Методическая статья

Экотоксикологические методологии оценки биомаркеров в различных масштабах у неотропических бесхвостых

DOI:

10.3791/64520

⸱

28 апреля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Química de San Luis (INQUISAL), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas Y Técnicas (CONICET), Facultad de Ciencias de la Salud (FCS), Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 2Departamento de Ciencias Ambientales y Producción, Universidad Nacional de Los Comechingones (UNLC), 3Laboratório de Patologia Experimental - LAPEx, Instituto de Biociências - INBIO Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, 4Cátedra de Citología, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 5Área de Biología, Departamento de Biología, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 6Instituto de Recursos Biológicos, Centro de Investigaciones de Recursos Naturales (CIRN), Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), 7Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе представлены стандартизированные экотоксикологические методы оценки биомаркеров у неотропических видов бесхвостых. В частности, в данной статье подробно описаны несколько методологий на различных уровнях экотоксикологической оценки, таких как генетический, клеточно-гистологический, биохимический, морфологический и индивидуальный уровни.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Новые вопросы в экотоксикологии подчеркивают важность применения батареи биомаркеров, поскольку это приводит к экотоксикологическим прогнозам, которые улучшают не только интерпретацию воздействия стрессоров окружающей среды на организмы, но и определение их возможного воздействия. Хорошо известно, что использование экотоксикологических биомаркеров на разных уровнях организации позволяет прогнозировать биологические реакции организмов на стрессоры окружающей среды, что полезно при оценке экологического риска.

Тем не менее, необходимо рассмотреть вопрос об оптимизации основных процедур, получить исторические данные в контрольных группах и использовать специальные биоанализы для оценки реакций в органах и тканях, чтобы выяснить природу и вариацию наблюдаемых эффектов. Таким образом, настоящая работа направлена на описание нескольких экотоксикологических методологий, используемых на всех стадиях развития неотропических бесхвостых на разных экологических уровнях, и валидацию их в качестве полезных биомаркеров для использования как в дикой природе, так и в лабораторных условиях. В данной работе эти биомаркеры применялись на индивидуальном/организменном уровне (индекс упитанности), гистологическом/физиологическом уровне (гистопатология, гистометрический и пигментный анализы), биохимическом уровне (ферменты окислительного стресса) и генетическом уровне (прямое и окислительное повреждение ДНК по кометному анализу).

Несмотря на то, что эти методологии имеют небольшие вариации или модификации в зависимости от вида, эти методы обеспечивают эффективные биомаркеры для оценки воздействия ксенобиотиков на бесхвостых, которые обладают определенными характеристиками, делающими их полезными видами-индикаторами водных и наземных экосистем. В заключение следует отметить, что набор биомаркеров, использованных в настоящем исследовании, оказался достаточным для оценки токсических реакций у неотропических бесхвостых и может быть в дальнейшем рекомендован в качестве биоиндикаторов для определения воздействия загрязняющих веществ на водные экосистемы региона. Наконец, рекомендуется добиться стандартизации этих важных биомаркеров для бесхвостых в конкретных регионах, а также, возможно, включить их в оценку риска и принятие решений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поступление стрессоров окружающей среды в природные водоемы может влиять на здоровье водной экосистемы1. Воздействие этих экологических стрессоров может влиять на выживание или приспособленность водных организмов через различные механизмы токсичности, включая прямое воздействие (как краткосрочное, так и долгосрочное)2. Следовательно, стандартизированные лабораторные биотесты для оценки токсикологических конечных точек, связанных с физической формой и выживаемостью, могут быть ненадежной оценкой многих косвенных эффектов стресса в полевых условиях. Кроме того, изменения нормальных физиологических уровней и воздействие на индивидуумов, например, с точки зрения захвата добычи, могут быть более эффективными долгосрочными индикаторами воздействия на выживание и репродуктивную приспособленность организмов и, в конечном счете, на здоровье экосистемы. Прогнозирование изменений в составе и функционировании экосистемы, а также в состоянии здоровья организма на основе известного набора параметров окружающей среды и концентраций загрязняющих веществ имеет важное значение для совершенствования управления загрязнением1.

Биомаркеры определяются как биохимические, физиологические или гистологические изменения, вызванные либо воздействием ксенобиотических химических веществ, либо их воздействием 4,5. Биомаркеры оказались очень полезными в качестве сигналов раннего предупреждения 4,5. Важный вопрос, на который помогают ответить биомаркеры, заключается в том, присутствуют ли определенные стрессоры в достаточно высоких концентрациях в окружающей среде, чтобы вызвать неблагоприятные эффекты. Эта информация способствует оценке того, стоит ли расследовать характер и масштабы ущерба и причинных факторов или же в этом случае не следует вкладывать больше ресурсов 6,7,8. Более того, поскольку концепция оценки одного биомаркера в качестве биоиндикатора может быть недостаточной 5,7,8,9,10, наблюдается растущая тенденция к проведению комплексной оценки множественных биомаркеров с целью выявления ранних предупреждающих признаков и, таким образом, предотвращения необратимых последствий для экосистем.

Очень важно отметить, что все токсические эффекты начинаются с взаимодействия стрессора с биомолекулами. В этом смысле эффекты могут каскадом распространяться по биохимическому, субклеточному, клеточному, тканевому, органному, индивидуальному, популяционному, общинному, экосистемному, ландшафтному и биосферному уровням организации. Клетки являются основным местом взаимодействия между стрессорами окружающей среды и биологическими системами. Таким образом, понимание молекулярных и генетических эффектов позволяет исследователям связывать низкий и высокий уровни экологической организации и помогает прогнозировать влияние загрязнителей окружающей среды, например, на здоровье человека, которые ещене были проверены. Более того, благодаря высокой специфичности клеток, они полезны не только для оценки загрязнителей окружающей среды, но и здоровья человека 5,11. Таким образом, понимание эффектов стрессоров на биохимическом уровне может дать представление о причинах наблюдаемых эффектов и позволить связать их с причинами на следующем более высоком уровне. Кроме того, понимая биохимические механизмы стрессоров, можно предсказать эффекты новых стрессоров, которые еще не были токсикологически оценены, в отношении других хорошо известных загрязнителей на основе их сходства в функциях. В присутствии различных стрессоров окружающей среды генетические и биохимические биомаркеры могут предоставить ценную информацию о конкретных наблюдаемых эффектах. В дополнение к этому, гистохимические оценки, связанные с биохимическими изменениями, могут предоставить информацию о токсикодинамике. Короче говоря, необходим комплексный анализ клеточных, биохимических и гистологических биомаркеров10,12, а этот вид анализа, в свою очередь, должен быть включен в программы биомониторинга местных видов 5,13,14.

Тем не менее, изучение биомаркеров в лабораторных условиях может представлять некоторые трудности, включая трудности в выявлении сублетальных эффектов и хронических воздействий после воздействия загрязнителей, а также в валидации и стандартизации используемых методов, а также сложные реакции, зависящие от времени или дозы, неясные или неопределенные связи с приспособленностью и отсутствие интегрированных механистических моделей. 4. Для решения этих проблем решение состоит не в увеличении числа измеряемых биомаркеров, а в тщательной разработке исследований и проверяемых гипотез, которые способствуют объяснению механистических основ химических воздействий на целыеорганизмы.

Новые вопросы в экотоксикологии подчеркивают важность применения батареи биомаркеров для создания экотоксикологических прогнозов, которые улучшают интерпретацию воздействия экологических стрессоров на организмы, а также принятие решений об их возможном воздействии. Более того, важность объединения обоих понятий – биомаркеров и биоиндикаторов – в оценке экологических рисков и биомониторинге заключается в том, что это позволит исследователям определить, являются ли организмы в конкретной окружающей среде, представляющей интерес, физиологически нормальными или подверженными стрессу. Подход, использованный в этом исследовании, напоминает биохимический анализ, который проводится на людях. В этом смысле батарея биомаркеров может быть проанализирована, чтобы увидеть, здоров ли организм как в полевых условиях, так ив лаборатории. Наконец, биомаркеры будут способствовать оценке экологического риска двумя способами: (1) оценка воздействия редких и/или долгоживущих видов и (2) проверка гипотез о механизмах химического воздействия на различных уровнях биологическойорганизации.

В последнее десятилетие биомаркеры были использованы у бесхвостых для биомониторинга воздействия цитотоксических и генотоксических загрязнителей. Среди них наиболее часто используются такие методы, как анализ микроядер (MN) и анализ комет или индукция одноцепочечных разрывов ДНК с помощью анализа гель-электрофореза для одиночных клеток (SCGE). Кроме того, эти методы были успешно использованы для оценки повреждений ДНК, вызванных различными стрессорами окружающей среды у нескольких неотропических бесхвостых 14,15,16,17,18,19. Другие биомаркеры могут быть использованы для изучения изменений окислительного статуса в организмах, подвергшихся воздействию загрязнителей окружающей среды 16,17,18,19. Окислительный стресс является ответной реакцией на воздействие различных ксенобиотиков, приводящей к ряду пагубных последствий, в том числе на антиоксидантную способность облученных лиц 5,6,7,19,20.

В экотоксикологических исследованиях используются биоиндикаторные виды, потому что они являются организмами, которые идентифицируют долгосрочные взаимодействия и неблагоприятные эффекты экологических стрессоров на более высоких организационных уровнях (например, на уровне организмов, популяций, сообществ и экосистем)10,20,21. Интегрируя эти два понятия – биомаркеры и биоиндикаторы – виды могут быть проверены для широкого определения биохимических, физиологических или экологических структур или процессов, которые коррелируют или связаны с измеряемыми биологическими эффектами на одном или нескольких уровнях биологической организации. Наконец, большая проблема использования обеих концепций для улучшения оценок токсичности стрессора связана с анализом биомаркеров и биоиндикаторов, которые имеют высокую полезность при оценке экологических рисков. В этом смысле существует консенсус относительно актуальности использования биомаркеров и биоиндикаторов в качестве ранних предупреждающих признаков, поскольку они предоставляют актуальную информацию о реакции тестового организма настрессоры окружающей среды.

Амфибии являются одной из наиболее угрожаемых и быстро сокращающихся групп организмов во всем мире. Одной из основных причин этого снижения являются загрязняющие вещества, которые попадают в их среду обитания, такие как пестициды, металлы и новые загрязнители 22,23,24,25. Бесхвостые имеют несколько характеристик, которые делают их полезными в качестве биоиндикаторных видов, таких как их проницаемая кожа, тесная связь с водой и чувствительность к загрязнению окружающей среды 2,23,24. Эти характеристики делают амфибий эффективными биоиндикаторами состояния окружающей среды 7,8,22,23,24,26.

Тем не менее, необходимо не только рассмотреть вопрос об оптимизации основных процедур и генерировании исторических данных в контрольных группах, но и использовать специальные биоанализы для оценки реакций органов и тканей с целью выяснения характера и вариации эффектов, наблюдаемых в биоиндикаторах. В этом смысле настоящая работа направлена на описание нескольких экотоксикологических методологий, которые должны быть использованы на всех стадиях развития неотропических бесхвостых на разных экологических уровнях и валидировать их в качестве полезных биомаркеров для использования как в дикой природе, так и в лабораторных условиях. В этой работе представлена батарея биомаркеров, которые могут быть интегрированы и которые были доказаны для лабораторного биомониторинга и биомониторинга дикой природы у бесхвостых, подверженных воздействию стрессоров окружающей среды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующие методики включают в себя предыдущее жертвоприношение животного, которое было проведено в соответствии с международными этическими стандартами 46,47,48, и последующее вскрытие и абляцию органов. Животные были отловлены с разрешения Министерства окружающей среды, сельского хозяйства и производства провинции Сан-Луис (резолюция 49-PMA2019). Методы жертвоприношения и эвтаназии животных были должным образом одобрены протоколами Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию (CICUA, протокол Q-322/19) Национального университета Сан-Луис. Процедуры с бесхвостыми организмами проводили в соответствии с рекомендациями, подробно описанными в Garber et al.46, CONICET47 и INTA48. Кроме того, все представленные здесь протоколы относятся к неотропическим видам бесхвостых на их личиночной и взрослой стадиях жизни; они уже получили широкое признание среди местных исследователей и проводятся в соответствии со строгим протоколом и с разрешения "Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUA)" каждого участвующего университета. Перечень используемых материалов и растворов представлен в Таблице материалов и Таблице 1.

1. Индивидуальный уровень: Состояние организма и печеночный и гонадный индексы

  1. Индекс упитанности: Масштабированный индекс массы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот индекс можно использовать как со взрослыми особями, так и с молодью и личинками. Эта методология основана на Пейге иГрине 27 с незначительными изменениями для бесхвостых в соответствии с Brodeur et al.28,30 и MacCracken and Stebbings29.
    1. Запишите массу тела каждого образца с помощью прецизионной аналитической шкалы.
    2. Поместите каждый экземпляр на миллиметровый лист, и сделайте фотографию на расстоянии ~15 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно всегда фотографировать с одного и того же расстояния.
    3. Анализ фотографий:
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фотографии могут быть проанализированы с помощью программы ImageJ, которая находится в свободном доступе в Интернете (https://imagej.nih.gov/ij/index.html), или с помощью любой другой программы анализа изображений, которая позволяет проводить измерения по шкале, включенной в фотографию.
      1. Измерьте длину рыла и вентиляционного отверстия (SVL) каждого образца с помощью инструмента измерения из программы ImageJ и сначала обратитесь к известному измерению на миллиметровом листе.
        ПРИМЕЧАНИЕ: У головастиков измерение длины тела должно производиться до клоакальной трубки, не обращая внимания на хвостовой плавник.
    4. Масштабный индекс массы (S)
      1. Используя данные, полученные из массы тела и SVL каждого бесхвостого, постройте нелинейную линию регрессии степенной функции массы тела (ось y) против SVL (ось x).
      2. Вычислите среднюю длину с помощью данных SVL всех особей, измеренных из исследуемой популяции.
      3. Наконец, рассчитаем масштабированный индекс массы (S) в соответствии с Пейгом и Грином27 и Бродером и др.28 с использованием уравнения (1):
        S = Mi(L0/Li)b (1)
        где Mi иL i – масса тела, а SVL от индивидуума i соответственно; b – масштабная экспонента, оцененная с помощью нелинейной регрессии степенной функции28; L0 — средняя длина для исследуемой популяции; и S — прогнозируемая масса тела для индивидуума i при стандартизации его SVL до значения L0 .
        Примечание: Важно отметить, что b является видоспецифичной константой, которая также может быть специфичной для пола у видов с половым диморфизмом.
  2. Гепатозоматический индекс: чешуйчатый индекс печени
    ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается индекса упитанности, то этот индекс можно использовать с особями на всех этапах развития. Методология основана на работе Brodeur et al.28.
    1. Запишите SVL каждого образца в соответствии с шагами 1.1.2 и 1.1.3.
    2. Усыплять особей в соответствии с этическими нормами для бесхвостых амфибий 46,47,48.
    3. Удалите всю печень и запишите ее массу на прецизионных аналитических весах с точностью до миллиграмма.
    4. Используя данные, полученные из массы печени и СВЛ каждого бесхвостого, постройте нелинейную линию регрессии степенной функции массы печени (ось y) против СВЛ (ось x).
    5. Вычислите среднюю длину с помощью данных SVL всех особей, измеренных из исследуемой популяции.
    6. Рассчитайте шкалированный индекс печени (SLI) по Brodeur et al.28 с помощью уравнения (2):
      SLI = Lmi (L0/Li)b (2)
      где Lmi иL i – масса печени и SVL от индивидуума i, соответственно; b – масштабная экспонента, оцененная с помощью нелинейной регрессии степенной функции28; L0 — средняя длина для исследуемой популяции; а СЛИ – это прогнозируемая масса печени для индивидуума i при стандартизации его СВЛ до L0.
  3. Гонадный индекс: Чешуйчатый гонадный индекс
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта методология основана на Brodeur et al.30 и полезна только для взрослых особей. Важно отметить, что мужские и женские индексы должны анализироваться отдельно, так как они варьируются в разных масштабах.
    1. Запишите SVL каждого образца в соответствии с шагами 1.1.2 и 1.1.3.
    2. Усыплять особей в соответствии с этическими нормами для бесхвостых амфибий 46,47,48.
    3. Удалите правую и левую половые железы и запишите массу на прецизионную аналитическую шкалу с точностью до миллиграмма.
    4. Используя данные, полученные из массы гонад и SVL каждого бесхвостого, постройте нелинейную линию регрессии степенной функции массы гонады (ось y) против SVL (ось x), аналогичную шагам 1.1.4.1 и шагу 1.2.3.
    5. Вычислите среднюю длину с помощью данных SVL всех особей, измеренных из исследуемой популяции.
    6. Оцените масштабный гонадный индекс (SGI) по Brodeur et al.30 для каждого животного с помощью уравнения (3):
      SGI = Gmi(L0/Li)b (3)
      где Gmi и Li — масса гонады, а SVL из отдельного i, соответственно, b — масштабный экспонента, оцененная с помощью нелинейной регрессии степенной функции по Brodeur et al.30, L0 — средняя длина для изучаемой популяции, а SGI — предсказанная масса гонады для индивидуума i при стандартизации его SVL до L0.

2. Морфолого-гистологический уровень

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого анализа необходимо использовать гистологические срезы. Первым делом необходимо собрать ткань.

  1. Фиксация и обезвоживание
    1. Используйте фиксирующий раствор для сохранения конструкций. Для тканей бесхвостых предпочтительно использовать раствор метакарна или Буина, рекомендуемый вместо остальных фиксирующих растворов (Таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все вещества должны быть смешаны во время использования.
    2. Поместите головастиков или фрагмент ткани в дозе 50-100 мг в коническую пробирку с 1-2 мл фиксирующего раствора при температуре 4 °С на 3 ч. Промойте салфетку в том же объеме 70% этиловым спиртом в течение 30 минут.
    3. Поместите салфетку в свежий раствор 70% этилового спирта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе процедуру можно прекратить на несколько дней, прежде чем продолжить обезвоживание.
    4. Обезвоживайте ткань в ряде спиртовых растворов: этиловый спирт 80% (10 мин), спирт 90% (10 мин), этиловый спирт 100% (10 мин) и этиловый спирт 100% (10 мин).
    5. Проводят диафанизацию (очистку) 2 х 10 мин в ксилоле.
    6. Растопите парафин в стакане. Замочите салфетку на 10 минут. Извлеките ткань, и поместите в гистологическую форму с расплавленным парафином. Подождите, пока он застынет при комнатной температуре.
    7. Поместите срезы размером 3 мкм, сделанные на вращающемся микротоме, на предметное стекло.
  2. Гистометрический анализ
    1. Окрашиваем участки ткани в гематоксилин-эозин31.
    2. Используйте 10-20 микрофотографий для измерения со 100-кратным объективом в световом микроскопе. Проанализируйте 5-10 клеток печени на каждой микрофотографии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данном случае в качестве модели для описания техники использовалась печень. Есть возможность использовать и другие ткани; Убедитесь, что объектив используемого светового микроскопа подходит для данного типа ткани. Необходимо уметь видеть и идентифицировать клетки, которые нужно измерить.
  3. Гистопатология
    1. После окрашивания срезов тканей в гематоксилин-эозин32 исследуют 5-10 гистологических срезов под объективами 10x, 20x, 40x и 100x.
    2. Найдите изменения в тканях и оцените индекс степени изменений тканей (DTC), описанный Bernet et al.32 , используя уравнение (4):
      DTC =Σalt. (а × ж)    (4)
      где Σalt — сумма изменений; a представляет стадию повреждения (0 – отсутствует; 1 – низкая; 2 – средняя; 3 – высокая); а w обозначает степень обратимости повреждения (1 – обратимо; 2 – частично обратимо; 3 – необратимо).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данном случае в качестве модели для описания техники использовалась печень. Есть возможность использовать и другие ткани; Убедитесь, что объектив используемого светового микроскопа подходит для данного типа ткани.
  4. Пигментная система
    1. После окрашивания предметных стекол в гематоксилин-эозин изучите 10-20 микрофотографий с объективом 20x.
    2. Количественно оцените площадь, занимаемую меланином, путем измерения различий в интенсивности окрашивания с помощью программного обеспечения Image Pro-Plus в соответствии с Santos et al.33.
    3. Откройте программу Image Pro Plus 6.0®.
    4. Выберите Меню и панель инструментов: Биологический.
    5. Выберите Пространственная калибровка увеличения, используемого для съемки микрофотографий.
    6. Откройте гистологическое изображение.
    7. Выберите Количество инструментов | Измеряйте объекты.
    8. Нажмите на кнопку «Выбрать цвета ».
    9. Выберите инструмент пипетка и отметьте цвет для измерения на изображении.
    10. Закройте окно и нажмите « Количество».
    11. Выбрать Вид | Статистика для просмотра результатов.

3. Биохимический уровень: активные формы кислорода (АФК) и холинергические ферменты

  1. Гомогенизация образцов
    ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения эксперимента сохраните образцы (ткани или головастики) в фосфатно-солевом буфере (PBS), если они не будут обработаны в это время, путем замораживания при температуре −20 °C (в течение 2 месяцев) или −80 °C (в течение 6 месяцев). В качестве альтернативы они могут быть гомогенизированы в нужное время в соответствии с рекомендациями, предложенными ниже.
    1. Головастиков
      1. Взвесьте 1 г головастика или пула головастиков на прецизионных аналитических весах.
      2. Поместите 1 г головастиков в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 1 мл PBS, и погрузите ее в ледяную баню (4 °C).
      3. Гомогенизация осуществляется с помощью гомогенизатора с тефлоновым наконечником, адаптированного к конической трубке, и работы при низких температурах (4 °C).
        ВНИМАНИЕ: Избегайте использования большого числа оборотов, так как это может разрушить белки и повысить температуру.
      4. Переложите одинаковый объем жидкого гомогената каждого образца в две маркированные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл и работайте в холодных условиях (4 °C).
      5. Образцы центрифугируют с жидким гомогенатом в течение 10 мин при 4 °C и 9 520 × г.
      6. Наконец, извлеките надосадочную жидкость, поместите ее в микроцентрифужные пробирки, пометьте в виде аликвот от 0,5 мл до 1 мл и храните в морозильной камере при температуре −80 °C (в течение 6 месяцев) или −20 °C (в течение 2 месяцев) до проведения ферментного анализа.
    2. Взрослых
      1. Удалите интересующую ткань (например, печень, мышцы, почки) и взвесьте 1 г на прецизионных аналитических весах.
      2. Поместите салфетку в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 1 мл PBS, и погрузите ее в ледяную баню (4 °C).
      3. Гомогенизируйте с помощью гомогенизатора с тефлоновым наконечником, адаптированного к конической трубке, и работайте при низких температурах (4 °C).
        ВНИМАНИЕ: Избегайте использования высоких оборотов, так как это может разрушить белки и повысить температуру.
      4. Перелейте одинаковый объем жидкого гомогената каждого образца в две маркированные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл и работайте при температуре холода (4 °C).
      5. Центрифугируйте пробирки с жидким гомогенатом в течение 10 мин при 4 °C и 9 520 × г.
      6. Наконец, извлеките надосадочную жидкость, поместите ее в микроцентрифужные пробирки, пометьте аликвотами от 0,5 мл до 1 мл и храните в морозильной камере при температуре −80 °C (в течение 6 месяцев) или −20 °C (в течение 2 месяцев) до проведения ферментного анализа.
  2. Определение белка
    Примечание: Значение белка получено для оценки ферментативной активности по отношению к общему количеству белка, избегая при этом занижения или завышения значений ферментативной активности. Эта методология основана на Bradford34 с небольшими изменениями для бесхвостых:
    1. Приготовьте реактив Брэдфорд (см. табл. 1).
    2. Добавьте 100 мл H3PO4 в концентрации 85% (p/v) в Coomassie G-250 + этанол, и доведите до объема 1 л с дистиллированной водой.
    3. Подготовьте калибровочную кривую с использованием бычьего сывороточного альбумина (БСА) в качестве известного стандарта белка (Таблица 1).
    4. Приготовьте стандарты альбумина в возрастающих концентрациях для кюветы спектрофотометра объемом 3 мл. Пример стандартной кривой приведен в таблице 2.
    5. Измерьте поглощение с помощью спектрофотометра на длине волны 590 нм (это длина волны, на которой образуется комплекс реагента и белка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение реакции Брэдфорда с образцом для считывания в спектрофотометре с использованием стеклянной кюветы с максимальным объемом 3 мл и оптическим путем 1 см помогает определить белок.
    6. Поместите в кювету следующие реагенты в следующем порядке: 2000 μL реагента Bradford + X μL образца (X = 20 μL гомогенатного образца исследуемого органа от взрослого бесхвостого или 40 μL гомогенатного образца от головастика).
    7. Наконец, измерьте поглощение в спектрофотометре на длине волны 590 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно работать при температуре 4 °C.
  3. Каталазы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта методология основана на Aebi35 с незначительными изменениями для бесхвостых.
    1. Инкубируйте 1 900 мкл PBS + 40 мкл перекиси водорода (H202) + 20 мкл образца (чистого у головастиков и разбавленного на 1/25 для взрослой ткани) в кварцевой кювете объемом 3 мл с длиной пути 1 см.
      ВНИМАНИЕ: Следуйте приведенному выше порядку добавления реагентов и образца во время инкубации. Реагенты можно инкубировать при комнатной температуре (25 °C), так как бесхвостые являются физиологически эктотермическими.
    2. Считывайте кинетику каталазы при длине волны 240 нм в течение 2 мин в УФ-спектрофотометре.
    3. Рассчитайте активность фермента с помощью следующего уравнения (5)35:
      k (ммоль∙мин-1∙мг-1 Prt) = (Δ поглощение/1 000)/концентрация белка (5)
      ПРИМЕЧАНИЕ: В исследованиях с очищенными ферментными препаратами удельную активность k'0 получают путем деления k на коэффициент угасания моляров, (e = 43,6); k' = (k/e).
  4. Глутатион-S-трансфераза (GST)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта методология основана на Habig et al.36 с незначительными изменениями для бесхвостых.
    1. Инкубируйте 300 мкл GST + 10 мкл 1-choro-2, 4-динитробензензена (CDNB) (0,1 М) + 10 мкл образца (чистого у головастиков и разбавленного 1/25 для взрослых тканей) в кювете.
      ВНИМАНИЕ: Соблюдайте порядок добавления реагентов и приведенного выше образца во время инкубации. Реагенты можно инкубировать при комнатной температуре (25 °C), так как бесхвостые являются физиологически эктотермическими.
    2. Подготовьте GST (Таблица 1).
    3. Считывайте кинетику GST при длине волны 340 нм в течение 2 мин в спектрофотометре.
    4. Рассчитайте активность фермента с помощью следующего уравнения (6):
      Активность GST (ммоль/в минуту/мг белка) = ([Δ поглощение/1,000]/9,6 × 104)/концентрация белка (6)
      где 9,6 мМ−1 см−1 = коэффициент затухания моляров.
  5. Перекисное окисление липидов (TBARS)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта методология основана на Buege и Aust37 с незначительными изменениями для бесхвостых.
    1. Постройте калибровочную кривую с MDA в качестве стандарта и 0,7% TBA (Таблица 3).
    2. Приготовьте стандартный раствор MDA (10 мМ) (Таблица 1). Проведите гидролиз THP до MDA, поместив раствор в водяную баню при температуре 50 °C на 1 ч.
    3. Приготовьте 0,7% (масс./об.) раствор TBA (Таблица 1) с помощью магнитной мешалки с подогревом.
    4. Затем центрифугируйте гомогенаты образца в течение 30 мин при 9 520 × г и 4 °C.
    5. Извлеките 500 мкл надосадочной жидкости, добавьте 100 мкл 6 М NaOH и поместите в термальную ванну при температуре 60 °C на 30 минут.
    6. После термальной ванны добавьте 250 μL 35% HClO4, а затем поместите в ледяную баню (4 °C) на 30 минут.
    7. По истечении этого времени центрифугируйте при 9520 × г в течение 12 мин и извлеките 300 мкл надосадочной жидкости.
    8. Добавьте 300 мкл 0,7% ТБА в надосадочную жидкость (образец) и поместите в термальную ванну (97,5 °C) на 30 минут.
    9. Считайте поглощение комплекса, образованного образцом и ТБА при 532 нм, и определите концентрацию MDA в образцах, подставив значения поглощения в уравнение кривой (рис. 1).
  6. Ацетилхолинэстераза (АХЭ)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта методология основана на методологии, предложенной Ellman et al.38 , с незначительными изменениями для бесхвостых.
    1. В момент измерения настройте реагенты DTNB и ацетилтиохолина йодид (ATCh).
    2. Приготовьте реакцию DTNB (табл. 1).
    3. Приготовьте реакцию AChE (табл. 1).
    4. В стеклянной ячейке с оптическим трактом 1 см готовят реакцию AChE, размещая эти реагенты в следующем порядке: 150 мкл PBS буфера (pH = 8) + 150 мкл DTNB + 50 мкл ATCh + 10 мкл образца (чистый у головастиков и разведенный на 1/10 у взрослых бесхвостых).
    5. Считывать кинетику АХЭ при длине волны 412 нм в течение 2 мин при комнатной температуре.
    6. Получим значение активности АХЭ с помощью следующего уравнения (7):
      Уровень активности АХЭ (ммоль∙мин-1∙мг-1 белка) = ([Δ абсорбция/1,000]/1,36)/концентрация белка (7)

4. Генетический и клеточный уровень: анализ микроядер и комет

  1. Микроядерный (МН) анализ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Методология согласуется с методологией, предложенной Фенеком39 , с небольшими изменениями для неотропических бесхвостых.
    1. Обезболивайте образцы путем погружения в ледяную воду (4 °C) и получите образцы крови путем разреза за оперкулумом у головастиков или с помощью пункции сердца у взрослых.
    2. Намажьте две капли периферической крови из образцов на предварительно очищенные предметные стекла.
    3. После этого высушите предметные стекла на воздухе, зафиксируйте 100% (v/v) холодным метанолом (4 °C) в течение 20 минут, а затем окрашивайте 5% раствором Giemsa в течение 12 минут.
    4. Пусть один исследователь запрограммирует и вслепую закодирует слайды с увеличением 1000x.
    5. Определите частоту МН путем анализа 1000 зрелых эритроцитов из каждого образца и экспрессируйте как общее количество МН на 1000 клеток.
    6. Используйте следующие критерии для корректной идентификации МН:
      1. Ищите МН, диаметр которых меньше 1/3 от диаметра основного ядра.
      2. Убедитесь, что окраска MN не преломляется, но имеет интенсивность окрашивания, такую же или более светлую, чем у основного ядра.
      3. Ищите границу MN, которая отличается от границы основного ядра без какого-либо соединения с ядром или перекрытия с основным ядром.
      4. Убедитесь, что количество МН в клетках не превышает четырех МН, связанных с ядром.
  2. Кометный анализ или одноклеточный гель-электрофорез (SCGE)
    1. Обезболивайте образцы путем погружения в ледяную воду и получите образцы крови путем разреза за оперкулумом у головастиков или с помощью пункции сердца у взрослых.
    2. Разбавьте кровь 1 мл PBS, центрифугите (381 × г, 9 мин) и повторно суспендируйте в окончательном объеме 50 мл PBS.
    3. Смешайте 30 мкл образца крови с 70 мкл агарозы с низкой температурой плавления (LMPA) в концентрации агарозы 0,5% до образования слоя 2. Затем поместите 50 мкл слоя 2 на предметное стекло, предварительно покрытое слоем 1, содержащим 100 мкл агарозы 0,5% нормальной температуры плавления.
    4. Накройте предметное стекло покровным стеклом и поставьте в холод (4 °C) на 10 минут для застывания слоя 2.
    5. После застывания снимите покровное стекло и сформируйте третий слой, положив 100 мкл 0,5% LMPA.
    6. Когда третий слой застынет, снимите покровное стекло и погрузите каждое предметное стекло в банку Coplin объемом 100 мл с раствором лизиса (Таблица 1), которая была приготовлена в тот же день и хранилась при температуре 4 °C. Поместите банки с коплином в холодную ванну на 1 час в темноте (4 °C) для проведения лизиса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент можно приостановить и возобновить позже. Сообщалось, что период лизиса длится от 1 часа до 1 месяца.
    7. По окончании лизиса снимите предметные стекла и погрузите в буферный раствор для электрофореза (табл. 1) в емкости для электрофореза. Выполняйте этот шаг в темноте в течение 15 минут при температуре 4 °C, чтобы позволить ДНК раскрутиться. После раскручивания ядерной ДНК проводят электрофорез на том же буфере при температуре 4 °C в течение 10 мин при 25 В и 250 мА.
    8. В конце электрофореза нейтрализовать образцы, содержащиеся в предметных стеклах, 3 х 5 мин, добавив 2 мл раствора Tris-HCl (табл. 1).
    9. На последнем этапе метода анализа комет обезвоживайте образцы, помещая образцы в банки Coplin объемом 100 мл с содержанием алкоголя (95%) при температуре 4 °C.
    10. Наконец, окрасьте образцы, поместив 10 μL 4',6-диамино-2-фенилиндола (DAPI) в центр предметного стекла, и поместите покровное стекло, которое распределит краситель по всем образцам. Изучите предметные стекла под флуоресцентным фотомикроскопом с фильтром белого цвета.
      ВНИМАНИЕ: Весь процесс должен проводиться в темноте, чтобы избежать фотодеградации ДНК.
    11. Количественно оцените повреждение ДНК, оценив продолжительность миграции ДНК из нуклеоида. В этом случае визуально определите его по 100 случайно выбранным ячейкам без перекрытия. Классифицируйте повреждения ДНК по четырем классам: 0-I (без повреждений), II (минимальные повреждения), III (средние повреждения) и IV (максимальные повреждения). Выразите данные в виде среднего числа поврежденных клеток (сумма классов II-IV) и среднего балла кометы для каждой группы лечения. Исходя из этих данных, рассчитайте индекс генетической вредоносности (GDI) для каждого тестируемого организма с помощью следующего уравнения (8):
      GDI = (1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV])/N[I-IV]) (8)
      где I-IV представляют тип нуклеоидного повреждения, а NI-NIV представляют общее количество нуклеоидов, оцененных по Pitarque et al.40.

5. Коррелированные биомаркеры

ПРИМЕЧАНИЕ: В последнее время биомаркеры могут быть интегрированы на всех уровнях с использованием индекса биомаркерного ответа (IBR), предложенного Белиаевым и Буржо49 и адаптированного для неотропических бесхвостых. IBR предоставляет числовое значение, которое объединяет все ответы биомаркеров; более высокие значения IBR указывают на более высокий уровень стресса49. С точки зрения оценки IBR для данной станции или обработки данного обследования, последовательные шаги обработки данных для определения итогового балла являются следующими:

  1. Вычисление средней оценки (X) при наличии индивидуальных результатов; В противном случае используйте значение из объединенной пробы на каждой станции отбора проб.
  2. Для каждого биомаркера вычислите общее среднее значение (m) и стандартное отклонение (s) X для всех станций и/или обследований, в зависимости от проводимых сравнений.
  3. Стандартизируйте X для получения Y. Вычислите значение под названием Y: Y = (X- m)/с.
  4. Вычислите значение Z следующим образом: Z = Y или Z = −Y, в случае биологического эффекта, соответствующего, соответственно, торможению или активации в ответ на стрессор.
  5. Наконец, вычислите счет (S), где S = Z + |Min|, где S ≥ 0 и |Мин | — определяемая минимальная абсолютная величина.
  6. Постройте диаграмму паука или звезды после вычисления значения S для каждого биомаркера (Si) и выполнения суммирования для получения IBR.
    ПРИМЕЧАНИЕ: обратитесь к оригинальному документу49 для получения любых подробностей расчетов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все представленные здесь методы биомаркеров просты, быстры, удобны, чувствительны, недороги и точны. Для каждого биомаркера важно отметить следующее.

Индивидуальный уровень
Масштабируемый индекс массы
Фотосъемка в миллиметровом масштабе имеет большое значение, поскольку это значение будет использоваться для калибровки программного обеспечения, что приводит к большей объективности в отношении измерения штангенциркуля при съемке переменной SVL. Кроме того,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биомаркеры на индивидуальном уровне очень просты в определении и очень недороги, поскольку для изучения этих биомаркеров требуется всего несколько единиц оборудования, которое обычно доступно в любой исследовательской лаборатории. Кроме того, эти биомаркеры предоставляют общую информацию о здоровье и физической форме животных. Количество животных, задействованных в каждом протоколе, имеет решающее значение для получения надежных результатов. Из-за изменчивости данных для каждой обработки...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность Instituto de Química de San Luis "Dr. Roberto Olsina" - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (INQUISAL-CONICET), Universidad Nacional de San Luis (Project PROICO 2-1914), Laboratório de Patologia Experimental (LAPEx) - Instituto de Biociências (INBIO) - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Cátedra de Citología - Universidad Nacional de La Plata (UNLP) и Agencia Nacional de Promoción Científica (FONCYT; PICT-2018-02570 и PICT-2018-01067) для финансовой поддержки. Мы также хотели бы поблагодарить носителя языка Лидию Унгер и GAECI-UNSL (Центр помощи в написании научных текстов) из Национального университета Сан-Луис за корректуру рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аналитические весы
Электрофорез источник питания  Эндуро  E0203-250V 
Eosin Merck
  Олимп  BX50оснащен соответствующей комбинацией фильтров
Гематоксилин фотоаппарата высокого разрешения HarrisMerck
   >16 мегапикселей
Гомогенизатор
Горизонтальная камера электрофореза  Микроцентрифуга Sigma
Denver Instrument Микроскоп
LeicaDM4000B Оснащен системой захвата изображений Leica DFC 280
MicrotomeLeica2265
ParaplastSigmaP3558
Персональный компьютер  Оснащен
холодильной центрифугой
UV– Виз спектрофотометрРэлей723Gс УФ-лампой
Флуоресцентный фотомикроскоп для Mac OS X, Lynux или Windows

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hook, S. E., Gallagher, E. P., Batley, G. E. The role of biomarkers in the assessment of aquatic ecosystem health. Integrated Environmental Assessment and Management. 10 (3), 327-341 (2014).
  2. Connon, R. E., et al. Linking mechanistic and behavioral responses to sublethal esfenvalerate exposure in the endangered delta smelt; Hypomesus transpacificus (Fam. Osmeridae). BMC Genomics. 10, 608(2009).
  3. Scholz, N. L., et al. A perspective on modern pesticides, pelagic fish declines, and unknown ecological resilience in highly managed ecosystems. Bioscience. 62 (4), 428-434 (2012).
  4. Forbes, V. E., Palmqvist, A., Bach, L. The use and misuse of biomarkers in ecotoxicology. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (1), 272-280 (2006).
  5. Newman, M. C. Fundamentals of Ecotoxicology: The Science of Pollution., Fifth edition. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2019).
  6. Walker, C. Ecotoxicology: Effects of Pollutants on the Natural Environment. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2014).
  7. Venturino, A., et al. Biomarkers of effect in toads and frogs. Biomarkers. 8 (3-4), 167-186 (2003).
  8. Lajmanovich, R. C., et al. Técnicas para el relevamiento de anfibios en ambientes contaminados. Manual de Técnicas y Protocolos para el Relevamiento y Estudio de Anfibios de Argentina., 1a Edition. , Universidad Nacional de Jujuy. San Salvador de Jujuy, Argentina. (2021).
  9. Vander Oost, R., Beyer, J., Vermeulen, N. P. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: A review. Environmental Toxicology and Pharmacology. 13 (2), 57-149 (2003).
  10. Pérez-Iglesias, J. M., González, P., Calderón, M. R., Natale, G. S., Almeida, C. A. Comprehensive evaluation of the toxicity of the flame retardant (decabromodiphenyl ether) in a bioindicator fish (Gambusia affinis). Environmental Science and Pollution Research. 29 (33), 50845-50855 (2022).
  11. Bickham, J. W., Sandhu, S., Hebert, P. D., Chikhi, L., Athwal, R. Effects of chemical contaminants on genetic diversity in natural populations: Implications for biomonitoring and ecotoxicology. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 463 (1), 33-51 (2000).
  12. Adams, S. M., Ham, K. D. Application of biochemical and physiological indicators for assessing recovery of fish populations in a disturbed stream. Environmental Management. 47 (6), 1047-1063 (2011).
  13. Rautenberg, G. E., Amé, M. V., Monferrán, M. V., Bonansea, R. I., Hued, A. C. A multi-level approach using Gambusia affinis as a bioindicator of environmental pollution in the middle-lower basin of Suquía River. Ecological Indicators. 48, 706-720 (2015).
  14. Larramendy, M. L. Ecotoxicology and Genotoxicology: Non-Traditional Terrestrial Models. , Royal Society of Chemistry. London, UK. (2017).
  15. Guilherme, S., Gaivão, I., Santos, M. A., Pacheco, M. DNA damage in fish (Anguilla anguilla) exposed to a glyphosate-based herbicide-elucidation of organ-specificity and the role of oxidative stress. Mutation Research. 743 (1-2), 1-9 (2012).
  16. Lajmanovich, R. C., et al. Harmful effects of the dermal intake of commercial formulations containing chlorpyrifos, 2, 4-D, and glyphosate on the common toad Rhinella arenarum (Anura: Bufonidae). Water, Air, & Soil Pollution. 226 (12), 427(2015).
  17. Pérez-Iglesias, J. M., de Arcaute, C. R., Natale, G. S., Soloneski, S., Larramendy, M. L. Evaluation of imazethapyr-induced DNA oxidative damage by alkaline Endo III-and Fpg-modified single-cell gel electrophoresis assay in Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 503-508 (2017).
  18. Carvalho, W. F., et al. DNA damage exerted by mixtures of commercial formulations of glyphosate and imazethapyr herbicides in Rhinella arenarum (Anura, Bufonidae) tadpoles. Ecotoxicology. 28 (3), 367-377 (2019).
  19. Jacobsen-Pereira, C. H., et al. Markers of genotoxicity and oxidative stress in farmers exposed to pesticides. Ecotoxicology and Environmental Safety. 148, 177-183 (2018).
  20. Bartell, S. M. Biomarkers, bioindicators, and ecological risk assessment-A brief review and evaluation. Environmental Bioindicators. 1 (1), 60-73 (2006).
  21. Hamza-Chaffai, A. Usefulness of bioindicators and biomarkers in pollution biomonitoring. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 3 (1), 19-26 (2014).
  22. Kacoliris, F. P., et al. Current threats faced by amphibian populations in the southern cone of South America. Journal for Nature Conservation. 69, 126254(2022).
  23. Sparling, D. W., Linder, G., Bishop, C. A., Krest, S. K. Ecotoxicology of Amphibians and Reptiles. , SETAC Books. Boca Raton, FL. (2010).
  24. Kiesecker, J. M., Blaustein, A. R., Belden, L. K. Complex causes of amphibian population declines. Nature. 410 (6829), 681-684 (2001).
  25. Brühl, C. A., Schmidt, T., Pieper, S., Alscher, A. Terrestrial pesticide exposure of amphibians: An underestimated cause of global decline. Scientific Reports. 3, 1135(2013).
  26. Wagner, N., Lötters, S., Veith, M., Viertel, B. Effects of an environmentally relevant temporal application scheme of low herbicide concentrations on larvae of two anuran species. Chemosphere. 135, 175-181 (2015).
  27. Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
  28. Brodeur, J. C., et al. Frog body condition: Basic assumptions, comparison of methods and characterization of natural variability with field data from Leptodactylus latrans. Ecological Indicators. 112, 106098(2020).
  29. MacCracken, J. G., Stebbings, J. L. Test of a body condition index with amphibians. Journal of Herpetology. 46 (3), 346-350 (2012).
  30. Brodeur, J. C., et al. Frog somatic indices: Importance of considering allometric scaling, relation with body condition and seasonal variation in the frog Leptodactylus latrans. Ecological Indicators. 116, 106496(2020).
  31. Carson, A. F., Hladik, L. C. Histotechnology: A Self-Instructional Text. , American Society for Clinical Pathology Press. Hong Kong. (2009).
  32. Bernet, D., Schmidt, H., Meier, W., Burkhardt-Holm, P., Wahli, T. Histopathology in fish: Proposal for a protocol to assess aquatic pollution. Journal of Fish Diseases. 22 (1), 25-34 (1999).
  33. Santos, L. R. D. S., Franco-Belussi, L., Zieri, R., Borges, R. E., de Oliveira, C. Effects of thermal stress on hepatic melanomacrophages of Eupemphix nattereri (Anura). Anatomical Record. 297 (5), 864-875 (2014).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. Aebi, H. Catalase in vitro. Methods in Enzymology. 105, 121-126 (1984).
  36. Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases: The first enzymatic step in mercapturic acid formation. Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
  37. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  38. Ellman, G. L., Courtney, K. D., Andres, V., Featherstone, R. M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology. 7 (2), 88-95 (1961).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  40. Pitarque, M., et al. Evaluation of DNA damage by the Comet assay in shoe workers exposed to toluene and other organic solvents. Mutation Research. 441 (1), 115-127 (1999).
  41. Nersesyan, A., Kundi, M., Atefie, K., Schulte-Hermann, R., Knasmuller, S. Effect of staining procedures on the results of micronucleus assays with exfoliated oral mucosa cells. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 15 (10), 1835-1840 (2006).
  42. Pérez-Iglesias, J. M., Brodeur, J. C., Larramendy, M. An imazethapyr-based herbicide formulation induces genotoxic, biochemical, and individual organizational effects. Leptodactylus latinasus tadpoles (Anura: Leptodactylidae). Environmental Science and Pollution Research. 27 (2), 2131-2143 (2020).
  43. Pérez-Iglesias, J. M., et al. Multiple level effects of imazethapyr on Leptodactylus latinasus (Anura) adult frogs. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 81 (3), 492-506 (2021).
  44. Pérez-Iglesias, J. M., et al. The genotoxic effects of the imidacloprid-based insecticide formulation Glacoxan Imida on Montevideo tree frog Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 104, 120-126 (2014).
  45. Jha, A. N. Ecotoxicological applications and significance of the comet assay. Mutagenesis. 23 (3), 207-221 (2008).
  46. Garber, J. C., Barbee, R. W., Bielitzki, J. T. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  47. Council, N.S.a.T.R. (Ed.). Reference Ethical Framework for Biomedical Research: Ethical Principles for Research with Laboratory, Farm, and Wild Animals. CONICET. , (2005).
  48. INTA. Guía para cuidado y uso de animales para experimentación. INTA. , Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Secretaría de Agricultura. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias, Ganadería, Pesca y Alimentación, República Argentina. (2008).
  49. Beliaeff, B., Burgeot, T. Integrated biomarker response: A useful tool for ecological risk assessment. Environmental Toxicology and Chemistry. 21 (6), 1316-1322 (2002).
  50. Pérez-Iglesias, J. M., Natale, G. S., Brodeur, J. C., Larramendy, M. L. Realistic scenarios of pesticide exposure alters multiple biomarkers in BOANA PULCHELLA (ANURA) adult frogs. Ecotoxicology. , (2023).
  51. Bassó, A., Devin, S., Peltzer, P. M., Attademo, A. M., Lajmanovich, R. C. The integrated biomarker response in three anuran species larvae at sublethal concentrations of cypermethrin, chlorpyrifos, glyphosate, and glufosinate-ammonium. Journal of Environmental Science, Part B. 57 (9), 687-696 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи