригодным для определения активации BAT после еды, особенно при сравнении активности BAT у здоровых участников и участников с диабетом с возможными различиями в концентрациях глюкозы в крови. Кроме того, BAT использует жирные кислоты в качестве источника энергии для производства тепла, что не видно при ПЭТ-КТ. 18 См. Накопление F-ФДГ в НДТ после еды едва заметно10 и, следовательно, в большинстве случаев интерпретируется как отрицательный результат. Неудивительно, что недавно было высказано предположение, что активация BAT более выражена в человеческой популяции, чем мы думали ранее; Поэтому необходим новый подход к выявлению активности БАТ и ее участия в метаболическихнарушениях7. Попытка решить эту проблему заключается в измерении объема БАТ с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) у пациентов с преддиабетом и пациентов с сахарным диабетом 2 типа (СД2) с инсулинорезистентностью11. Однако объем НИМ, измеренный с помощью МРТ, не является достаточным показателем для оценки повседневной функции и использования глюкозы и жирных кислот с помощью BAT. Таким образом, для оценки реальных различий в активности БАТ у здоровых пациентов с СД2 необходим новый подход, позволяющий выяснить патологический механизм нарушения БАТ у пациентов с СД2.
Для определения активации НДТ были проведены измерения теплопродукции НДТ до и после еды с помощью инфракрасной (ИК) термографии (рис. 1)12,13. Установление ИК-термографии в качестве метода выбора для измерения активности НДТ после еды у здоровых людей и людей с ожирением или пациентов с сахарным диабетом окажет огромное влияние на эту область. По сей день ИК-термография используется для определения холодоиндуцированной активации BAT13,14,15. В новейшей истории человечества активность БАТ, вызванная холодом, уже не очень выражена (из-за правильного обогрева среды обитания, правильной одежды), в то время как активация БАТ после еды происходит каждый день. Кроме того, физиологическая регуляция этих двух функций BAT через гипоталамус совершенно разная. После еды активация нейронов, экспрессирующих проопиомеланокортин (POMC), в дугообразном ядре гипоталамуса (Arc) приводит к увеличению активности симпатического нерва через rRPa16. Индуцированная холодом активация НДТ, измеренная с помощью ИК-термографии или ПЭТ-КТ, ненадлежащая при использовании в качестве меры для повседневной активности НДТ. Повышенная активность БАТ после еды сопровождается утилизацией глюкозы, что в конечном итоге важно для поддержания гомеостаза глюкозы, чувствительности к инсулину и ежедневной регуляции концентрации глюкозы. Постпрандиальная активация БАТ приводит к увеличению постпрандиального потребления глюкозы с последующим увеличением теплопродукции и температуры тела (ДИТ). Было показано, что это зависит от пола, возраста и ИМТ12. Сходные гендерные различия в активации БАТ после еды наблюдаются у самцов и самок лабораторных мышей17. Эти результаты соответствуют недавно обнаруженным гендерным различиям в регуляции БАТ Берком и др., которые показали, что гипоталамическая регуляция потемнения БАТ через субпопуляцию нейронов POMC различается у самцов и самок мышей18. Постпрандиальная активация BAT меньше у женщин, пожилых людей и людей с ожирением. Отсутствие активации БАТ после еды (снижение утилизации глюкозы) может привести к более высокой распространенности нарушения толерантности к глюкозе у женщин 19,20,21,22. К сожалению, большинство исследований по активации БАТ были проведены только на мужчинах. Активируя BAT после еды, усвоение глюкозы увеличивается у худого мужского населения. Неудивительно, что после активации BAT DIT выше у BAT-положительных субъектовмужского пола 8,9. Кроме того, трансплантация БАТ у мышей-самцов улучшает толерантность к глюкозе, повышает чувствительность к инсулину и снижает массу тела и жировую массу23.
ПЭТ-КТ не является методом выбора для измерения активности ВАТ, особенно после еды. Поэтому был разработан неинвазивный и более чувствительный метод. ИК-термография позволяет оценить активность БАТ у различных лабораторных животных (нокаутных мышей), а также у людей, независимо от пола, возраста или влияния различных патологических состояний на активность БАТ. Дополнительным преимуществом этого метода является простота для участников и лабораторных животных, что позволяет оценить потенциальную пользу бустерной терапии БАТ. Недавние исследования с использованием ИК-термографии для определения физиологического поведения НДТ после воздействия холода или еды описаны в недавней публикации Brasil et al.24.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все экспериментальные процедуры на лабораторных животных были одобрены Национальным этическим комитетом и Министерством сельского хозяйства (EP 185/2018). Эксперименты проводились в соответствии с Этическим кодексом Хорватского общества лабораторных животных и руководящими принципами ARRIVE. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием людей, соответствовали Хельсинкской декларации и были одобрены Комитетом по этике медицинского факультета Загребского университета (UP/I-322-01/18-01/56). В этом исследовании мы представляем результаты трех участниц женского пола (ИМТ: 29 кг/м2 ± 5 кг/м2). Информированное согласие было получено от всех добровольцев на их участие в исследовании и на представление данных.
1. Измерение активации бурой жировой ткани после еды у человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите эксперименты в летнее время, когда дневная температура не ниже 22 ° C, чтобы поддерживать базальную активность BAT как можно ниже.
2. Измерение активации бурой жировой ткани после еды у лабораторных животных
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку животные содержатся в помещении для животных с регулируемой комнатной температурой и циклом день/ночь 12 часов / 12 часов, эксперименты могут проводиться в любое время года. Температура в помещении во время экспериментов должна быть от 22 °C до 27 °C. В этом исследовании были обследованы шесть самок животных диэструса и шесть самцов животных дикого типа (WT) C57Bl/6NCrl.
3. Анализ тепловых записей
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение тепловизионной камеры вычисляет температуру объекта, используя пять переменных.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Самый простой способ определить активность БАТ - это вычесть максимальную температуру кожи выше БАТ до и после еды у людей. Лучшим способом расчета активности НДТ является выбор двух областей интереса: участка кожи над БАТ, который расположен в надключичной области, и межключичного участка кожи, где ткань БАТ не обнаружена у людей, обозначенного как эталонная область (согласно ПЭТ-КТ; Рисунок 1). Активность НДТ легко определяется путем вычитания этих двух температур. Как показано на
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Недавние исследования представляют растущие данные о физиологической регуляции и важности активности НДТ у взрослых людей и животных в развитии ожирения и сахарного диабета. Кроме того, возможная активация НДТ экзогенными активаторами становится мишенью для фармацевтических компаний. Чтобы иметь возможность оценить физиологическую регуляцию и патофизиологическое значение БАТ при очень обременительных заболеваниях, а также открыть потенциальный терапевтический подход, инфракрасная термография становится методом выбора. Не...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторам раскрывать нечего.
Это исследование финансировалось исследовательским грантом Хорватского научного фонда (IP-2018-01-7416).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,1% кресилацетат фиолета | Часто используемое химическое | ||
| вещество Прибор для измерения температуры и влажности воздуха | Kesterl Kestrel | 4200 | Сертификат соответствия |
| Внешнее хранилище данных | Жесткий диск емкостью не менее 1 ТБ | ||
| Стеклянные микроскопические предметные стекла | Часто используемые | ||
| Маленький ватный тампон с ватным наконечником | из уретры | ||
| Программное обеспечение для анализа | FLIR Systems, Уилсонвилль, Орегон, США | Инструменты FLIR Программное | |
| обеспечение для измерений | FLIR Systems, Уилсонвилль, Орегон, США | Программное обеспечение ResearchIR | FLIR ResearchIR Max, версия 4.40.12.38 (64-бит) |
| Камера | Thermac FLIR Systems, Уилсонвилль, Орегон, США | FLIR T-1020 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение