Анализ вытягивания в сочетании с коэкспрессией в клетках бактерий как эффективный по времени инструмент для тестирования сложных белково-белковых взаимодействий

Обычный вытягивание широко используется для изучения белково-белковых взаимодействий¹. Однако очищенные белки часто не взаимодействуют эффективно in vitro^2,3, а некоторые из них нерастворимы без своего партнера по связыванию ^4,5. Такие белки могут потребовать котрансляционной сборки или присутствия молекулярных шаперонов 5,6,7,8,9. Другим ограничением обычного вытягивания является тестирование возможной гетеромультимеризационной активности между доменами, которые могут существовать в виде стабильных гомоолигомеров, собранных котрансляционно ^8,10, поскольку многие из них не могут диссоциировать и повторно ассоциировать in vitro во время инкубации. Было обнаружено, что совместное выражение полезно для преодоления таких проблем ^3,11. Коэкспрессия с использованием совместимых векторов в бактериях была успешно использована для очистки больших мультисубъединичных макромолекулярных комплексов, включая поликомбный репрессивный комплекс PRC2¹², РНК-полимеразу II медиаторный головной модуль¹³, базовую пластину^{бактериофага Т4 14}, комплекс SAGA деубиквитинилазный модуль ^15,16 и ферритин¹⁷. Источниками репликации, обычно используемыми для совместной экспрессии, являются ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ и RSF²⁰. В коммерчески доступной системе экспрессии Duet эти источники сочетаются с различными генами устойчивости к антибиотикам и удобными несколькими сайтами клонирования для получения полицистронных векторов, позволяющих экспрессировать до восьми белков. Эти источники имеют разное количество копий и могут использоваться в различных комбинациях для достижения сбалансированных уровней экспрессии целевых белков²¹. Для проверки белок-белковых взаимодействий используются различные аффинные метки; наиболее распространенными являются 6xгистидин, глутатион-S-трансфераза (GST) и мальтозосвязывающий белок (MBP), каждый из которых имеет специфическое сродство к соответствующей смоле. GST и MBP также повышают растворимость и стабильность меченых белков²².

Также был разработан ряд методов, включающих коэкспрессию белка в эукариотических клетках, наиболее известным из которых является двухгибридный анализ дрожжей (Y2H)²³. Анализ Y2H дешев, прост и позволяет тестировать несколько взаимодействий; Однако его рабочий процесс занимает более 1 недели. Существует также несколько менее часто используемых анализов на основе клеток млекопитающих, например, флуоресцентный двухгибридный анализ (F2H)²⁴ и анализ белково-белкового взаимодействия клеточного массива (CAPPIA)²⁵. Анализ F2H является относительно быстрым, что позволяет наблюдать белковые взаимодействия в их родной клеточной среде, но требует использования дорогостоящего оборудования для визуализации. Все эти методы имеют преимущество перед прокариотической экспрессией, обеспечивая нативную эукариотическую среду трансляции и складывания; Однако они обнаруживают взаимодействие косвенно, либо путем активации транскрипции, либо путем флуоресцентного переноса энергии, что часто приводит к артефактам. Кроме того, эукариотические клетки могут содержать других партнеров по взаимодействию интересующих белков, что может мешать тестированию бинарных взаимодействий между белками высших эукариот.

В настоящем исследовании описывается метод бактериальной коэкспрессии дифференциально меченных белков с последующим использованием традиционных методов вытягивания. Метод позволяет изучать взаимодействия между белками-мишенями, требующими коэкспрессии. Он более эффективен по времени по сравнению с традиционным вытягиванием, позволяя проводить пакетное тестирование нескольких целей, что делает его выгодным в большинстве случаев. Коэкспрессия с использованием совместимых векторов более удобна, чем полицистронная коэкспрессия, поскольку не требует трудоемкого этапа клонирования.

Схематическое изображение рабочего процесса метода показано на рисунке 1.

1. Котрансформация кишечной палочки

1. Подготовьте векторы экспрессии для белков-мишеней, используя стандартные методы клонирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, хорошей отправной точкой является использование обычных векторов pGEX/pMAL, несущих ген резистентности к ампициллину и происхождение ColE1 для экспрессии белков, меченных GST/MBP, и совместимого вектора с происхождением p15A или RSF и резистентностью к канамицину для экспрессии белков, меченных 6xHis, в некоторых случаях в сочетании с тиоредоксином или SUMO-меткой для повышения растворимости. Обычно перед экспериментом необходимо протестировать несколько комбинаций тегов. Описанный метод сам по себе удобен для пакетного тестирования условий экспрессии белков-мишеней. Важно отметить, что большинство штаммов Rosetta уже содержат плазмиду с происхождением p15A для экспрессии тРНК для редких кодонов, поэтому, если использование таких штаммов является возможным вариантом, следует избегать плазмид p15A. Подробности см. в Таблице материалов .
   1. Выращивайте бактерии соответствующего штамма в среде Лурия-Бертани (LB) при температуре 37 °C до оптической плотности (OD) 0,1-0,2. Штамм BL21 (DE3) был использован в качестве примеров в этом исследовании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать свежеприготовленные компетентные клетки для достижения эффективного котрансформации с двумя векторами. Если необходимо сопреобразовать более двух векторов, лучше преобразовывать их последовательно, чтобы добиться хорошей эффективности преобразования. Хорошей альтернативой является электропорация.
   2. Центрифугу 1,0 мл бактериальной суспензии в течение 1 мин при 9000 x g при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
   3. Добавьте 0,5 мл ледяного буферного буфера трансформации (TB) (10 мМ MOPS [pH 6,7], 250 мМ KCl, 55 мМ MnCl₂ и 15 мМ CaCl2_{) и} инкубируйте в течение 10 минут на льду.
   4. Центрифугу в течение 30 с при 8 000 x g при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
   5. Добавьте 100 мкл буфера TB, добавьте по 100 нг каждого вектора и инкубируйте в течение 30 минут на льду. Отдельно преобразуйте одиночные векторы для изучения поведения белка без коэкспрессии. Кроме того, можно совместно преобразовывать векторы выражений в парах с пустыми векторами совместного выражения для неспецифических элементов управления привязкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В примерах, приведенных в этом исследовании, векторы pGEX/pMAL с соответствующими кДНК, слитыми с кДНК GST/MBP, использовались в сочетании с совместимыми векторами, полученными из pACYC, несущими кДНК, кодирующие белковые домены-партнеры, слитые с кДНК тиоредоксина.
   6. Нагрейте при температуре 42 °C в течение 150 с, затем охладите в течение 1 минуты на льду.
   7. Добавьте 1 мл жидкой среды LB без антибиотиков и инкубируйте при 37 ° C в течение 90 мин. Планшет на планшетах LB-агара, содержащий 0,5% глюкозы и соответствующие антибиотики (общие концентрации: 50 мг/л ампициллина; 20 мг/л канамицина; 50 мг/л стрептомицина; 35 мг/л хлорамфеникола). Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 °C.

2. Экспрессия

1. Промойте клетки из планшета 2 мл жидкой среды LB в 50 мл среды LB с соответствующими антибиотиками (общие концентрации: 50 мг / л ампициллина; 20 мг / л канамицина; 50 мг / л стрептомицина; 35 мг / л хлорамфеникола). Добавьте ионы металлов или другие известные кофакторы (в примерах, приведенных в этом исследовании, в_{среду добавляли} 0,2 мМ ZnCl2). Храните аликвоту с 20% глицерином при -70 °C для последующего повторения эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется промывать несколько колоний непосредственно с пластины, чтобы исключить возможность плохой экспрессии в одном изолированном клоне из-за случайных событий рекомбинации между двумя плазмидами.
2. Вырастите клетки при постоянном вращении 220 об/мин при 37 °C до OD 0,5-0,7, охладите до комнатной температуры (RT) и добавьте изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до 1 мМ. Храните аликвоту 20 мкл клеточной суспензии в качестве контроля неиндуцированного образца.
3. Инкубируйте клетки при постоянном вращении 220 об/мин при 18 °C в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время и температура инкубации могут варьироваться; 18 ° C в течение ночи лучше всего подходит для большинства белков, и рекомендуется попробовать по умолчанию. Сокращают время инкубации до 2-3 ч, если наблюдается сильное неспецифическое связывание.
4. Разделите бактериальную суспензию на две части (или более, если использовалось более двух разных меток) и храните аликвоту 20 мкл клеточной суспензии для подтверждения экспрессии белка. Центрифуга при 4 000 x g в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точка паузы: бактериальные гранулы можно хранить при температуре -70 °C не менее 6 месяцев.

3. Анализ вытягивания

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные процедуры описаны для белков, помеченных либо 6xHis, либо MBP/GST. Все процедуры проводятся при температуре 4°С.

1. Ресуспендируют бактериальные гранулы в 1 мл ледяного буфера для лизиса с ингибиторами протеазы и восстановителями (см. Ниже), добавленными непосредственно перед экспериментом. Избегайте дитиотрейтола (DTT) при использовании металл-хелатирующих смол, поскольку он удаляет ионы металлов. Отрегулируйте состав буфера для тестируемых белков. Распространенными рецептами буферов для лизиса, которые подходят для большинства белков, являются:
   1. 6xHis-pulldown: смешайте 30 мМ HEPES (pH 7,5), 400 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, 0,1% NP40, 10% [мас./мас.] глицерина, 5 мМ бета-меркаптоэтанола, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и разбавление коктейля ингибитора протеазы в соотношении 1:1000 (см. Таблицу материалов).
   2. GST- или MBP-pulldown: смешайте 20 мМ Tris (pH 7,5 при 25 °C), 150 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2, 0,1 мМ ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% [мас./мас.] глицерина, 5 мМ DTT, 1 мМ PMSF и разведение коктейля ингибитора протеазы в соотношении 1:1,000 (см. Таблицу материалов).
2. Разрушают клетки с помощью обработки ультразвуком на льду. Храните аликвоту 20 мкл для электрофореза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, на образец требуется 20-25 импульсов по 5 с с интервалом 15 с с выходной мощностью 20 Вт. Соответствующая мощность обработки ультразвуком должна быть отрегулирована для каждого прибора, чтобы избежать перегрева и обеспечить полное разрушение клеток. Для достижения лучшей производительности настоятельно рекомендуется использовать высокопроизводительные ультразвуковые зонды с несколькими наконечниками.
3. Центрифуга при 20 000 x g в течение 30 мин. Соберите 20 мкл осветленного лизата для последующего анализа SDS-PAGE.
4. Уравновесьте смолу (50 мкл для каждого образца) 1 мл ледяного буфера для лизиса в течение 10 мин, центрифугу при 2000 x g в течение 30 с и выбросьте надосадочную жидкость.
5. Добавьте клеточные лизаты (общая концентрация белка: 20-50 мг / мл) в смолу, инкубируйте в течение 10 мин при постоянном вращении 15 об / мин, центрифугу при 2000 x g в течение 30 с и выбросьте надосадочную жидкость. Соберите 20 мкл несвязанной фракции для последующего анализа SDS-PAGE.
6. Добавьте 1 мл ледяного буфера для стирки и выдерживайте в течение 1 минуты. Центрифугу при 2000 x g в течение 30 с и выбросьте надосадочную жидкость. Распространенные рецепты буферов для стирки:
   1. 6xHis-pulldown: смешайте 30 мМ HEPES (pH 7,5), 400 мМ NaCl, 30 мМ имидазола, 0,1% NP40, 10% глицерина и 5 мМ бета-меркаптоэтанола.
   2. GST- или MBP-pulldown: смешайте 20 мМ Tris (pH 7,5 при 25 °C), 500 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2, 0,1 мМ ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% глицерина и 5 мМ DTT.
7. Выполните две длительные стирки: добавьте 1 мл ледяного буфера для стирки, выдержите в течение 10-30 минут при постоянном вращении 15 об / мин, центрифугу при 2000 x g в течение 30 с и выбросьте надосадочную жидкость.
8. Добавьте 1 мл ледяного буфера для стирки, выдержите в течение 1 мин, центрифугу при 2000 x g в течение 30 с и выбросьте надосадочную жидкость.
9. Разбавляют связанные белки 50 мкл элюирующего буфера в шейкере при 1 200 об/мин в течение 10 мин. Распространенными рецептами элюирующих буферов являются:
   1. 6xHis-pulldown: смешайте 30 мМ HEPES (рН 7,5), 400 мМ NaCl, 300 мМ имидазола и 5 мМ бета-меркаптоэтанола.
   2. GST-pulldown: 20 мМ Tris (pH 7,5 при 25 °C), 150 мМ NaCl, 50 мМ глутатиона (с поправкой на pH 7,5 с базовым Tris) и 5 мМ DTT.
   3. MBP-pulldown: смешайте 20 мМ Tris (pH 7,5 при 25 °C), 150 мМ NaCl, 40 мМ мальтозы и 5 мМ DTT.
10. Проанализируйте элюированные белки с помощью SDS-PAGE.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процентное содержание акриламида должно быть скорректировано в соответствии с размером белков. В примерах, приведенных в этом исследовании, использовали 12% акриламидные гели, работающие в буфере трис-глицин-SDS (2 мМ Tris, 250 мМ глицина, 0,1% SDS) при постоянном напряжении 180 В. Гели окрашивали кипячением в 0,2% синем Кумасси R250, 10% уксусной кислотой и 30% изопропанолом и деокрашивали кипячением в 10% уксусной кислоте. Количество загруженного белка не должно быть равным, так как различные количества взаимодействующих белков могут быть вытянуты в разных экспериментах.

Описанный метод обычно использовался со многими различными целями. Здесь представлены некоторые репрезентативные результаты, которые, вероятно, не могут быть получены с использованием обычных методов вытягивания. Во-первых, это изучение димеризации специфического ZAD (домена, связанного с цинковым пальцем)11. ZAD образуют стабильные и специфические димеры, причем гетеродимеры возможны только между близкородственными доменами в паралогичных группах. Димеры, образованные этими доменами, стабильны и не диссоциируют в течение, по крайней мере, нескольких дней; таким образом, смешивание очищенных ZAD не приводит к обнаружению связывания. В то же время совместная экспрессия MBP и Thioredoxin-6xHis-слитых ZAD демонстрирует хорошую и воспроизводимую гомодимеризационную активность (рис. 2A), появляясь в качестве дополнительной полосы в результатах SDS-PAGE анализа MBP-pulldown. Небольшая часть гетеродимеров может быть замечена с M1BP, экспрессируемым совместно с другим доменом; это взаимодействие не было подтверждено с Y2A и, скорее всего, является результатом неспецифической ассоциации из-за высокой концентрации белка, поскольку эти домены богаты цистеином и чрезвычайно склонны к агрегации. Примечательно, что в этом случае 6xHis-pulldown неуместен, поскольку ZAD представляют собой металлокоординирующие домены, которые неспецифически связываются с металл-хелатирующей смолой. Такая деятельность должна быть тщательно изучена в параллельном эксперименте.

Другим примером является анализ конкуренции между белком ENY2 и его партнерами по связыванию Sgf11 (1-83aa) и доменом цинкового пальца (460-631 aa) белкаCTCF 26. При экспрессии в одиночку белок ENY2 образует димеры, которые препятствуют его взаимодействию с нативными партнерами по связыванию. Предположительно, белки Sgf11 и CTCF связываются с одной и той же молекулярной поверхностью ENY2, что делает их взаимодействие взаимоисключающим. В анализе коэкспрессии ENY2, помеченный 6xHis, взаимодействовал как с GST-меченым Sgf11, так и с MBP-CTCF, но GST-Sgf11 не присутствовал в MBP-pulldowns, и наоборот (рис. 2B). Эти результаты свидетельствуют о том, что тройной комплекс не может быть сформирован, и взаимодействия являются взаимоисключающими. Эти данные были независимо подтверждены другими анализами и подтверждают различные функциональные роли ENY2 в этих комплексах. Следует обратить внимание на то, что большие аффинити-метки могут сами по себе накладывать стерические помехи, препятствуя образованию комплексов; Поэтому вывод не должен основываться исключительно на данных о совместном выражении.

Пошаговое сравнение рабочих процессов обычных и связанных вытягиваний коэкспрессии показано на рисунке 3A. Совместное вытягивание, связанное с выражением, по крайней мере, в два раза эффективнее по времени, даже при небольшом количестве выборок, и обеспечивает хорошую масштабируемость. Результаты использования обоих методов для изучения одного и того же взаимодействия между доменом BTB белка CP190 (1-126aa) и помеченным GST C-концевым доменом (610-818aa) белка Drosophila CTCF (dCTCF) показаны на рисунке 3B. Оба метода показывают хорошую эффективность и воспроизводимость (анализы проводились в трех повторениях); в этом случае совместное вытягивание, связанное с экспрессией, показало более низкое неспецифическое связывание, как это видно в контрольных образцах только с белком GST.

Рисунок 1: Схематическое изображение протокола. На схеме показан рабочий процесс метода, использованный в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативные результаты . (A) Исследование гомодимеризации домена, ассоциированного с цинковым пальцем (ZAD), в анализах MBP- и 6xHis-pulldown. ZAD, слитые либо с MBP (40 кДа), либо с 6xHis-тиоредоксином (20 кДа), были коэкспрессированы в клетках бактерий и аффинно, очищены амилозной смолой (связывает белки, меченные MBP) или смолой Ni-NTA (связывает белки, меченные 6xHis). Совместно очищенные белки визуализировали с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием по Кумасси. Результаты MBP-pulldown показаны на верхних панелях, 6xHis-pulldown — на нижних панелях (используются только в качестве контроля экспрессии белка, поскольку многие ZAD неспецифически связываются с Ni-NTA). (B) Изучение взаимоисключающих взаимодействий между белками ENY2 и Sgf11/CTCF. Белки Sgf11 (1-81aa), цинковый палец, помеченный MBP, CTCF (460-631aa) и 6xHis-меченые белки ENY2 были совместно экспрессированы в различных комбинациях и аффинности, очищенных амилозной смолой, глутатионовой смолой (связывает белки, меченные GST) или смолой Ni-NTA. Совместно очищенные белки визуализировали с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием по Кумасси. Рисунок на панелях А и В был изменен с разрешения Bonchuk et al.11 и Bonchuk et al.26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Сравнение рабочих процессов обычных и связанных анализов вытягивания коэкспрессии. (A) Пошаговое сравнение требуемых временных интервалов в рабочем процессе обычного анализа вытягивания по сравнению с вытягиванием, связанным с совместным выражением. (B) Сравнение двух различных методов вытягивания при изучении взаимодействия между С-концевым доменом dCTCF (610-818aa) и доменом BTB белка CP190 (1-126aa) в анализах GST-pulldown. dCTCF (610-818aa), слитый с GST (25 кДа) или только GST, либо коэкспрессировался в клетках бактерий, либо инкубировался in vitro с тиоредоксином-6xHis-меченым CP190 BTB и аффинностью, очищенной глутатионовой смолой. Показаны три независимых повторения каждого анализа. Совместно очищенные белки визуализировали с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием по Кумасси. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.