Здесь мы описываем метод бактериальной коэкспрессии дифференциально меченных белков с использованием набора совместимых векторов, за которым следуют традиционные методы вытягивания для изучения белковых комплексов, которые не могут собираться in vitro.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ вытягивания в сочетании с коэкспрессией в клетках бактерий как эффективный по времени инструмент для тестирования сложных белково-белковых взаимодействий
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Pulldown - это простой и широко используемый анализ белково-белкового взаимодействия. Однако у него есть ограничения в изучении белковых комплексов, которые не собираются эффективно in vitro. Такие комплексы могут потребовать котрансляционной сборки и присутствия молекулярных шаперонов; Либо они образуют стабильные олигомеры, которые не могут диссоциировать и повторно ассоциировать in vitro , либо нестабильны без связывающего партнера. Чтобы преодолеть эти проблемы, можно использовать метод, основанный на бактериальной коэкспрессии дифференциально меченных белков с использованием набора совместимых векторов, за которыми следуют обычные методы вытягивания. Рабочий процесс более эффективен по времени по сравнению с традиционным вытягиванием, поскольку в нем отсутствуют трудоемкие этапы отдельной очистки взаимодействующих белков и их последующей инкубации. Другим преимуществом является более высокая воспроизводимость из-за значительно меньшего количества стадий и более короткого периода времени, в течение которого белки, существующие в среде in vitro , подвергаются протеолизу и окислению. Метод был успешно применен для изучения ряда белок-белковых взаимодействий, когда другие методы in vitro оказались непригодными. Метод может быть использован для пакетного тестирования белок-белковых взаимодействий. Показаны репрезентативные результаты исследований взаимодействий между доменом BTB и внутренне неупорядоченными белками, а также гетеродимеров доменов, связанных с цинковым пальцем.
Введение
Обычный вытягивание широко используется для изучения белково-белковых взаимодействий1. Однако очищенные белки часто не взаимодействуют эффективно in vitro2,3, а некоторые из них нерастворимы без своего партнера по связыванию 4,5. Такие белки могут потребовать котрансляционной сборки или присутствия молекулярных шаперонов 5,6,7,8,9. Другим ограничением обычног....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Схематическое изображение рабочего процесса метода показано на рисунке 1.
1. Котрансформация кишечной палочки
- Подготовьте векторы экспрессии для белков-мишеней, используя стандартные методы клонирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, хорошей отправной точкой является использование обычных векторов pGEX/pMAL, несущих ген резистентности к ампициллину и происхождение ColE1 для экспрессии белков, меченных GST/MBP, и совместимого вектора с происхождением p15A или RSF и резистентностью к канамицину для экспрессии белков, меченных 6xHis, в некоторых случаях в сочетании с тиоредоксином....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Описанный метод обычно использовался со многими различными целями. Здесь представлены некоторые репрезентативные результаты, которые, вероятно, не могут быть получены с использованием обычных методов вытягивания. Во-первых, это изучение димеризации специфического ZAD (домена, связанного с цинковым пальцем)11. ZAD образуют стабильные и специфические димеры, причем гетеродимеры возможны только между близкородственными доменами в паралогичных группах. Димеры, образованные этими доменами, стабильны и .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанный метод позволяет тестировать белок-белковые взаимодействия, которые не могут быть эффективно собраны in vitro и требуют коэкспрессии. Метод является одним из немногих подходящих подходов для изучения гетеродимеризирующих белков, которые также способны к гомодимеризации, так как при раздельной очистке такие белки образуют стабильные гомодимеры, которые чаще всего не могут диссоциировать и повторно ассоциироваться в ходе эксперимента 3,11.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке проектов РНФ 19-74-30026 (разработка и валидация метода) и 19-74-10099 (анализ белково-белкового взаимодействия); грант Министерства науки и высшего образования Российской Федерации 075-15-2019-1661 (анализ репрезентативных белок-белковых взаимодействий).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 8-элементный зонд | Sonics | 630-0586 | Высокопроизводительный 8-элементный ультразвуковой зонд |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Смола амилозы | New England Biolabs | E8021 | Смола для очистки белков с мечкой MBP |
| Антибиотики | AppliChem | A4789 (канамицин); A0839 (ампициллин) | |
| Бета-меркаптоэтанол | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Центрифуга | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Глутатион | AppliChem | A9782 | |
| Глутатион агарозный | Pierce | 16100 | Смола для очистки белков с маркировкой GST |
| Глицерин | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Смола для очистки белков с меткой 6xHis: |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Вектор для коэкспрессии белков с p15A репликации |
| происхождения pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Вектор для коэкспрессии белков с источником репликации CloDF13 |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Коктейль ингибиторов протеазы VII | Calbiochem | 539138 | Коктейль ингибиторов протеазы |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Вектор для коэкспрессии белков с началом репликации RSF |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 | Sonics | CV334 | Ультразвуковой жидкостный процессор |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
Ссылки
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
