Методическая статья

Быстрый, простой и стандартизированный метод гомогенизации для получения антигенных / адъювантных эмульсий для индуцирования экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

DOI:

10.3791/64634

⸱

9 декабря 2022 г.

1The Rausing Laboratory, Autoimmunity Section, Division of Neurosurgery, Department of Clinical Sciences, Lund University, 2Department of Autoimmunity, BTB Emulsions

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы вызвать экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, животную модель рассеянного склероза, мышей иммунизируют эмульсией «вода в масле», содержащей аутоантиген и полный адъювант Фройнда. Хотя для приготовления этих эмульсий существует несколько протоколов, здесь представлен быстрый, простой и стандартизированный протокол гомогенизации для получения эмульсии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) имеет сходные иммунологические и клинические особенности с рассеянным склерозом (РС) и поэтому широко используется в качестве модели для определения новых лекарственных мишеней для лучшего лечения пациентов. РС характеризуется несколькими различными течениями заболевания: рецидивирующе-ремиттирующий РС (РРМС), первично-прогрессирующий РС (ППМС), вторичный прогрессирующий РС (СПМС) и редкая прогрессирующая рецидивирующая форма РС (ПРМС). Хотя животные модели не точно имитируют все эти контрастные фенотипы заболеваний человека, существуют модели EAE, которые отражают некоторые из различных клинических проявлений РС. Например, миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин (MOG), индуцированный EAE у мышей C57BL/6J, имитирует человеческую PPMS, в то время как миелиновый протеолипидный белок (PLP), индуцированный EAE у мышей SJL / J, напоминает RRMS. Другие аутоантигены, такие как основной белок миелина (MBP), и ряд различных штаммов мышей также используются для изучения EAE. Чтобы вызвать заболевание в этих аутоантигенно-иммунизационных моделях EAE, готовят эмульсию «вода в масле» и вводят подкожно. Большинство моделей EAE также требуют инъекции коклюшного токсина для развития заболевания. Для последовательной и воспроизводимой индукции EAE необходим подробный протокол подготовки реагентов к получению эмульсий антигена/адъюванта. Метод, описанный здесь, использует преимущества стандартизированного метода для получения эмульсий «вода в масле». Он прост и быстр и использует встряхивающий гомогенизатор вместо шприцев для приготовления эмульсий с контролируемым качеством.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нарушение иммунологической толерантности может привести к генерации аутоиммунных расстройств, таких как рассеянный склероз (РС). По оценкам, 2,8 миллиона человек живут с РС во всем мире1. Хотя точная причина РС до сих пор в значительной степени неизвестна, дисрегуляция аутореактивных Т- и В-клеток, а также дефекты функции Treg играют важную роль в патогенезе заболевания 2,3.

Животные модели аутоиммунных заболеваний являются важными инструментами для исследования потенциальных терапевтических методов. Экспериментальная модель аутоиммунного энцефаломиелита (EAE) используется в течение почти столетия исследователями, заинтересованными в MS4. В ранних экспериментах заболеваемость была относительно низкой. Введение полного адъюванта Фройнда (CFA), содержащего микобактерии и токсин коклюша, позволило последовательно индукционировать EAE у мышей4. Самое главное, необходимо смешать CFA с антигеном, специфичным для центральной нервной системы (ЦНС), чтобы получить однородную эмульсию «вода в масле» для индуцирования EAE. Наиболее распространенные в настоящее время модели EAE основаны на активной иммунизации мышей энцефалогенными пептидами. Генетический фон мышей играет важную роль в восприимчивости к заболеванию, причем пептиды миелин-олигодендроцитарных гликопротеинов (MOG35-55) и протеолипидного белка миелина (PLP139-151) используются для индуцирования EAE у мышей C57BL/6J и SJL соответственно5. Тем не менее, другие мышиные штаммы и пептиды, полученные из ЦНС, также могут быть использованы.

Качество CFA/пептидной эмульсии является критическим фактором, определяющим пенетрантность заболевания в активной иммунизации EAE model6. Гомогенная эмульсия «вода в масле» должна быть получена путем смешивания энцефалтогенных пептидов, растворенных в водном буфере с CFA, иначе у животных не разовьется болезнь. Были опубликованы многочисленные протоколы по приготовлению CFA/пептидных эмульсий. Примеры включают использование вихря7, обработки ультразвуком8, шприцев и трехстороннего Т-образного разъема9 или одного шприца только5. Однако все эти методы трудно стандартизировать и часто связаны с длинными и сложными протоколами.

По сравнению со всеми вышеперечисленными методами, простой метод, описанный здесь для приготовления эмульсии, предлагает преимущества отсутствия различий между людьми и относительно быстроты. Эмульсия генерируется гомогенизатором, встряхивающим реагенты с заданной скоростью, временем и температурой, обеспечивая быстрые и последовательные результаты. В дополнение к индуцированию заболевания в модели EAE, этот метод также может быть использован для изучения других моделей аутоиммунных заболеваний, таких как коллаген-индуцированный артрит (CIA) и антиген-индуцированный артрит (AIA)6. Поэтому предполагается, что этот метод может быть использован для последовательного индуцирования заболевания на других животных моделях, которые зависят от эмульсий «вода в масле» с аутоантигенами, таких как экспериментальный аутоиммунный неврит (EAN)10, экспериментальный аутоиммунный тиреоидит (EAT)11, аутоиммунный увеит (EAU)12 и миастения (MG)13. Этот метод также вызывает общие иммунные реакции, такие как гиперчувствительность замедленного типа (DTH) последовательно6, и поэтому может быть использован для доставки противораковых и малярийных вакцин (см. обсуждение).

Таким образом, разработан и представлен здесь быстрый (общее время приготовления ~30 мин), простой (все реагенты могут быть приготовлены заранее и сохранены) и стандартизированный (эмульсия осуществляется с помощью встряхивающего гомогенизатора) способ. Эмульсии CFA/антигена, приготовленные с использованием этого протокола, последовательно индуцируют заболевание на аутоиммунных животных моделях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с практикой Шведского совета по исследованиям животных и были одобрены Комитетом по этике животных, Лунд-Мальмё, Швеция (номер разрешения: M126-16).

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематический поток метода описан на рисунке 1.

1. Подготовка материала

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все реагенты асептически в стерильной вытяжке, а также аликвотируйте и храните при указанной температуре. Реагенты могут храниться до 2 лет без потери эффекта.

  1. Приготовьте CFA, содержащий 20 мг/мл Mycobacterium tuberculosis , как описано ниже.
    1. Добавьте 100 мг сублимированного M. tuberculosis H37RA (см. Таблицу материалов) и пять стальных шариков толщиной 3,2 мм в трубку объемом 7 мл (см. Таблицу материалов). Встряхните трубку в гомогенизаторе (см. Таблицу материалов) в течение 60 с при максимальной скорости (5 000 об/мин).
    2. Добавьте 5 мл неполного адъюванта Фройнда (IFA) в трубку и снова встряхните в течение 60 с на самой высокой скорости. Переложите суспензию гомогенизированного M. tuberculosis в IFA (теперь называемой CFA) в свежий тюбик с пипеткой, оставив бусины, и храните при 4 °C до использования.
  2. Добавьте сверхчистую воду в лиофилизированный порошок пептида MOG35-55 (см. Таблицу материалов) для получения конечной концентрации пептида 10 мг/мл. Стерилизуйте раствор, пропуская его через фильтр 0,2 мкм. Приготовьте 60 мкл аликвот и храните при -20 °C до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пептид MOG35-55 , используемый для этого эксперимента, имеет чистоту ImmunoGrade (~ 70%), расщепляется TFA, легко растворяется в воде и содержит C-концевой амид (-NH2) для повышения стабильности in vivo 14. Пептидные аликвоты никогда не размораживали и повторно замораживали более двух раз и хранили при -20 °C до использования.
  3. Приготовьте 100 мл буфера коклюшного токсина: растворите 2,9 г NaCl в 80 мл 1x Ca2 +/Mg2+ свободного PBS и добавьте 100 мкл 10% Triton X-100. Отрегулируйте объем до 100 мл с помощью PBS и стерилизуйте раствор, пропуская его через фильтр 0,2 мкм. Приготовьте 10 мл аликвот и храните при 4 °C до использования.

2. Получение CFA/пептидных эмульсий

  1. Рассчитайте количество эмульсии, необходимое для иммунизации. В этом стандартном протоколе каждая мышь получает 50 мкг пептида MOG35-55 и 300 мкг M. tuberculosis , рассеянного в адъюванте Фройнда (CFA). Количество каждого реагента (пептид MOG35-55 , PBS, CFA и IFA), необходимое для получения эмульсий, может быть рассчитано с использованием дополнительного файла 1. В расчет включается дополнительно 20% всех реагентов, чтобы компенсировать небольшие потери эмульсии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческий набор эмульсий (см. Таблицу материалов), используемый в данном исследовании, включает трубку, винтовой колпачок и плунжер в стерилизованном мешочке. Каждая трубка эмульсионного набора вмещает максимум 9,6 мл, что позволяет приготовить шприцы размером 8 х 1 мл, достаточные для иммунизации 40 мышей (или 80 мышей при использовании 100 мкл эмульсии на животное).
  2. Поместите завинчивающуюся трубку (из коммерческого эмульсионного комплекта) и реагенты для использования на льду.
  3. Добавьте компоненты эмульсии в следующем порядке в объемах, рассчитанных на этапе 2.1: PBS, затем пептид, затем M. tuberculosis в CFA и, наконец, IFA.
  4. Плотно закройте трубку колпачком, затянув и ослабив ее несколько раз. Энергично встряхните тюбик в течение 5-10 с вручную, чтобы предварительно перемешать реагенты.
  5. Поместите трубку в встряхивающий гомогенизатор и закрепите ее стержнем. Установите скорость на самую высокую настройку, а время на 60 с. Как только пробег закончится, поместите трубку на лед на 3 минуты. Повторите запуск еще один или два раза с теми же настройками.
  6. Центрифугируйте трубку при 300 х г в течение 1 мин, чтобы удалить захваченный воздух и уплотнить эмульсию.
  7. Снимите колпачок с трубки, вставьте поршень в трубку и медленно толкайте его вниз, пока он не достигнет верхней части эмульсии. Снимите застежку-защелку в нижней части трубки, скручив ее.
  8. Извлеките плунжер из инжекционного шприца (1 мл; см. Таблицу материалов). Добавьте иглу (предпочтительно 25-27 г) к инъекционному шприцу.
  9. Прикрепите задний конец инжекторного шприца к специальному замку в нижней части трубки и зафиксируйте его коротким поворотом.
  10. Перенесите эмульсию из трубки в шприц для инъекций, осторожно толкнув плунжер. Прекращается, когда эмульсия достигает градуировки 0,15 мл инъекционного шприца.
  11. Отделите инжекционный шприц от трубки и осторожно вставьте поршень, следя за тем, чтобы воздух не попадал в шприц. Толкайте плунжер до тех пор, пока эмульсия не выйдет из иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе часть эмульсии может быть использована для контроля качества (см. шаг 3).
  12. Повторите шаги 2.8-2.11 для остальной части эмульсии, присутствующей в трубке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму отходы дорогостоящих эмульсий CFA/антигена, следует использовать шприцы объемом 1 мл. Могут использоваться другие шприцы, которые подходят к специальному замку в нижней части трубки; однако, возможно, потребуется приготовить больший объем эмульсии. Пептидная эмульсия CFA/MOG35-55 может храниться при температуре 4 °C до 15 недель без потери своей способности, индуцирующей EAE.

3. Контроль качества эмульсии

  1. Испытание на каплю: Добавьте небольшую каплю эмульсии в стерильную коническую трубку объемом 50 мл, заполненную 20 мл холодной воды. Закройте трубку и встряхните ее вручную на пару секунд. Появление крошечных отчетливых капель подтверждает образование эмульсии «вода в масле».
  2. Исследуйте эмульсию с помощью фазово-контрастной микроскопии.
    1. Чтобы проанализировать размер частиц воды в масле, добавьте крошечную каплю (2-3 мкл) эмульсии на предметное стекло микроскопа, смажьте ее с помощью крышки, а затем сильно надавите круговыми движениями, чтобы сгладить эмульсию.
    2. Исследуйте смазанную эмульсию под фазово-контрастным микроскопом (см. Таблицу материалов) с 400-кратным увеличением и фокусируйтесь на поле с монослоем эмульсии. Убедитесь, что видны мелкие однородные серо-белые частицы (рисунок 2A).
  3. Анализируйте размер частиц эмульсии с помощью лазерной дифракции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерная дифракция измеряет распределение частиц по размерам с помощью лазерного луча. Это окончательный тест контроля качества эмульсий. Репрезентативный результат распределения частиц по размерам с использованием метода, описанного здесь, показан на рисунке 2B (подробное описание см. в Topping et al.6). Тем не менее, тест на падение и микроскопическое исследование достаточны для проверки того, была ли сформирована удовлетворительная эмульсия.
    1. Установите показатели преломления как для красных, так и для синих лазеров для диспергатора (см. Таблицу материалов) на 1,456 и для образца на 1,33 на анализаторе размера частиц (см. Таблицу материалов). Установите коэффициент поглощения преломления равным 0,02.
    2. Добавьте одну каплю из шприца, содержащего пептидную эмульсию, в дисперсионную установку, содержащую легкое минеральное масло. Начните сбор данных сразу после дисперсии эмульсии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки распределения частиц по размерам применялась модель общего назначения и предполагались сферические частицы.

4. Индукция EAE с использованием пептидной эмульсии MOG 35-55 у мышей C57BL6/J

ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех экспериментах использовались пять 8-12-недельных самок мышей C57BL6/J.

  1. Перед иммунизацией обезболивают мышей, используя 2,5% испаренного изофлурана, и подтверждают с помощью твердого щипка пальца ноги.
  2. Вводят каждой мыши подкожно, используя шприцы по 1 мл, в два разных участка, на правой и левой сторонах задней части боковой части с 200 мкл эмульсии, содержащей 50 мкг пептида MOG35-55 в соотношении 1:1 (v/v) пептида/CFA.
  3. По крайней мере, через 1,5 ч после иммунизации эмульсией, а затем снова через 24 ч вводят в общей сложности 80 нг токсина Bordetella pertussis в 200 мкл буфера коклюшного токсина каждой мыши, посредством внутрибрюшинных инъекций (100 мкл слева и 100 мкл на правом участке живота).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Было показано, что точная локализация внутрибрюшинной инъекции коклюшного токсина необходима для активации Т-клеток в дренирующем лимфатическом узле15.
  4. Необязательно: Повторно ввести пептид MOG35-55 на 7-й день (как используется в некоторых протоколах16), повторив шаг 4.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самое главное, убедитесь, что шприцы и иглы, используемые для иммунизации, содержащие MOG / CFA или коклюшный токсин, надлежащим образом утилизируются в мешках / контейнерах для биологической опасности.
  5. Оценивайте клинический балл ежедневно, используя шкалу от 0 до 6, как описано ранее6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрый, простой и стандартизированный протокол приготовления эмульсий CFA/MOG показан на рисунке 1. Этот метод недавно был описан в другом месте6. Эмульсии CFA/MOG также могут быть получены с помощью других способов, таких как традиционный шприцевой метод или путем вихря. Эти методы сравнивали здесь путем оценки качества эмульсий. Всеми методами получали эмульсии «вода в масле»; однородность и качество этих эмульсий оценивали путем добавления небольшой капли на стекл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмульсии «вода в масле», такие как антиген / адъювант Фройнда, использовались более полувека для индуцирования EAE17. В настоящее время не существует стандартизированного метода получения антигенных эмульсий, который не зависел бы от влияния человека. Ручное смешивание с использованием шприцев является стандартным для большинства лабораторий, однако этот метод занимает много времени, часто приводит к чрезмерной потере материала, а качество отличается в зависимости от того, готовит ли его ученый.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BTB Emulsions AB подала патентную заявку на использование устройства и способа приготовления эмульсий для иммунизации животных и человека (номер заявки на европейский патент: EP3836884A1). BTB является генеральным директором и основателем компании, а также акционером BTB Emulsions. Bertin-Instruments распространяет эмульсионные наборы, используемые в этой публикации, по всему миру.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор хотел бы выразить признательность подразделениям по содержанию животных в Лундском университете, Камилле Бьорклёв и Агнешке Чопек за их поддержку, а также Ричарду Уильямсу, Институт ревматологии Кеннеди, Оксфордский университет, Великобритания, за конструктивную критику и лингвистическую поддержку при создании этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл Шприц для инъекцийB. Braun9166017V 
1 мл инъекционный шприцSigma-AldrichZ683531
7 мл пустые пробирки с колпачкамиBertin-InstrumentsP000944LYSK0A.07 мл пробирка
50 мл стерильная центрифужная пробирка Fisher Scientific1078856150 мл пробирки
Bordetella pertussis токсинSigma-AldrichP2980хранить при -20 °°; C
Диспергатор, легкое минеральное маслоSigma-AldrichM8410Хранить в RT
Набор эмульсииBertin-InstrumentsD34200.10 eaСодержит трубку, колпачок и поршень
Неполный адъювант ФрейндаSigma-Aldrich  F5506Магазин при +4 °deg C
Mycobacterium tuberculosis, H37RAFisher ScientificDF3114-33-8Хранить в +4 ° C
Mastersizer 2000 Malvern PanalyticalN/AАнализатор размера частиц
Minilys-Personal гомогенизаторBertin-InstrumentsP000673-MLYS0-AВстряхивающий гомогенизатор
MOG 35-55 Пептид     InnovagenN/A
Montanide ISA 51 VGSeppic36362Zодобренный FDA масляный адъювант
Pall Acrodisc Шприцевые фильтры 0,2 μ mFisher Scientific17124381фильтр Стерли
PBS, Ca2+/Mg2+ freeThermo Fisher Scientific14190144PBS
Phase-ConstrastМикроскоп OlympusBX40-B
Стальные бусины 3,2 ммFisher ScientificNC0445832Autoclave и хранить в RT
Triton X-100Sigma-Aldrich648463хранить в RT

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
  2. van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760(2020).
  3. Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947(2019).
  4. Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
  5. Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
  6. Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251(2022).
  7. Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
  8. Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
  9. Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
  10. Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
  11. Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
  12. Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15 Unit 15.6 (2003).
  13. Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
  14. Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
  15. Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
  16. Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
  17. Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
  18. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  19. Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778(2012).
  20. Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603(2022).
  21. Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612(2022).
  22. Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Experimental Autoimmune EncephalomyelitisAntigen Adjuvant EmulsionHomogenization MethodMultiple Sclerosis ModelWater Oil EmulsionAutoimmune Disease ModelCancer Vaccine PreparationPhase Contrast MicroscopyParticle Size AnalysisComplete Freund s Adjuvant

Похожие статьи