Применение проточной вермиметрии для количественной оценки и анализа микробиома кишечника Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegans является мощной моделью для изучения молекулярных детерминант, управляющих взаимодействием между хозяином и микробиомом. Мы представляем высокопроизводительный конвейер, профилирующий уровни колонизации микробиома кишечника у отдельных животных, а также ключевые аспекты физиологии C. elegans.

Abstract

Состав микробиома кишечника может оказывать существенное влияние на физиологию хозяина на протяжении всего развития и жизни животного. Измерение изменений состава микробиома имеет решающее значение для выявления функциональных взаимосвязей между этими физиологическими изменениями. Caenorhabditis elegans стал мощной системой хозяина для изучения молекулярных факторов взаимодействия микробиома хозяина. Благодаря прозрачному строению тела и флуоресцентным меткам естественных микробов, относительные уровни микробов в микробиоме кишечника отдельного животного C. elegans могут быть легко количественно определены с помощью большого сортировщика частиц. В этой статье мы опишем процедуры экспериментальной настройки микробиома, сбора и анализа популяций C. elegans на желаемой стадии жизни, эксплуатации и обслуживания сортировщика, а также статистического анализа полученных наборов данных. Мы также обсудим соображения по оптимизации настроек сортировщика на основе интересующих микробов, разработку эффективных стратегий стробирования для этапов жизни C. elegans и то, как использовать возможности сортировщика для обогащения популяций животных на основе состава микробиома кишечника. В рамках протокола будут представлены примеры потенциальных приложений, в том числе потенциал масштабируемости для приложений с высокой пропускной способностью.

Introduction

Эволюция животных находится под постоянным микробным влиянием¹. Из разнообразных микробов в окружающей среде животные-хозяева приобретают специфических^{партнеров2} , которые расширяют возможности хозяина и управляют его физиологией и восприимчивостью к болезням³. Например, метагеномный анализ микробиома кишечника выявил обогащенные метаболические классы микробных генов, которые могут обеспечить больший сбор и хранение энергии у мышей с ожирением⁴, многие из которых также обнаружены в микробиоме кишечника человека⁵. По-прежнему сущ....

Protocol

1. Приготовление смеси микробиома

1. Выдавите или выдавите бактерии из глицериновой морозильной камеры на тарелку для лизогенного бульона (LB) или соответствующую питательную среду и выращивайте в течение ночи при оптимальной температуре в зависимости от интересующих штаммов бактерий (обычно 25 °C для естественных микробов C. elegans ).
2. Используя одну колонию из каждого бактериального изолята (например, 12 бактерий из коллекции CeMbio) для посева 800 мкл среды LB в отдельные лунки глубоколунной пластины объемом 1 мл. Инкубируют в течение ночи при оптимальной температуре при встряхивании при 250 оборотах в минуту.
   ПРИМЕЧАНИ....

Results

Определение ворот популяции взрослых особей и личинок
Здесь синхронизированные C. elegans L1 выращивали на планшете NGM, засеянном E. coli OP50 (Eco), стандартной лабораторной диетой. Популяции C. elegans собирали для анализа ЛПС через 96 ч или 120 ч роста при 20 °C (рис. 2А). Точечная диаграмма вымирания (EXT, показатель плотности тела) и времени полета (TOF, величина длины тела) создает два визуально разделенных облака животных. Каждая точка п.......

Discussion

В нескольких исследованиях для характеристики генов и путей C. elegans против колонизации и токсичности патогенов использовалась проточная вермиметрия^21,22. Здесь представлен высокопроизводительный подход, который использует C. elegans для изучения того, как кишечные микробиомы модулируют физиологию своего хозяина. По сравнению с существующими методами, использующими колониеобразующие единицы (КОЕ) или секвенирование ампликонов ^16S рР.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Конические донные центрифужные трубки объемом 15 мл	VWR	10026-076
96 глубоколуночных планшетов (1 мл)	Axygen	P-DW-11-C
96 глубоколуночных планшетов (2 мл)	Axygen	P-DW-20-C
96-луночный Costar plate	Corning	3694
Агар	Millipore Sigma		Стандартный бактериологический агар также достаточен.
Аспирационный коллектор	V& P научный	VP1171A
Отбеливатель	Clorox
Отбеливатель раствор			Смешайте отбеливатель с 5М гипохлорит натрия 2:1 (v/v)
Многорежимный считыватель для визуализации клеток	Biotek	Cytation 5	Измерение бактериального OD
Центрифуга	Thermo scientific	Sorvall Legend XTR	Для 96 луночных планшетов и конических трубок
Флуоресцентный микроскоп	Nikon	TiE
ggplot: различные инструменты программирования R для построения графиков данных.	Пакет R	Версия 3.3.2
Автоподатчик крупных частиц	Union Biometrica	LP Sampler
Сортировщик больших частиц	Union Biometrica	COPAS Biosorter
Levamisole	Fisher	AC187870100
Lysogeny Broth (LB)	RPI	L24066	Стандартные домашние рецепты LB с использованием бактотриптона, экстракта дрожжей и NaCl также достаточный.
Решение M9			22 мМ KH2PO4 моноосновный, 42,3 мМ Na2HPO4, 85,6 мМ NaCl, 1 мМ MgSO4
нематодная среда	роста RPI	N81800-1000,0	1 мМ CaCl2, 25 мМ KPO4 pH 6,0, 1 мМ MgSO4 добавлен после автоклавирования.
RStudio	GNU	Версия 1.3.1093
Гипохлорит натрия	Sigma-Aldrich		5M NaOH
Стереомикроскоп	Nikon	SMZ745
Стерильные чашки Петри диаметром 10 см	Corning	351029
Стерильные 12-луночные планшеты	VWR	10062-894
Стерильные 24-луночные планшеты	VWR	10062-896
Стерильные чашки Петри диаметром 6 см	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787