Выделение и культивирование макрофагов, полученных из костного мозга у мышей

Моноциты и макрофаги являются мононуклеарными фагоцитами, которые могут быть получены от предшественников в костном мозге. Недавние исследования показали, что макрофаги также происходят из эритро-миелоидных предшественников, полученных из желточного мешка¹. Независимо от их происхождения, эти лейкоциты выполняют важные эффекторные функции в гомеостазе и воспалении ^2,3. Моноциты — это клетки периферической крови, которые в дальнейшем могут дифференцироваться в макрофаги в ткани ^2,4, тогда как макрофаги представляют собой гетерогенные клетки, которые демонстрируют фенотипы и функции, регулируемые местным воздействием факторов роста и цитокинов⁵. Поскольку макрофаги демонстрируют такое функциональное разнообразие, они были изучены на многих моделях заболеваний. Таким образом, культура макрофагов in vitro стала важным инструментом для понимания их физиологии и роли в различных заболеваниях. Костный мозг является важным источником клеток-предшественников, в том числе предшественников макрофагов, которые можно выделять и размножать, экспоненциально увеличивая количество получаемых макрофагов. Кроме того, макрофаги, полученные из костного мозга, особенно важны для того, чтобы избежать эффектов, генерируемых тканевым микроокружением, поскольку макрофаги изменяют свой фенотип в ответ на различные раздражители в тканях ^6,7. Предшественники костного мозга превращаются в макрофаги при воздействии макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF)⁸. Макрофаги, полученные из костного мозга, невозможно отличить от макрофагов, полученных из моноцитов, по биохимическим маркерам в тканях. Эти клетки представляют собой высокооднородную популяцию первичных клеток, которые во многих других отношениях сопоставимы с перитонеальными макрофагами ^6,9.

Из-за своего гетерогенного набора клеточных функций макрофаги уже давно тщательно изучены исследователями. Эти клетки могут быть использованы в различных экспериментальных моделях, в том числе при инфекционных и воспалительных заболеваниях, так как они участвуют в этих процессах^10,11. Они также могут быть полезны для исследования поляризации макрофагов в ответ на различные микроэкологические стимулы^12,13. Таким образом, здесь представлен простой и надежный протокол с целью получения большого количества первичных макрофагов из костного мозга мыши.

Этот протокол был выполнен в соответствии с Национальным советом по контролю за экспериментами на животных (Concea) и с одобрения Комитета по этике и использованию животных (CEUA). Мыши C57BL/6 были приобретены в Biotério Central Федерального университета Минас-Жерайс (UFMG), Белу-Оризонти, Бразилия. Средства индивидуальной защиты (СИЗ), такие как лабораторные халаты, перчатки и средства защиты глаз, должны использоваться на всех этапах, описанных в данном протоколе.

1. Получение надосадочной жидкости линии фибробластов L-929 в качестве источника М-КСФ

1. Разморозьте клетки линии фибробластов L-929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) и немедленно начните процесс культивирования для сохранения жизнеспособности.
2. В ламинарном проточном шкафу биобезопасности с помощью пипетки объемом 1000 мкл перенесите клетки линии фибробластов L-929 из флакона в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл.
3. С помощью серологической пипетки добавьте 50 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS), не содержащего кальция и магния.
4. Центрифуга при 300 x g, 4 °C в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
5. Ресуспендируйте гранулу в 20 мл модифицированной Eagle medium-F12 от Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1 мл пенициллина/стрептомицина (P/S) (DMEM/F12-10) с помощью серологической пипетки.
6. Перенесите ресуспендированные клетки в колбу для клеточных культур T75.
7. Инкубировать в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%_CO2 до полного слияния.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с колбой будьте осторожны, чтобы не намочить крышку раствором, так как это может стать источником загрязнения. Для получения удобного количества надосадочной жидкости необходимо реплицировать клетки после того, как они покроют всю поверхность колбы с клеточной культурой. Клетки L-929 ингибируются при контакте. Подогрейте раствор трипсина/этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), DMEM/F12-10 и стерильный PBS до 37 °C, чтобы начать экспансию клеточной культуры, как описано в следующих этапах.
8. Как только будет достигнуто полное слияние, выбросьте надосадочную жидкость из колбы для клеточных культур внутри шкафа биобезопасности с ламинарным потоком.
9. Промойте колбу с клеточными культурами 20 мл стерильного PBS с помощью серологической пипетки и выбросьте раствор.
10. Добавьте 10 мл трипсина/ЭДТА (0,05% раствора) в колбу для клеточных культур, содержащую адгезивные клетки.
11. Перенесите колбу с клеточной культурой из ламинарного потока в инкубатор с температурой 37°C и 5%_CO2 и инкубируйте в течение 3 минут.
12. Встряхните колбу с клеточными культурами, чтобы отделить клетки от поверхности колбы для культур, и используйте микроскоп, чтобы убедиться, что все клетки были диссоциированы.
13. Инактивируйте трипсин/ЭДТА (0,05% раствор) 10 мл среды DMEM/F12-10.
14. Перенесите раствор с помощью серологической пипетки в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл.
15. Центрифугировать при 300 x g при 4 °C в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
16. Суспендируйте гранулу в 10 мл среды DMEM/F12-10.
17. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в колбу для клеточных культур T175 (культура 1:10).
18. Повторите процедуру, чтобы получить десять колб для клеточных культур T175.
19. Добавьте по 50 мл DMEM/F12-10 в каждую колбу для клеточных культур.
20. Инкубировать в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%_CO2 до полного слияния.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги гарантируют 500 мл надосадочной жидкости L-929 клеток. На 5-й день, после того как клетки покроют поверхность колбы клеточной культуры Т175, надосадочная жидкость будет обогащена M-CSF и должна быть собрана¹⁴.
21. Извлеките колбу с клеточными культурами из инкубатора на 5-е сутки после контактного ингибирования.
22. Переложите среду в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл.
23. Центрифуга при 3 200 x g, при 4 °C в течение 10 мин.
24. Соберите надосадочную жидкость, обогащенную M-CSF, и переложите раствор в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл. Хранить в морозильной камере при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование чрезвычайно важно для удаления клеток и мусора из надосадочной жидкости.
25. Надосадочная жидкость L-929 является удобным и недорогим источником макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) и обычно содержит от 5 до 10 нг/мл M-CSF⁸. Эти надосадочные жидкости также содержат следовые количества других цитокинов и факторов роста, но они не оказывают глубокого влияния на физиологию макрофагов¹⁵. Тем не менее, очищенный M-CSF может быть приобретен и использован в качестве альтернативы надосадочной жидкости L-929 в концентрациях от 1 до 2 нг/^мл8.

2. Удаление бедренной и большеберцовой костей

1. Продолжить эвтаназию 8-недельного самца мыши дикого типа C57BL-6 путем вывиха шейки матки после удушья углекислым газом в соответствии с нормативной резолюцией No 18 Национального совета по экспериментам на животных (Concea) и с одобрения Комитета по этике и использованию животных (CEUA).
2. Смочите мышь в 70% растворе этанола и с помощью стерильных ножниц сделайте разрез на 1 см вдоль живота.
3. Снимайте кожу до тех пор, пока мышцы задних лап полностью не обнажаются.
4. Задние ноги уберите на уровне бедер, стараясь не сломать бедренную и большеберцовую кости.
5. Поместите задние ноги в коническую центрифужную пробирку с 70% раствором этанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте мышей, свободных от патогенов. Обязательно собирайте обе ноги, чтобы добиться большего количества клеток. Шаг 2 выполняется в нестерильной среде (настольной). Следовательно, важно аккуратно удалять бедренную и большеберцовую кости, чтобы они оставались неповрежденными, чтобы избежать бактериального загрязнения. Остальные этапы этой процедуры выполняются в ламинарном проточном шкафу биобезопасности. Время воздействия на ноги 70% раствора этанола должно быть ограничено 10 мин. Если время больше, могут быть поражены предшественники костного мозга.

3. Получить предшественников костного мозга из просвета большеберцовой и бедренной костей

1. Извлеките ноги из 70% раствора этанола и переложите их в стерильный PBS.
2. С помощью щипцов и дезинфицирующих салфеток удалите все мышцы и фасции. После этого шага косточка должна быть чистой.
3. Используйте стерильное лезвие хирургического скальпеля, чтобы разрезать костный эпифиз с обоих концов, чтобы обнажить костный мозг.
4. Наполните шприц объемом 20 мл 10 мл стерильного PBS с добавлением 2% раствора пенициллина/стрептомицина и подключите иглу 26 G.
5. Удерживайте кость с помощью анатомических рассекционных щипцов одной рукой, а другой вводите иглу в костную полость. Будьте осторожны, чтобы не раздавить кость щипцами.
6. Промойте внутреннюю часть кости с помощью PBS и соберите костный мозг в стерильную коническую центрифужную пробирку. После этого шага костная полость должна казаться белой.
7. Центрифугируйте собранные клетки в течение 10 мин при 300 x g при 4 °C.
8. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл DMEM/F12-10.
9. Гомогенизируйте и добавьте еще 9 мл среды DMEM/F12-10, чтобы довести общее количество клеток до 10 мл.

4. Культура макрофагов

1. Добавьте по 1 мл клеток-предшественников в каждую из круглых пластиковых чашек Петри размером 100 мм x 20 мм (всего 10 чашек), распределив клетки по планшетам с помощью пипетки для получения равномерного распределения. Не используйте посуду, обработанную культурой тканей.
2. Добавьте 9 мл DMEM/F12-10 с добавлением 20% надосадочной жидкости L-929 в каждую посуду.
3. Инкубировать в инкубаторе с температурой 37 °C, 5%_CO2 .
4. На^3-й день добавьте в каждую посуду по 10 мл среды DMEM/F12-10 с добавлением 20% надосадочной жидкости клеток L-929. Таким образом, чашки для культур теперь имеют в общей сложности 20 мл питательной среды, достаточную для роста клеток до конца их созревания.
   ПРИМЕЧАНИЯ: Не следует использовать чашки, обработанные тканевыми культурами, потому что макрофаги, как естественные адгезивные клетки, отмеченные сильным взаимодействием с поверхностями, не будут легко диссоциироваться с чашкой позже. Как правило, клеточные предшественники от одной мыши (двух бедренных костей) могут быть высажены в 10 культуральных чашах. Клеточные предшественники превратятся в макрофаги, которые можно использовать с 7 по 10 день инкубации. Подтверждение созревания определяется изменениями морфологии макрофагов. Зрелые макрофаги являются адгезивными и демонстрируют неоднородную морфологию, объясняемую эмиссией псевдоподий в разных направлениях. Примеры этих зрелых клеток показаны в репрезентативных результатах.

5. Сбор макрофагов

1. Откажитесь от надосадочной жидкости из всех блюд культуры.
2. Вымойте каждую чашку для посева 10 мл теплого (37 °C) стерильного Mg²⁺ и Ca²⁺ free PBS.
3. Слейте раствор с каждой посуды.
4. Предварительно подогрейте неферментативный раствор для диссоциации клеток до 37 °C и добавьте по 3 мл в каждую посуду. Инкубировать в течение 10 минут в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO₂ . Используйте инвертированный микроскоп, чтобы визуализировать, диссоциируют ли макрофаги от культуральных чашек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование пластиковых пластин, обработанных не тканевыми культурами, должно обеспечить легкую диссоциацию клеток и избежать необходимости соскабливать клетки с пластины.
5. Мойте посуду с помощью серологической пипетки с раствором для диссоциации неферментативных клеток снова и снова, выполняя круговые движения, чтобы убедиться, что все макрофаги диссоциированы от чашки.
6. Соберите раствор со всех чашек с культурой вместе в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
7. Добавьте 10 мл стерильного предварительно подогретого PBS в пустые формы для культуры и действуйте, как в пункте 5.4. Эта процедура является повторением шага 5.4 и призвана гарантировать сбор всех макрофагов.
8. Центрифуга при 300 x g, 4 °C в течение 10 минут.
9. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу с 1 мл DMEM/F12-10. Медленно и осторожно гомогенизируйте вверх и вниз с помощью пипетки, чтобы не повредить клетки.
10. Приготовьте аликвоту из 10 мкл раствора макрофага, разведенного с 10 мкл Трипана Синего для подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На 7-й день каждое блюдо будет производить примерно 2 x 10⁶ макрофагов. Это означает, что одна мышь может производить примерно 2 x 10⁷ первичных макрофагов при сборе в десять планшетов. Поскольку M-CSF только стимулирует созревание макрофагов, процедура гарантирует популяцию клеток, которая по существу является просто макрофагами и свободна от других загрязняющих лейкоцитов^.

Макрофаги – это крупные и сросшиеся клетки с особыми физиологическими характеристиками. Они демонстрируют разнообразие морфологических проявлений в культуре из-за способности прилипать к стеклу и пластику, а их типичная морфология распространения связана с эмиссией цитоплазматических расширений (рис. 1). Как только предшественники костного мозга подвергаются воздействию M-CSF из надосадочной жидкости клеток L-929 и начинают трансформацию в зрелые макрофаги, они становятся адгезивными к пластине Петри.

На рисунке 2 представлена кинетика трансформации предшественников костного мозга в зрелые макрофаги. На 3-й день появляется несколько незрелых макрофагов, большинство из которых имеют типичную круглую форму морфологии с небольшим количеством мембранных проекций (рис. 3). Несмотря на то, что они трансформируются на протяжении всего процесса, обычно требуется 7 дней для достижения достаточного количества и зрелости, чтобы гарантировать максимальную эффективность настоящего протокола.

Кроме того, макрофаги — это фагоциты (macro = большие; phagos = есть), способные фагоцитировать большое количество антигенных или неантигенных частиц. Фенотипически они характеризуются экспрессией поверхностных молекул F4/80 и CD11b. Анализ с помощью проточной цитометрии показывает, что макрофаги, полученные по настоящему протоколу, представляют собой однородную популяцию с точки зрения размера и зернистости (рис. 4). Кроме того, 100% популяции экспрессировали F4/80 и CD11b, образуя единую, четко определенную популяцию клеток. Кроме того, анализ фагоцитоза основных паразитов Leishmania показал огромную способность к фагоцитозу, доказав, что они являются зрелыми и хорошо дифференцированными макрофагами (рис. 5).

Микроскопические данные, представленные в данной работе, были получены с помощью флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии в Центре получения и обработки изображений (CAPI-ICB/UFMG).

Рисунок 1: Культура макрофагов, полученных из предшественников костного мозга, демонстрирующих различную морфологию при прикреплении к планшету, на 5-й день. Макрофаги выделяют длинные цитоплазматические расширения, которые позволяют им двигаться и фагоцитировать. Яркость и контрастность регулировались после получения изображений с помощью фильтра дифференциального интерференционного контраста (DIC) 20x. Бар = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Кинетика трансформации от предшественников костного мозга к зрелым макрофагам на 1, 3, 5 и 7 сутки. Яркость и контрастность корректировали после получения изображений с помощью фильтра DIC 20x. Бар = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Наличие слабо адгезивных незрелых макрофагов на 3-й день с типичной круглой морфологией с небольшим количеством мембранных проекций. Яркость и контрастность были отрегулированы после получения изображений с помощью фильтра DIC 20x. Бар = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Анализ макрофагов, полученных из костного мозга, методом проточной цитометрии. Макрофаги отделяли от тарелок (стриппер клеток) и окрашивали анти-F4/80 FITC и анти-CD11b PE-Cy7. (A) Аспект ячеек на основе размера и гранулярности (FSC x SSC). (B) Экспрессия клеточных маркеров F4/80 и CD11b. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Анализ флуоресцентной микроскопии после фагоцитоза основных паразитов Leishmania . Макрофаги отделялись от пластин и высаживались на круглые стеклянные покровные листы, к которым добавлялись основные паразиты Leishmania . На рисунке показаны фагоцитированные паразиты внутри макрофагов. Основных паразитов Leishmania окрашивали антителами FITC против Leishmania, а ядра клеток (макрофаги и Leishmania major) окрашивали йодидом пропидия. (А) в 20 раз; (В) 40x. Бар = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.