Method Article

Применение проточной вермиметрии для количественной оценки и анализа микробиома кишечника Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/64605

⸱

March 31st, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans является мощной моделью для изучения молекулярных детерминант, управляющих взаимодействием между хозяином и микробиомом. Мы представляем высокопроизводительный конвейер, профилирующий уровни колонизации микробиома кишечника у отдельных животных, а также ключевые аспекты физиологии C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Состав микробиома кишечника может оказывать существенное влияние на физиологию хозяина на протяжении всего развития и жизни животного. Измерение изменений состава микробиома имеет решающее значение для выявления функциональных взаимосвязей между этими физиологическими изменениями. Caenorhabditis elegans стал мощной системой хозяина для изучения молекулярных факторов взаимодействия микробиома хозяина. Благодаря прозрачному строению тела и флуоресцентным меткам естественных микробов, относительные уровни микробов в микробиоме кишечника отдельного животного C. elegans могут быть легко количественно определены с помощью большого сортировщика частиц. В этой статье мы опишем процедуры экспериментальной настройки микробиома, сбора и анализа популяций C. elegans на желаемой стадии жизни, эксплуатации и обслуживания сортировщика, а также статистического анализа полученных наборов данных. Мы также обсудим соображения по оптимизации настроек сортировщика на основе интересующих микробов, разработку эффективных стратегий стробирования для этапов жизни C. elegans и то, как использовать возможности сортировщика для обогащения популяций животных на основе состава микробиома кишечника. В рамках протокола будут представлены примеры потенциальных приложений, в том числе потенциал масштабируемости для приложений с высокой пропускной способностью.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эволюция животных находится под постоянным микробным влиянием1. Из разнообразных микробов в окружающей среде животные-хозяева приобретают специфическихпартнеров2 , которые расширяют возможности хозяина и управляют его физиологией и восприимчивостью к болезням3. Например, метагеномный анализ микробиома кишечника выявил обогащенные метаболические классы микробных генов, которые могут обеспечить больший сбор и хранение энергии у мышей с ожирением4, многие из которых также обнаружены в микробиоме кишечника человека5. По-прежнему существует большая потребность в установлении причинно-следственных связей и определении молекулярных детерминант воздействия на микробиом, хотя прогресс затруднен из-за сложности микробиома и восприимчивости систем хозяев к широкомасштабному скринингу.

Модельный организм C. elegans обеспечивает платформу для углубления молекулярного понимания связей между микробиомом и физиологией хозяина. C. elegans обладает 20 клетками кишечника со слоем слизистой оболочки и ворсинчатыми структурами. Эти клетки оснащены многочисленными генами хеморецепторов, которые воспринимают микробные продукты и вырабатывают антимикробные молекулы, которые потенциально регулируют их кишечные колонизаторы. Эта консервативная биология C. elegans привела к огромному количеству открытий в области передачи сигналов хозяина, которые регулируют кишечные микробы, включая передачу сигналов инсулина, TGF-бета и MAP-киназу 8,9,10.

C. elegans используют микробы как пищу для роста во время развития и микробиом во взрослом возрасте. С возрастом некоторые микробы могут чрезмерно накапливаться в просвете кишечника, и отношения между хозяином и микробом смещаются от симбиоза к патогенезу11. В естественной среде обитания C. elegans встречает широкий спектр видов бактерий12,13. Секвенирование 16S рДНК из репрезентативных образцов, собранных в естественной среде обитания (гнилые плоды, стебли растений и животные переносчики), показало, что в природном микробиоме C. elegans доминируют четыре типа бактерий: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes и Actinobacteria. В пределах этих подразделений лежит большая вариативность в разнообразии и богатстве бактерий в зависимости от среды обитания12,13,14,15. Было создано несколько определенных сообществ, в том числе коллекции из 63 членов (BIGbiome)16 и 12 членов (CeMbio), представляющие ведущие роды микробиома, созданные для исследовательского сообщества C. elegans 17. Как микробиомы, так и компонентные штаммы могут оказывать различное влияние на физиологию C. elegans, например, на размер тела, скорость роста и реакцию на стресс 9,16,17. Эти исследования предоставляют ресурсы и примеры, позволяющие установить C. elegans в качестве модели для исследования микробиома.

Здесь представлен рабочий процесс, основанный на сортировщике больших частиц (LPS) (рис. 1), который использует систему C. elegans для одновременного измерения состава микробиома и основных показателей физиологии хозяина в масштабе популяции. С микробной стороны рабочий процесс адаптируется для сборки определенного микробиома или отдельных микробов для проверки надежности и пластичности сообщества с увеличением микробных взаимодействий. На стороне хозяина рабочий процесс позволяет проводить высокопроизводительные анализы для измерения уровней колонизации флуоресцентных микробов в микробиоме и физиологического считывания хозяина с точки зрения развития, размера тела и размножения. В совокупности модель микробиома C. elegans позволяет проводить высокопроизводительные скрининги для выявления метаболических и генетических детерминант, модулирующих физиологию хозяина.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление смеси микробиома

  1. Выдавите или выдавите бактерии из глицериновой морозильной камеры на тарелку для лизогенного бульона (LB) или соответствующую питательную среду и выращивайте в течение ночи при оптимальной температуре в зависимости от интересующих штаммов бактерий (обычно 25 °C для естественных микробов C. elegans ).
  2. Используя одну колонию из каждого бактериального изолята (например, 12 бактерий из коллекции CeMbio) для посева 800 мкл среды LB в отдельные лунки глубоколунной пластины объемом 1 мл. Инкубируют в течение ночи при оптимальной температуре при встряхивании при 250 оборотах в минуту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для использования с определенными естественными микробиомами (например, CeMbio), но может быть легко адаптирован для отдельных микробов путем роста в соответствующих условиях или других культуральных сосудов (пробирок).
  3. Оцените рост каждого микроба с помощью спектрофотометрии. Перенесите аликвоту 20 мкл на 80 мкл LB и добавьте раствор в прозрачную 96-луночную планшет с плоским дном. Измерьте наружный диаметр600 на считывателе пластин.
  4. После ночного выращивания центрифугируют глубоко луночный культуральный планшет при 4 000 x g в течение 10 мин, чтобы гранулировать бактерии и удалить надосадочную жидкость путем аспирации с помощью 96-луночного аспирационного коллектора или многоканальной пипетки.
  5. Используя значения OD 600, нормализуйте концентрацию каждого микроба до конечного OD600, равного 1,0, используя стерильную среду M9.
  6. При объединении микробов определите количество бактериальной культуры, необходимое для эксперимента, и создайте мастер-микс микробиома, объединив равные объемы каждого бактериального штамма в пробирку достаточного размера (например, пробирки по 5 мл или 15 мл).
  7. Нанесите 30-50 мкл микробов с окончательным наружным диаметром600 1,0 на центр каждой питательной среды нематоды (NGM) с агар-содержащей пластиной или лункой18. Дайте засеянному микробиому вырасти в течение ночи при оптимальной температуре (здесь 25 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее подготовьте пластины с агаром NGM в соответствии с инструкциями в Wormbook или используя предварительно смешанный порошок NGM18. Например, для 12-луночных планшетов добавляется 3 мл NGM, а для 24-луночных планшетов — 1,5 мл.

2. Подготовка синхронизированных C. elegans к росту на микробиоме

  1. Выращивайте около 100 червей на пластинах NGM (6 см в диаметре), засеянных Escherichia coli OP50, пока черви не достигнут зрелого возраста. Для целей этого протокола использовался штамм C. elegans N2, хотя протокол может быть легко адаптирован к другим штаммам нематод.
  2. Добавьте 6 мл буфера M9 (плюс 0,01% тритона X-100; M9-TX) на планшет, пипетируя вверх и вниз, чтобы смыть примерно 100 взрослых червей в коническую пробирку объемом 15 мл.
  3. Приготовьте свежеприготовленный раствор хлорной извести, смешав две части хлорной извести с одной частью 5 М NaOH.
  4. Центрифугируйте червей при 3 000 x g в течение 30 с, чтобы гранулировать червей. Аспирируйте, чтобы уменьшить объем до 4 мл, а затем добавьте 2 мл раствора отбеливателя.
  5. Плотно закройте крышку и встряхните тюбик. Наблюдайте за взрослыми червями в растворе под стереомикроскопом при 10-кратном увеличении. Когда взрослые тела начинают распадаться на части, обычно через 3,5 минуты, прекратите тряску и центрифугируйте при 3000 x g в течение 30 с.
  6. Отсасывайте пипеткой до минимального объема. Ресуспендировать, центрифугировать и аспирировать четыре раза в M9-TX, чтобы смыть отбеливатель.
  7. Ресуспендируйте в 4-6 мл M9-TX и поместите пробирку на ротатор на ночь, позволяя яйцам вылупиться и синхронизироваться на стадии L1.
  8. На следующий день возьмите из пробирки 10 мкл червей L1 в M9-TX и опустите их в чистую чашку Петри. Подсчитайте количество живых червей L1 под стереомикроскопом при 20-кратном общем увеличении.
  9. В зависимости от плотности L1 пипетку соответствующего объема, чтобы выбросить ~50 синхронизированных личинок L1 на край засеянных микробиомом планшетов NGM и инкубировать при 20 °C. Дайте червям расти до желаемого возраста (2 день или 3 день взрослой жизни).

3. Сбор популяции червей для анализа микробиома кишечника

  1. Смыть червей с бактериального газона 1-2 мл M9-TX в стерилизованную тарелку глубиной 2 мл на 96 лунок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для микробных штаммов, создающих значительные биопленки, встряхните планшет с жидкостью в течение 5 минут, чтобы разбить микробный мусор.
  2. Центрифугируйте глубоколуночную пластину при 300 x g в течение 1 мин, чтобы гранулировать червей, а затем удалите жидкость с помощью аспирационного коллектора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи могут использовать многоканальную пипетку для ручного удаления жидкости, если аспирационный коллектор недоступен. Следите за тем, чтобы наконечники пипеток не касались дна лунок, чтобы избежать потери образцов червей.
  3. Добавьте 1,8 мл M9-TX в каждую лунку глубоколуночного планшета с помощью многоканальной пипетки объемом 1,2 мл. Перемешайте, пипетируя вверх и вниз пару раз, и центрифугируйте при 300 x g в течение 1 минуты. Повторите этот шаг четыре раза, чтобы удалить бактерии из жидкости.
  4. После окончательной промывки доведите объем в каждой лунке до 100 мкл с помощью аспирационного коллектора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы отделить взрослых особей от личинок с помощью силы тяжести, оставьте тарелку на скамейке на 30-60 с, позволив взрослым червям опуститься на дно колодца. Затем аспирируйте пластину, чтобы удалить личинки из суспензии.
  5. Добавьте 100 мкл 10 мМ левамизола в M9-TX в каждую лунку и дайте червям парализоваться в течение 5 минут. После обработки левамизолом добавьте 4% раствора отбеливателя, описанного в шаге 2.3, в каждую лунку в течение 2 минут, чтобы уменьшить скопление бактерий, если это необходимо. После обработки отбеливателем дважды промыть с помощью M9-TX и после второй стирки отсосать до конечного объема 100 мкл.
  6. Переложите шнеки на плоскодонную 96-луночную пластину, содержащую 150 мкл 10 мМ левамизола в M9-TX. Поддерживайте плотность червей на уровне 50-100 на лунку и разделяйте червей на несколько лунок, если популяция слишком скучена.

4. Настройка сортировщика крупных частиц и автосамплера

  1. Включите воздушный компрессор, компьютер и прибор LPS. Проверьте и опорожните бак для отходов. Затем добавьте 500 мл отбеливателя в пустой резервуар для отходов. Проверьте и заправьте чехол и резервуары для воды, если объем недостаточен. Убедитесь, что узел флюидного и оптического сердечника (FOCA) 250 мкм установлен.
  2. Запустите контрольные частицы для контроля качества. Откройте программное обеспечение прибора LPS. В окне программного обеспечения установите флажок «Включить лазеры », чтобы включить лазеры с длиной волны 488 нм и 561 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.2-4.5 можно пропустить, если контрольные частицы были обработаны в течение предыдущих 2 недель и FOCA не изменялся за это время.
  3. Выберите «Настройка > управление частицами». Выберите Нет в запросе, чтобы перейти к настройкам по умолчанию. Перед каждым использованием вбейте контрольные частицы (10 мл dH, 2O и 10 мл контрольных частиц в коническую пробирку объемом 50 мл) и загрузите их в порт для образца.
  4. Когда все будет готово, нажмите «Получить », чтобы записать 500 событий. Убедитесь, что частота событий составляет от 15 до 30 событий в секунду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если частота событий не составляет 15–30 событий/с, следует обратиться к инженеру для настройки параметров машины.
  5. Исследуйте коэффициент вариации (CV) по всем параметрам. Если CV < 15%, проверка качества пройдена, и программное обеспечение LPS может быть закрыто. Если CV > 15%, запустите еще раз и настройте микрометры свежими контрольными частицами, чтобы выровнять лазер с проточной ячейкой.
  6. Подключите и включите автосамплер. Откройте программное обеспечение прибора автосамплера. Откроется автосамплер и программное обеспечение LPS. В окне программного обеспечения LPS перейдите в раздел File > New Experiment (Файл новый эксперимент), а затем File > New Sample (Файл новый образец). Установите флажок Включить лазеры, чтобы включить лазеры с длиной волны 488 нм и 561 нм, если это еще не было сделано.
  7. Создавайте шаблоны для точечных диаграмм сбора данных с использованием каналов времени пролета (TOF), экстинкции (EXT) и флуоресцентных каналов в окне программного обеспечения LPS. Хорошее начальное максимальное число для захвата всех червей составляет 8000 для TOF и EXT. Шкалы флуоресценции будут варьироваться в зависимости от каждого микроба. Включайте контрольные образцы червей, выращенных на нефлуоресцентных микробах (например, OP50), и каждый флуоресцентный микроб в отдельности (при смешивании микробов) в качестве контроля в каждом эксперименте.
    1. Щелкните правой кнопкой мыши в теле диаграммы, чтобы изменить масштабирование. Используйте контрольных животных, таких как взрослые особи 1-го дня или синхронизированные L1 (или интересующая популяция), чтобы помочь в выборе стробирования TOF и EXT.
  8. В окне автосамплера выберите Prime. Перейдите в раздел «Файл» > «Открыть сценарий», чтобы выбрать правильный встроенный сценарий, а затем нажмите «ОК».
    1. Только для анализа выберите скрипт с помощью Acquire. Для сортировки выберите скрипт с Дозированием. Для захвата с 96-луночных планшетов выберите скрипт с 96 лунками; Для получения данных с 384-луночных планшетов выберите скрипт с 384-луночным планшетом. Для объема образца (40 или 100 мкл) выберите сценарий с соответствующим объемом.
  9. Перейдите в раздел Plate Template (Шаблон пластины ) в меню программного обеспечения автосамплера, чтобы выбрать нужные лунки для анализа. Загрузите контрольные образцы. После того, как пластина загружена на столик автосамплера и закреплена, нажмите кнопку Run Plate в окне автосамплера. Сохраните файл при появлении запроса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные образцы и настройки могут быть выполнены с помощью конической пробирки объемом 50 мл на порте для образцов LPS перед присоединением пробоотборника LP.
  10. Когда сбор данных будет завершен, нажмите кнопку «Сохранить данные» на верхней ленте в окне программного обеспечения LPS и снова сохраните данные.

5. Анализ особенностей C. elegans и уровней микробиома кишечника у каждого животного

  1. Необработанные данные хранятся в трех типах файлов: .lmd, .bxr3, .txt. Загрузите текстовый файл с меткой .txt file в программу R для анализа. Выполните следующие действия в R19.
  2. Используйте пакет tidyverse20 в качестве основы для анализа.
  3. Используя функцию ggplot (включенную в tidyverse), постройте график данных LPS, используя значения TOF в качестве оси X и значения EXT в качестве оси Y. Обычный график покажет два облака точек. Убедитесь, что одна из них находится близко к началу координат и оси x, указывая на более мелкие частицы, такие как личинки и мелкий мусор, а вторая группа частиц находится в правом верхнем углу графика и представляет взрослых нематод.
  4. Используя эту группировку в качестве ориентира, выберите адекватные значения отсечения TOF и EXT. Стробирование может варьироваться в зависимости от штаммов C. elegans на разных микробах в зависимости от изменений в физиологии (например, темные и прозрачные животные или изменения в яйценоскости могут изменять коэффициенты EXT).
  5. Используйте подмножество функций для разделения взрослых особей и личинок с помощью стробирования TOF и EXT. В приведенном ниже примере используйте настройки TOF > 1,200 и EXT > 1,000 для ворот для взрослых животных.
  6. Анализ полученных наборов данных на предмет статистических различий; Для этого эксперимента используйте функцию t-критерия в R.
    1. Чтобы определить влияние микробиома на размер и оптическую плотность C. elegans, сравните значения TOF и EXT соответственно в разных условиях. TOF является показателем размера червя и может указывать на изменения в темпах роста животных в определенное время. Изменения EXT наиболее заметны в период между окончанием развития и взрослой жизнью из-за света, рассеянного яйцами, и могут быть использованы для оценки изменений в сроках этого перехода и плодовитости. Оцените долю и распределение потомства, если оно было сохранено во время анализов.
    2. Чтобы определить изменения в уровнях колонизации микробиома кишечника, сначала нормализуйте значения флуоресценции (например, красные или зеленые столбцы) путем деления на индивидуальные значения TOF для каждого животного. По мере того, как черви увеличиваются в размерах и становятся взрослыми, объем их кишечника также увеличивается. Нормализация помогает уменьшить количество артефактов, связанных с различиями в распределении размеров животных выборки. Используйте нормализованных животных для оценки изменений в колонизации микробиома кишечника в разных условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример необработанных данных и соответствующие скрипты R можно найти в Дополнительном файле 1 JOVE_worm_microbiome.txt и Дополнительном файле 2 JOVE_worm_microbiome.r. На рисунках 2 и 3 приведен репрезентативный пример анализа организма хозяина и микробиома с использованием двух флуоресцентных бактерий.

6. Сортировка животных C. elegans по признакам микробиома кишечника

  1. Соберите популяцию C. elegans , выращенную на микроорганизмах с флуоресцентными метками (например, RFP), как описано в шаге 3. Червей следует помещать в конические пробирки объемом 50 мл с минимум 5 мл образца. Стремитесь к примерно 2000 червей/мл, включая всех взрослых особей и потомство.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это также можно сделать в плоской 96-луночной пластине с помощью LP-сэмплера. Поддерживайте плотность червей на уровне 50–100 на лунку.
    1. Если использовался LP сэмплер, то выключите и отсоедините LP сэмплер. Перед сортировкой повторно подключите линии отбора проб и продувки к LPS.
  2. Откройте программное обеспечение LPS, перейдите в File > New Experiment, затем File > New Sample. Создайте точечную диаграмму с TOF по оси X и Extinction по оси y. Создайте еще одну точечную диаграмму с TOF на оси x и красным цветом на оси y. Используйте тот же масштаб оси и настройки лазера, что и ранее. Установите флажок Включить лазеры, чтобы включить лазеры с длиной волны 488 нм и 561 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если эти графики были созданы ранее, перейдите в Файл > Открыть эксперимент и Файл > Открыть образец, чтобы загрузить графики.
    1. Поместите пробирку с контрольным образцом в отверстие для образца. В диалоговом окне Приобретение/Выдача нажмите кнопку Приобретение. Сохраните файл при появлении запроса. После того, как будет измерено достаточное количество червей для различения популяций, нажмите кнопку Прервать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока должна составлять примерно 15–30 событий/с. Если нет, отрегулируйте концентрацию червей, чтобы убедиться, что отдельные животные анализируются или сортируются по капле. При ЛПС черви проходят по пути лазера в разных положениях (прямые, скрученные или изогнутые). Им может потребоваться разное количество времени для прохождения лазера и детектора в зависимости от их положения.
    2. На точечном графике TOF vs Extinction нарисуйте ворота вокруг взрослого населения. На графике TOF vs Red Dot нарисуйте ворота вокруг областей с высокими и низкими значениями красного цвета в качестве областей, представляющих интерес для взрослых червей с различными уровнями колонизации микробиома. Перейдите > Просмотр иерархии стробирования и убедитесь, что флуоресцентные вентили перечислены под воротами взрослой популяции. После оптимизации настроек перейдите в раздел Файл > Сохранить эксперимент и Файл > Сохранить образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном здесь примере отбираются животные на основе TOF/EXT гейтов для взрослых особей и сортируются по пулам, которые демонстрируют либо высокую, либо низкую колонизацию красными флуоресцентными белок-экспрессирующими бактериями. Тем не менее, любая комбинация параметров, измеренных с помощью LPS, может быть использована для идентификации интересующей популяции (популяций).
  3. Перед сортировкой убедитесь, что загружено соответствующее оборудование для сбора. Чтобы загрузить 96-луночный планшет на сборное устройство, выберите « Загрузить пластину А » > «Переместить» в разделе « Переместить стадию» диалогового окна «Получение/выдача», чтобы позволить этапу сбора переместиться в положение, подготовленное для загрузки 96-луночного планшета.
  4. Для оптовой сортировки выберите подходящий размер пробирки и нажмите «Переместить », чтобы загрузить коническую пробирку объемом 15 мл или 50 мл. В разделе «Сортировка» диалогового окна «Получение/выдача» выберите ворота сортировки из выпадающего списка созданных регионов. Введите количество объектов из заданной области для дозирования в сборную трубку, расположенную непосредственно под соплом проточной ячейки. Нажмите кнопку «Массовая сортировка » в диалоговом окне «Получить/Выдать».
  5. Для дозирования на 96-луночный планшет перейдите в раздел Настройка > планшетов > калиброванных планшетов > 96-луночных планшетов. Затем перейдите в View > Plate Template, выберите лунки, в которые будут сортироваться черви, введите количество объектов, которые будут отсортированы по каждой лунке, и выберите интересующие вас области стробирования. Если несколько закрытых регионов будут отсортированы в одну и ту же пластину, установите флажок Gate Each Well. Нажмите кнопку ОК, чтобы сохранить изменения.
  6. После того, как были назначены номера и местоположения сортировки, нажмите кнопку «Заполнить пластину» в диалоговом окне «Получить/Выдать», чтобы начать дозирование на 96-луночную пластину .
    1. Перед заполнением всей 96-луночной планшета выполните тестовую сортировку подмножества животных или контрольной группы в 96-луночную планшет и проанализируйте с помощью стереомикроскопа, чтобы убедиться, что соответствующее количество и желаемые популяции животных были отсортированы. После подтверждения правильности сортировки повторите шаги 6.3-6.6 для экспериментальных образцов. Нажмите кнопку «Сохранить данные» на верхней ленте в окне программного обеспечения LPS, чтобы снова сохранить данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все измерения (EXT, TOF, RFP, GFP и т.д.) также могут быть собраны для отсортированных животных и сравнены с теми, которые не были отсортированы. Это позволяет одновременно запускать режимы анализа и сортировки, если это необходимо.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определение ворот популяции взрослых особей и личинок
Здесь синхронизированные C. elegans L1 выращивали на планшете NGM, засеянном E. coli OP50 (Eco), стандартной лабораторной диетой. Популяции C. elegans собирали для анализа ЛПС через 96 ч или 120 ч роста при 20 °C (рис. 2А). Точечная диаграмма вымирания (EXT, показатель плотности тела) и времени полета (TOF, величина длины тела) создает два визуально разделенных облака животных. Каждая точка п...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нескольких исследованиях для характеристики генов и путей C. elegans против колонизации и токсичности патогенов использовалась проточная вермиметрия21,22. Здесь представлен высокопроизводительный подход, который использует C. elegans для изучения того, как кишечные микробиомы модулируют физиологию своего хозяина. По сравнению с существующими методами, использующими колониеобразующие единицы (КОЕ) или секвенирование ампликонов 16S рР...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами NIH DP2DK116645 (для B.S.S.), Dunn Foundation Pilot Award и грантом NASA 80NSSC22K0250 (для B.S.S.). Этот проект также был поддержан Центром цитометрии и сортировки клеток в Медицинском колледже Бэйлора при финансировании со стороны CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 и RR024574) и помощи Джоэла М. Седерстрома, а также гранта на инструментарий для гранта LPS NIH (S10 OD025251). Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется Управлением программ исследовательской инфраструктуры NIH (P40 OD010440).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Конические донные центрифужные трубки объемом 15 млVWR10026-076
96 глубоколуночных планшетов (1 мл)AxygenP-DW-11-C
96 глубоколуночных планшетов (2 мл)AxygenP-DW-20-C
96-луночный Costar plateCorning3694
АгарMillipore SigmaСтандартный бактериологический агар также достаточен.
Аспирационный коллекторV& P научныйVP1171A
ОтбеливательClorox
Отбеливатель раствор Смешайте отбеливатель с 5М гипохлорит натрия 2:1 (v/v)
Многорежимный считыватель для визуализации клетокBiotekCytation 5Измерение бактериального OD
ЦентрифугаThermo scientific Sorvall Legend XTRДля 96 луночных планшетов и конических трубок
Флуоресцентный микроскопNikonTiE
ggplot: различные инструменты программирования R для построения графиков данных.Пакет RВерсия 3.3.2
Автоподатчик крупных частицUnion BiometricaLP Sampler
Сортировщик больших частицUnion BiometricaCOPAS Biosorter
LevamisoleFisherAC187870100
Lysogeny Broth (LB)RPIL24066Стандартные домашние рецепты LB с использованием бактотриптона, экстракта дрожжей и NaCl также достаточный.
Решение M9 22 мМ KH2PO4 моноосновный, 42,3 мМ Na2HPO4, 85,6 мМ NaCl, 1 мМ MgSO4
нематодная средароста RPIN81800-1000,01 мМ CaCl2, 25 мМ KPO4 pH 6,0, 1 мМ MgSO4 добавлен после автоклавирования.
RStudioGNUВерсия 1.3.1093
Гипохлорит натрияSigma-Aldrich5M NaOH
СтереомикроскопNikonSMZ745
Стерильные чашки Петри диаметром 10 смCorning351029
Стерильные 12-луночные планшетыVWR10062-894
Стерильные 24-луночные планшетыVWR10062-896
Стерильные чашки Петри диаметром 6 смCorning351007
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
  3. Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
  4. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
  5. Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), New York, N.Y. 1355-1359 (2006).
  6. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).
  7. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
  8. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  9. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  10. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).
  11. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
  12. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  13. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38(2016).
  14. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  15. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).
  16. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  17. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), Bethesda, Md. 3025-3039 (2020).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
  19. R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
  20. Wickham, H., et al. tidyverse. , (2019).
  21. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).
  22. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090(2014).
  23. Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49(2012).
  24. Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
  25. Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877(2018).
  26. Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
  29. Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow VermimetryGut MicrobiomeCaenorhabditis ElegansMicrobiome QuantificationLarge Particle SorterFluorescent MicrobesGating StrategiesHigh Throughput AnalysisMicrobiome ColonizationHost Microbe Interactions

Related Articles