Количественная оценка циркулярных РНК с использованием цифровой капельной ПЦР

Arundhati Das; Debojyoti Das; Amaresh C. Panda

doi:10.3791/64464

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественная оценка циркулярных РНК с использованием цифровой капельной ПЦР

4.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64464

⸱

16 сентября 2022 г.

Arundhati Das^*¹^,² , Debojyoti Das^*¹^,² , Amaresh C. Panda¹

¹Institute of Life Sciences, ²School of Biotechnology, KIIT University

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает подробный метод цифровой капельной ПЦР (dd-PCR) для точной количественной оценки уровней круговой РНК (циркРНК) в клетках с использованием расходящихся праймеров.

Аннотация

Цифровая капельно-полимеразная цепная реакция (dd-PCR) является одним из наиболее чувствительных методов количественной оценки; он фракционирует реакцию почти на 20 000 капель воды в масле, и ПЦР происходит в отдельных каплях. dd-PCR имеет несколько преимуществ по сравнению с обычной qPCR в реальном времени, включая повышенную точность в обнаружении мишеней с низкой плотностью, пропуск эталонных генов для количественной оценки, устранение технических реплик для образцов и демонстрацию высокой устойчивости к ингибиторам в образцах. В последнее время дд-ПЦР стала одним из самых популярных методов точной количественной оценки целевой ДНК или РНК для анализа экспрессии генов и диагностики. Круговые РНК (циркРНК) представляют собой большое семейство недавно обнаруженных ковалентно закрытых молекул РНК, не имеющих 5' и 3' концов. Было показано, что они регулируют экспрессию генов, действуя как губки для РНК-связывающих белков и микроРНК. Кроме того, циркРНК секретируются в жидкости организма, и их устойчивость к экзонуклеазам делает их биомаркерами для диагностики заболеваний. Эта статья направлена на то, чтобы показать, как выполнить дизайн дивергентного праймера, экстракцию РНК, синтез кДНК и анализ dd-PCR для точной количественной оценки конкретных уровней циркулярной РНК (циркРНК) в клетках. В заключение мы демонстрируем точную количественную оценку циркРНК с помощью dd-PCR.

Введение

Последние достижения в технологиях секвенирования РНК и новых вычислительных алгоритмах обнаружили нового члена растущего семейства некодирующих РНК, называемого круговой РНК (циркРНК)¹. Как следует из названия, циркРНК представляют собой семейство одноцепочечных молекул РНК без свободных концов. Они образованы неканоническим сращиванием голова к хвосту, называемым обратным сращиванием, где восходящий акцептор сращивания соединяется ковалентно с нисходящим донорским сайтом сращивания, образуя стабильный круг РНК ^1,2. Этот процесс может быть опосредован несколькими факторами, включая инв....