Методическая статья

Дифференцировка и визуализация коричневых адипоцитов из стромально-сосудистой фракции межлопаточной жировой ткани новорожденных мышей

DOI:

10.3791/64604

⸱

3 февраля 2023 г.

 ,  ,  , 
1Department of Nutrition, Diabetes and Metabolism, Pontificia Universidad Católica de Chile

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Преадипоциты выделяют из стромальной васкулярной фракции межлопаточной бурой жировой ткани новорожденных мышей и дифференцируют в клетки, которые накапливают липидные капли, экспрессируют молекулярные маркеры и демонстрируют митохондриальную морфологию зрелых коричневых адипоцитов. Эти клетки в дальнейшем анализируются с помощью иммунофлуоресценции и просвечивающей электронной микроскопии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бурая жировая ткань (BAT) присутствует только у млекопитающих и выполняет термогенную функцию. Коричневые адипоциты характеризуются многокамерной цитоплазмой с множественными липидными каплями, центральным ядром, высоким содержанием митохондрий и экспрессией разъединяющего белка 1 (UCP1). НИМ был предложен в качестве потенциальной терапевтической мишени для лечения ожирения и связанных с ним метаболических нарушений из-за его способности рассеивать метаболическую энергию в виде тепла. Для изучения функции и регуляции БАТ необходимо культивирование коричневых адипоцитов. Настоящий протокол оптимизирует обработку тканей и дифференцировку клеток для культивирования коричневых адипоцитов новорожденных мышей. Кроме того, показаны процедуры визуализации дифференцированных адипоцитов с помощью конфокальной иммунофлуоресценции и просвечивающей электронной микроскопии. В коричневых адипоцитах, дифференцированных с помощью описанных здесь методов, сохраняются основные определяющие черты классической БАТ, включая высокие уровни UCP1, увеличенную митохондриальную массу и очень тесный физический контакт между липидными каплями и митохондриями, что делает этот метод ценным инструментом для изучения БАТ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белая и бурая жировая ткань различаются по анатомическому расположению, клеточному происхождению, функции, морфологии и общей массе. Белая жировая ткань (WAT) является основным физиологическим резервуаром энергии организма и хранит большое количество триацилглицерина (TAG) в узкоспециализированных клетках, в которых одна гигантская липидная капля занимает большую часть их клеточного объема1. Липолиз ТАГ высвобождает свободные жирные кислоты, которые поступают в системный кровоток для удовлетворения энергетических потребностей во время голодания или других состояний отрицательного энергетического баланса. Кроме того, WAT выделяет белковые и липидные продукты, называемые адипокинами и липокинами соответственно, которые обладают метаболическими, иммунными и регулятивными функциями, что делает WAT самой большой эндокринной тканьюв организме.

Бурая жировая ткань (БАТ) – это гораздо меньший по размеру орган, основной физиологической функцией которого является недрожащий термогенез для предотвращения гипотермии. У мышей и новорожденных людей БАТ представляет собой четко определенный орган, расположенный в межлопаточном пространстве. У взрослых людей отсутствует межлопаточная БАТ (iBAT); тем не менее, они развивают кластеры коричневых адипоцитоподобных клеток, интегрированных в депо, которые в противном случае в основном составляют WAT. Эти адипоциты «коричневого в белом» (брит) имеют общие морфологические и молекулярные особенности с классическими адипоцитами iBAT, но имеют иное клеточное происхождение 3,4.

В отличие от белых адипоцитов, коричневые адипоциты имеют множественные мелкие липидные капли и обильные митохондрии5. Разъединяющий белок 1 (UCP1, также известный как термогенин) однозначно экспрессируется коричневыми и бритовыми адипоцитами и опосредует утечку протонов во внутренней митохондриальной мембране (IMM), тем самым отделяя транспорт электронов от синтеза АТФ и выработки тепла. Недрожащий термогенез при БАТ активируется норадреналином (НЭ), который высвобождается из симпатических окончаний в БАТ в ответ на холодовую стимуляцию6. NE связывается с бета-адренорецепторами (в основном бета-3) на поверхности коричневых адипоцитов и запускает внутриклеточный цАМФ-опосредованный сигнальный каскад. Это приводит к липолизу TAG, бета-окислению митохондриальных жирных кислот и выделению тепла при активации UCP13. Тесная функциональная связь между липидными каплями и митохондриями в коричневых адипоцитах имеет структурные параллели, такие как взаимодействие между этими органеллами в областях, которые являются большими и имеют очень тесный физический контакт 7,8.

iBAT имеет обильное количество кровеносных сосудов и симпатических окончаний9. Эти структуры, наряду с преадипоцитами, иммунными клетками, фибробластами и молекулами внеклеточного матрикса, составляют жировую стромальную васкулярную фракцию (SVF)10. Сообщалось, что многие протоколы генерируют зрелые адипоциты из преадипоцитов 11,12,13,14,15 (Дополнительная таблица 1); Тем не менее, они демонстрируют крайние различия в обработке тканей и составе культуральных сред для дифференцировки. Описанный в настоящем документе протокол позволяет осуществлять эффективную и воспроизводимую дифференцировку коричневых адипоцитов, которые (1) экспрессируют ключевые адипогенные факторы транскрипции пероксисомный рецептор, активируемый пролифератором гамма (PPARγ) и CCAAT/энхансер-связывающий белок альфа (C/EBPα), (2) экспрессируют зрелые маркеры адипоцитов перилипин1 (PLIN1) и кластерный детерминант 36 (CD36), (3) накапливают большое количество липидных капель, (4) имеют высокую митохондриальную массу и большое количество комплексов OXPHOS, (5) обладают термогенным потенциалом, определяемым высоким уровнем UCP1, и (6) имеют митохондриальные морфологические изменения, связанные с фенотипом зрелых коричневых адипоцитов. Данная методология используется для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе генерализованной липодистрофии 15,16,17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Папском католическом университете Чили. Для исследования были использованы новорожденные мыши P0.5 обоего пола, полученные на смешанном фоне линий C57BL/6J и 129J.

1. Экстракция тканей

  1. Очистите и продезинфицируйте верстак 70% раствором этанола, а также используйте стерильный хирургический материал.
  2. Усыпляйте новорожденных щенков P0,5 путем обезглавливания хирургическими ножницами в соответствии с утвержденным в учреждении протоколом.
  3. Поместите мышь в положение лежа (лицом вниз), а острыми ножницами сделайте надрез на коже длиной 1 см на среднем уровне спины животного. Аккуратно снимите кожицу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, потому что если кожа не будет хорошо удалена, она может порваться и повредить iBAT, что помешает оптимальному приготовлению SVF.
  4. Хирургическим путем отсоедините iBAT от тушки с помощью маленьких ножниц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: iBAT визуализируется в виде двух жировых долек, которые могут быть удалены независимо друг от друга.
  5. Соберите обе доли iBAT, используя плоскогубцы с изогнутым концом, чтобы удалить доли по отдельности.
  6. Поместите две доли в пластиковую пробирку с 1,5 мл стерильного PBS при комнатной температуре. Сохраняйте ткани в отдельных пробирках до тех пор, пока не будет завершено извлечение тканей для всех необходимых щенков.

2. Пищеварение тканей

  1. Аликвота 300 мкл коллагеназы II типа буфера для пищеварения (0,2% коллагеназа II типа в буфере [25 мМ KHCO3, 1,2 мМ MgSO4, 120 мМ NaCl, 5 мМ глюкоза, 12 мМ KH2PO4, 4,8 мМ KCl, 1,2 мМ CaCl2, 2,5% BSA и 1% пенициллин/стрептомицин при pH 7,4]) (Таблица 1) в пробирках по 1,5 мл в биобезопасном шкафу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте достаточное количество пробирок для количества отдельных тканей, которые необходимо извлечь. В настоящем исследовании было использовано семь трубок, что соответствует помету из семи детенышей.
  2. Переместитесь на скамью и поместите доли iBAT в буфер для пищеварения коллагеназы II типа, чтобы разрушить внеклеточный матрикс.
  3. Инкубируйте ткани iBAT в течение 45 минут при 37 °C с непрерывным легким встряхиванием при 800 об/мин (Рисунок 1).

3. Обработка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: После разложения выполните все следующие шаги в капюшоне для культуры тканей с ламинарным потоком класса II.

  1. Подготовьте и промаркируйте два набора пластиковых пробирок объемом 1,5 мл для каждого отдельного образца.
  2. Механически разрушайте тканевую суспензию в буфере для пищеварения коллагеназы II типа путем пипетирования вверх и вниз с помощью микропипетки P1000 и отфильтрованных наконечников. Используйте новый наконечник для каждого образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это критически важный шаг. Убедитесь, что вы механически дезагрегируете ткань наконечником и пипеткой вверх и вниз до тех пор, пока макроскопическая гомогенизация не будет завершена.
  3. Пропустите дезагрегированные ткани через отдельные клеточные фильтры размером 100 мкм (см. Таблицу материалов) в новые пробирки объемом 1,5 мл.
  4. Добавьте 500 μL буфера ACK (см. Таблицу материалов) к отфильтрованным образцам ткани, переверните пробирки 4-5 раз и инкубируйте при комнатной температуре в течение 4 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте время инкубации, так как это может повредить интересующие клетки.
  5. Центрифугируйте образцы тканей при давлении 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пробирку, и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл питательной среды (DMEM-F12 с 10% FBS, 1% антибиотическим антимикотиком, pH 7,2) (см. Таблицу материалов).
  7. Пропустите суспензии через клеточное сетчатое фильтр 40 мкм в новые пробирки объемом 1,5 мл с помощью микропипетки P1000 и отфильтрованных наконечников.
  8. Центрифугируйте образцы при давлении 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула соответствует преадипоцит-содержащей SVF.
  9. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув трубку, и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл питательной среды путем пипетирования.
  10. Приготовьте одну пробирку объемом 15 мл для каждого образца, добавив 5 мл питательной среды.
  11. Добавьте каждую ресуспендированную гранулу в соответствующую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл питательной среды. Переверните трубку 4-5 раз, чтобы перемешать содержимое клетки.
  12. Засейте каждый образец в шесть лунок 24-луночного культурального планшета, добавив 1 мл суспензии в каждую лунку (рис. 1).

4. Бактериологическое исследование стромально-васкулярной фракции (SVF)

  1. Меняйте питательную среду через день до тех пор, пока клетки не достигнут 100% слияния.
    Примечание: В течение этого периода удаляются непластичные адгезивные клетки, в результате чего получается первичная культура, обогащенная преадипоцит-содержащей SVF.
  2. Когда клетки станут на 100% сливающимися, удалите питательную среду и промойте клетки 800 мкл стерильного PBS.
  3. Добавьте 150 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА (см. Таблицу материалов) в каждую лунку и поместите культуральный планшет на 3 мин в инкубатор для отслоения клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ячейки отделены, с помощью фазово-контрастного светового микроскопа.
  4. Инактивируйте трипсин, добавив 850 мкл питательной среды в каждую лунку.
  5. Соберите клетки из шести лунок, засеянных на шаге 3.12, и перенесите их в пробирку объемом 15 мл.
  6. Доведите общий объем до 12 мл, добавив 6 мл питательной среды. Переверните трубку 4-5 раз, чтобы перемешать содержимое.
  7. Засейте по 1 мл образца в каждую лунку 12-луночного планшета. Меняйте питательную среду через день до тех пор, пока клетки не достигнут слияния.
  8. Когда клетки станут на 100% сливающимися, отделите их 150 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА, следуя тем же условиям инкубации, что и на шаге 4.3, и засейте их в соответствии с площадью поверхности лунки, необходимой для эксперимента.
  9. Выполните визуализацию с высоким разрешением после фиксации клеток после шага 8.
    Примечание: Для дальнейших экспериментов рекомендуется плотность 35 000 клеток/см² (экстракция белка и общей РНК, 330 000 клеток [одна лунка из 6-луночного планшета]; иммунофлуоресценция [IF], 10 500 клеток [одна лунка из 96-луночного планшета]).

5. Адипогенная дифференцировка

  1. Инкубируйте клетки с индукционной средой (DMEM-F12 с 10% FBS, 1% антимикотическим антибиотиком, pH 7,2, с добавлением 500 нМ дексаметазона, 125 нМ индометацина, 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина [IBMX], 5 мкМ росиглитазона, 1 нМ Т3 и 20 нМ инсулина) (Таблица 1) в течение 72 ч (день с 0 по день 2) (Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Питательную среду необходимо менять через день; Таким образом, первая смена среды должна произойти на 2-й день после первичной индукции.
  2. Смените поддерживающую среду (DMEM-F12 с 10% FBS, 1% антимикотическим антибиотиком, pH 7,2, с добавлением 5 мкМ росиглитазона, 1 нМ Т3 и 20 нМ инсулина) (Таблица 1) на 3-й день и поддерживайте эту поддерживающую среду до 7-го дня (Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживающую среду необходимо менять на 5-й и 7-й день. Мелкие липидные капли можно визуализировать с помощью фазово-контрастной микроскопии с 3-го дня дифференцировки. Крупные липидные капли заметны на 7-й день дифференцировки. Процедуры дифференцировки продолжительностью более 7 дней приводят к потере клеток в результате отслойки, вероятно, из-за высокой плавучести липидных клеток.

6. Получение клеточного гомогената

  1. Удалите питательную среду на 0-й и 7-й день дифференцировки и промойте клетки 3 раза стерильным PBS.
  2. После последней очистки добавьте в каждую лунку по 1,3 мл стерильного PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите ячейки во льду до очистки последней пластины.
  3. Механически соберите клетки из одной лунки 6-луночного планшета (~330 000 клеток) с помощью скребка для клеток и поместите клеточную суспензию в пробирку объемом 1,5 мл.
  4. Центрифугируйте образцы при давлении 2 800 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  5. Извлеките PBS с помощью микропипетки и держите трубки на льду.
  6. Ресуспендируйте клеточную гранулу в буфере RIPA с ингибиторами протеазы и фосфатазы (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 30 минут на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для лизации клеточной гранулы достаточно 70-80 μL.
  7. Центрифугируйте образцы при концентрации 21 000 x g в течение 15 минут при 4 °C.
  8. Осторожно извлеките надосадочную жидкость в пробирку объемом 1,5 мл и выбросьте гранулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Надосадочная жидкость представляет собой клеточный гомогенат.
  9. Определение концентрации белка клеточного гомогената с использованием бицинхониновой кислоты (БЦА) для колориметрического обнаружения и количественного определения общего белка18,19.

7. Вестерн-блоттинг

  1. Приготовьте 30 мкг клеточного гомогената (начиная с шага 6.8) и добавьте коммерчески доступный буфер загрузки образца SDS-PAGE (см. Таблицу материалов).
  2. Разрешают в полиакриламидном геле электрофорезом-SDS20 (PAGE-SDS) в соответствии с молекулярной массой каждого белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 10% PAGE-SDS для PPARγ, C/EBPα, PLIN1, CD36 и UCP1, 12% PAGE-SDS для OXPHOS и 15% PAGE-SDS для TOM20 (см. Таблицу материалов).
  3. Электроперенос белков на мембрану PVDF (см. Таблицу материалов) при давлении 350 мА в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контейнер для льда необходимо менять через 1 час. В течение всего процесса поддерживайте камеру на льду.
  4. Заблокируйте мембраны 5% BSA или обезжиренным молоком в трис-буферном физрастворе (TBS) 0,1% Tween 20 (TBS-T) на 2 часа, следуя рекомендациям из таблиц антител.
  5. Инкубируйте с первичными антителами (антитела, использованные в этом исследовании, подробно описаны в Таблице материалов) в течение ночи при температуре 4 °C.
    Примечание: Все антитела, использованные в этом исследовании, были разбавлены до соотношения 1:1000 в блокирующем растворе.
  6. Мембраны 3 раза промыть 0,1% TBS-T, и инкубировать их с конъюгированными вторичными антителами к пероксидазе хрена (HRP) (см. Таблицу материалов) в течение 2 ч при комнатной температуре.
  7. Промойте мембраны 3 раза по 0,1%. ТБС-Т. Выполните последнюю промывку 1x TBS. Храните мембраны в 1x TBS до визуализации. Рекомендуется хранить не более 1 часа.
  8. Визуализируйте мембраны с помощью хемилюминесценции20 или любым другим предпочтительным методом.

8. Визуализация с высоким разрешением

  1. Выполните иммунофлуоресцентный анализ, выполнив следующие действия.
    1. Посев и дифференцировка первичных культур коричневых преадипоцитов от новорожденных мышей Р0.5 (на следующем шаге 4.8) в 96-луночных планшетах с оптическим дном (см. таблицу материалов).
    2. Зафиксируйте клетки на 0-й день и 7-й день дифференцировки 4% PFA в течение 20 минут, и промойте 3 раза стерильным PBS.
    3. Пропитайте клетки 0,1% Triton X-100 в течение 15 мин и заблокируйте их 3% рыбьим желатином (см. Таблицу материалов) на 1 ч при комнатной температуре.
    4. Промойте 3 раза стерильным PBS и инкубируйте с антителом PLIN1 (1:400, см. Таблицу материалов) в 1% BSA/PBS в течение ночи при 4 °C во влажной камере.
    5. Промойте 3 раза стерильным PBS и инкубируйте с фторконъюгированными вторичными антителами в соотношении 1:1000 (1% BSA/PBS) (см. Таблицу материалов) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    6. Окрашивать ядра 1 мкг/мл Hoechst 33342 и липидные капли 1 мкг/мл BODIPY в течение 30 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные изображения были получены с помощью системы визуализации клеток (см. Таблицу материалов). В целом, было получено 9 или 16 фотографий на лунку с помощью двух-трех каналов с увеличением 20x.
  2. Проведите просвечивающую электронную микроскопию, выполнив следующие действия.
    1. Выращивайте и дифференцируйте коричневые преадипоциты в чашках для клеточных культур размером 35 мм x 10 мм.
    2. На 0-й и 7-й день дифференцировки удалить среду и зафиксировать клетки на 1 ч 2,5% глутаральдегидом в 0,1 М буфере какодилата натрия, pH 7,0 (см. Таблицу материалов).
    3. Промыть клетки 3 раза буфером из 0,05 М какодилата натрия в течение 10 мин и обработать их 1% водным тетраоксидом осмия (см. Таблицу материалов) в течение 15 мин.
    4. Ячейки 3 раза промыть бидистиллированной водой в течение 5 мин и обработать их 1% водным раствором уранилацетата (см. Таблицу материалов) в течение 15 мин.
    5. Обезвоживайте клетки с градиентом этанола 30%, 50%, 70%, 95% и 100% в течение 5 минут каждый раз.
    6. Предварительно заделайте элементы в соотношении эпон/этанол 1:1 на 30 минут, а затем в эпон на 1 час (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Включение клеток осуществляется непосредственно в чашке путем добавления свежего эпона для покрытия всего монослоя клеточной культуры. Дайте эпону полимеризоваться в духовке при температуре 60 °C в течение 24 часов.
    7. Погрузите чашку для клеточной культуры в жидкий азот на 2 мин, а затем разбейте ее плоскогубцами, чтобы разрыхлить пластиковые включения.
    8. Приклейте сегменты включения с ячейками к блоку смолы для получения тонких разрезов (80 нм) параллельно поверхности в ультрамикротоме (см. Таблицу материалов).
    9. Окрашивайте надрезы 1% водным раствором уранилацетата в течение 4 минут и цитратом свинца в течение 5 минут, согласно Reynolds et al.21.
    10. Визуализируйте сетки в электронном микроскопе (см. Таблицу материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Адипогенез регулируется сетью транскрипционных факторов, которые отвечают как за экспрессию ключевых белков, индуцирующих образование и функционирование коричневых адипоцитов22, включая классические адипогенные регуляторы, такие как PPARγ и C/EBPα 23,24,25, так и маркеры зрелых адипоцитов 26,27. Путем тестирования различных концентраций росиглитаз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол представляет собой простую и воспроизводимую процедуру двухфазной дифференцировки (рис. 2) для получения клеток с молекулярными и морфологическими характеристиками зрелых коричневых адипоцитов. Хирургическое извлечение iBAT является первым важным шагом, поскольку разрыв ткани серьезно ограничивает жизнеспособность исходного материала. Обработка тканей также имеет ключевое значение, потому что гомогенная клеточная суспензия, свободная от мусора, значительно увеличивает коли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование было предоставлено FONDECYT (1181214 и 1221146) и Anillos (ACT210039) венчурному капиталу, а докторские стипендии ANID 21171743 AMF и ANID 21150665 FS. Мы благодарим Алехандро Мунисагу за помощь в обработке образцов и технические консультации по просвечивающей электронной микроскопии. Иллюстрации были созданы с помощью BioRender.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x Трис/Глицин БуферBioRad1610734
16% параформальдегида Водный растворЭлектронная микроскопияНауки 15710
35 мм Обработанный TC Удобный для клеточных культур Falcon353001
3-изобутил-1-метилксантин (IBMX)Calbiochem410957
40% раствор акриламида/биса, 37,5:1BioRad1610148
6-луночный планшет SPL Медико-биологические науки -
96 лунок оптический черный с крышкой клеточной культуры стерильныйThermo Scientific165305
AccuRuler RGB Plus предварительно окрашенный протеиновый лестница Маэстроген02102-250
ACK лизирующий буфер GibcoA10492-01
Персульфат аммония BioRad1610700
Антибиотик-антимикотикGibco 
Anti-mouse IgG, HRP-связанные антителаCell Signaling7076
Anti-rabbit IgG, HRP-связанные антитела   Cell Signaling7074
Блокатор блоттинга BioRad170-6404
BODIPY 493/503 InvitrogenD3922
BSASigmaA1470
C/EBPα антителаCell Signaling2295
CaCl2Calbiochem 
CD36 антителоInvitrogenPA1-16813
Cell Siter 100 &микро; m, нейлонFalcon352360
Cell Sither 40 µ m, нейлонFalcon352340
Коллагеназа типа IIGibco17101-015
Цитирование 5 Многорежимный считывательклеток Biotek
Dexamethasone SigmaD4902
DMEM/F-12, порошокGibco12500062
EMBed-812 Набор для встраивания (Epon)Электронная микроскопияНауки 14120
Абсолютный этанолMerck 100983 
Фетальная бычья сыворотка Gibco16000-044
Желатин из холодноводной рыбьей кожиSigmaG7041
ГлюкозаGibco 15023-021
Глутаральдегид 25% водный растворЭлектронная микроскопия науки16210
Козье антикроличьи антитела IgG (H+L) с перекрестной адсорбцией, Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11012
Коктейль ингибиторов фосфатазы 100X Thermo Scientific78427
Коктейль ингибиторов протеазы Halt 100X Thermo Scientific78429
Hoechst 33258InvitrogenH1398
Мембрана иммуноблоттинга PVDF BioRad1620177
индометацин Сигма I7378 
Инсулин SigmaI3536
KClCalbiochem 
KH2PO4Calbiochem529568
KHCO3Sigma60339
Буфер для проб, уменьшающий маркеры полосы Thermo Scientific39000
MgSO4SigmaM2643
MilliQ для стерильной воды --Mitoprofile
Total OXPHOS Грызун Коктейль антител WB Abcam MS604
NaClMerck 
OmniPur  10x Жидкий концентрат PBSCalbiochem6505-OP
Тетраоксид осмия Электронная микроскопиянаук 19100
Антитело к перилипину 1Клеточная сигнализация9349
PPAR&гамма; (81B8)антитело Cell Signaling2443
RIPA буфер лизис Thermo Scientific89901
РосиглитазонMerck557366
бикарбонат натрия SigmaS5761
Натрий КацпдилатЭлектронная микроскопия Науки12300
Додецилсульфат натрия BioRad1610301
T3SigmaT6397
Talos F200C G2Thermo Scientific
TEMED BioRad1610800
TOM20 антителоCell Signaling42406
Tris Buffered Salt (TBS-10X)Cell Signaling12498
Triton X-100 Sigma93443
Трипсин-ЭДТА (0,25%)Gibco25200056
20 подростков, класс молекулярной биологииPromega H5152
UCP1 антителоКлеточная сигнализация14670
Ultracut RLeica 
УранилацетатЭлектронная микроскопия Науки22400
Westar Sun ЦианагенXLS063
Westar Supernova ЦианагенXLS3
15240062208291 изображений 5295521064041000

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
  2. Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 320 (3), 488-495 (2021).
  3. Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Frontiers in Bioscience. 16, 1233-1260 (2011).
  4. Rosenwald, M., Wolfrum, C. The origin and definition of brite versus white and classical brown adipocytes. Adipocyte. 3 (1), 4-9 (2014).
  5. Smorlesi, A., Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. The adipose organ: White-brown adipocyte plasticity and metabolic inflammation. Obesity Reviews. 13, Suppl 2 83-96 (2012).
  6. Townsend, K., Tseng, Y. -H. Brown adipose tissue: Recent insights into development, metabolic function and therapeutic potential. Adipocyte. 1 (1), 13-24 (2012).
  7. Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
  8. Benador, I. Y., Veliova, M., Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondria bound to lipid droplets: Where mitochondrial dynamics regulate lipid storage and utilization. Cell Metabolism. 29 (4), 827-835 (2019).
  9. Lee, P., Swarbrick, M. M., Ho, K. K. Brown adipose tissue in adult humans: A metabolic renaissance. Endocrine Reviews. 34 (3), 413-438 (2013).
  10. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  11. Klein, J., et al. Beta(3)-adrenergic stimulation differentially inhibits insulin signaling and decreases insulin-induced glucose uptake in brown adipocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (3), 34795-34802 (1999).
  12. Gaom, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
  13. Rocha, A. L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. A Method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes. Bio-protocol. 11 (24), 4265(2021).
  14. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).
  15. Tapia, P. J., et al. Absence of AGPAT2 impairs brown adipogenesis, increases IFN stimulated gene expression and alters mitochondrial morphology. Metabolism. 111, 154341(2020).
  16. González-Hódar, L., et al. Decreased caveolae in AGPAT2 lacking adipocytes is independent of changes in cholesterol or sphingolipid levels: A whole cell and plasma membrane lipidomic analysis of adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (9), 166167(2021).
  17. Fernández-Galilea, M., Tapia, P., Cautivo, K., Morselli, E., Cortés, V. A. AGPAT2 deficiency impairs adipogenic differentiation in primary cultured preadipocytes in a non-autophagy or apoptosis dependent mechanism. Biochemical and Biophysical Research Communications. 467 (1), 39-45 (2015).
  18. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  20. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  21. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
  22. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
  23. Ambele, M. A., Dhanraj, P., Giles, R., Pepper, M. S. Adipogenesis: A complex interplay of multiple molecular determinants and pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4283(2020).
  24. Lefterova, M. I., et al. PPARγ and C/EBP factors orchestrate adipocyte biology via adjacent binding on a genome-wide scale. Genes & Development. 22 (21), 2941-2952 (2008).
  25. Ntambi, J. M., Young-Cheul, K. Adipocyte differentiation and gene expression. The Journal of Nutrition. 130 (12), (2000).
  26. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16, 83(2017).
  27. Christiaens, V., Van Hul, M., Lijnen, H. R., Scroyen, I. CD36 promotes adipocyte differentiation and adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1820 (7), 949-956 (2012).
  28. Carobbio, S., Rosen, B., Vidal-Puig, A. Adipogenesis: New insights into brown adipose tissue differentiation. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (3), 75-85 (2013).
  29. Ricquier, D. Uncoupling protein 1 of brown adipocytes, the only uncoupler: A historical perspective. Frontiers in Endocrinology. 2, 85-91 (2011).
  30. Cui, L., Mirza, A. H., Zhang, S., Liang, B., Liu, P. Lipid droplets and mitochondria are anchored during brown adipocyte differentiation. Protein & Cell. 10 (12), 921-926 (2019).
  31. Hao, L., et al. Indomethacin enhances brown fat activity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 365 (3), 467-475 (2018).
  32. Lehmann, J. M., Lenhard, J. M., Oliver, B. B., Ringold, G. M., Kliewer, S. A. Peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma are activated by indomethacin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3406-3410 (1997).
  33. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  34. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1281-1289 (2004).
  35. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  36. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARgamma agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell Metabolism. 15 (3), 395-404 (2012).
  37. Merlin, J., et al. Rosiglitazone and a β3-adrenoceptor agonist are both required for functional browning of white adipocytes in culture. Frontiers in Endocrinology. 9, 249(2018).
  38. Fayyad, A. M., et al. Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).
  39. Zennaro, M. -C., et al. Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action. The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).
  40. Klaus, S., et al. Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression. Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).
  41. Guennoun, A., et al. Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype. Journal of Translational Medicine. 13, 135(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

UCP1

Похожие статьи