Методическая статья

Антиген-захват фермент-связанный иммуносорбентный анализ для специфического обнаружения Mycoplasma pneumoniae

DOI:

10.3791/64645

⸱

24 февраля 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При инфекции Mycoplasma pneumoniae серологические тесты могут давать хорошие результаты, но с низкой специфичностью из-за иммунологической перекрестной реакции. Собственный ИФА захвата антигена, описанный в этой статье, гарантирует высокую видовую специфичность и, как было показано, является надежным скрининговым тестом для точной диагностики M. pneumoniae.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycoplasma pneumoniae - это прокариот с дефицитом клеточной стенки, который, как известно, в основном колонизирует дыхательные пути человека и является эндемичным, с эпидемическим пиком каждые 6 лет, у детей старшего возраста и молодых людей. Диагностика M. pneumoniae является сложной задачей из-за привередливой природы возбудителя и возможности бессимптомного носительства. Лабораторная диагностика инфекции M. pneumoniae на основе титрования антител в образцах сыворотки пациентов остается наиболее практикуемым методом. Из-за потенциальной проблемы иммунологической перекрестной реактивности с использованием поликлональной сыворотки для M. pneumoniae был разработан иммуносорбентный анализ антиген-захвата (ИФА) для улучшения специфичности серологической диагностики. Пластины ИФА покрыты поликлональными антителами M. pneumoniae , выращенными у кроликов и специфичными после адсорбции против панели гетерологичных бактерий, которые разделяют антигены с видами M. pneumoniae и/ или, как известно, колонизируют дыхательные пути. Реагирующие гомологичные антигены M. pneumoniae затем специфически распознаются по соответствующим антителам в образцах сыворотки. Дальнейшая оптимизация физико-химических параметров, которым подвергается ИФА захвата антигена, привела к получению высокоспецифичного, чувствительного и воспроизводимого ИФА.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микоплазмы являются одними из самых маленьких и простых известных прокариот. Они в основном отличаются от других бактерий отсутствием структуры клеточной стенки. Таким образом, микоплазмы были классифицированы в отдельный класс под названием Mollicutes1. Дефицит клеточной стенки придает внутреннюю устойчивость этим микроорганизмам против некоторых антимикробных агентов и в значительной степени отвечает за их полиморфизм. Микоплазмы имеют малый геном и уменьшенные размеры, что ограничивает их метаболические и биосинтетические возможности и объясняет их паразитарную и сапрофитную природу1.

Mycoplasma pneumoniae является одной из микоплазм, которые заражают человека, и считается самой вирулентной2. M. pneumoniae колонизирует верхние дыхательные пути, что приводит к атипичной пневмонии у детей и молодых людей. Клинические признаки, порожденные инфекцией M. pneumoniae, похожи на грипп, с головной болью, лихорадкой и кашлем3. Цитадренция M. pneumoniae к клеткам-хозяева опосредована органеллой прикрепления, включающей большую адгезию P1 и несколько вспомогательных белков 4,5. Более клинические проявления могут возникать из-за местного воспаления и стимуляции иммунной системы хозяина в результате тесного присоединения M. pneumoniae к слизистой оболочке дыхательных путей6. Хотя пневмония является отличительной чертой инфекции M. pneumoniae, было выявлено, что инфекция этой бактерией также может быть ответственна за широкий спектр нелегочных проявлений в различных анатомических местах, таких как центральная нервная система, сердце, кожа и суставы7.

Как и для всех видов Mycoplasma, диагностика M. pneumoniae является сложной. Клинические признаки, вызывающие микоплазмоз, в основном неочевидные и нехарактерные8. Поскольку очень трудно диагностировать инфекцию M. pneumoniae, полагаясь только на клинические проявления и симптомы, лабораторный скрининг представляет особый интерес9. Обнаружение колоний M. pneumoniae по культуре является золотым стандартом для правильной диагностики. Однако привередливые требования к росту и длительное время, необходимое для доставки окончательных результатов (1-2 недели), усложняют культуру и, таким образом, означают, что она редко используется для рутинной диагностики10. Технологии амплификации нуклеиновых кислот были проверены с точки зрения скорости и эффективности, хотя из-за их относительно высокой стоимости и недоступности в некоторых медицинских учреждениях эти молекулярные методы не считаются диагностическими тестами первой линии. Это правда, что коммерческие ПЦР-тесты широко используются для диагностики инфекций M. pneumoniae, но они все еще не могут заменить серологию. Кроме того, частое появление как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов ограничило использование ПЦР9. Как правило, серология остается наиболее практикуемой в лабораториях для диагностики инфекции M. pneumoniae. В течение десятилетий сообщалось о нескольких серологических подходах, таких как холодные гемагглютинины, тест фиксации комплемента11, тест на непрямую гемагглютинацию12, иммунофлуоресценция13 и технология ИФА, которая была впервые применена к серологии микоплазмы в начале 1980-х годов 14,15,16. Одной из основных проблем, возникающих при выполнении ИФА-серодиагностики инфекции M. pneumoniae, являются перекрестные реакции, что значительно снижает специфичность методики. Ранее сообщалось о неспецифической адсорбции сывороток человека антигенами M. pneumoniae; на самом деле, многие из антител, обнаруженных с помощью ИФА в сыворотках человека, не всегда могут быть связаны с микоплазмальными антигенами17 из-за общности M. pneumoniae с некоторыми бактериями18,19 и некоторыми тканями животных и человека20.

Из-за высоких фоновых показаний, наблюдаемых в обычном тесте ИФА, который практиковался в лаборатории, интерпретация результатов часто была сложной, и, таким образом, постановка правильного диагноза M. pneumoniae была трудным заданием. Столкнувшись с этой проблемой, мы решили улучшить ИФА M. pneumoniae , удалив неспецифические реакции антигенов M. pneumoniae с антителами, подлежащими тестированию. С этой целью мы работали над селективным истощением неспецифических антигенов M. pneumoniae с использованием метода адсорбции. Фактически, основной целью ИФА захвата антигена является конкретное обнаружение иммуноглобулина M. pneumoniae (Ig) G в образцах сыворотки крови человека. Концепция этого ИФА состоит в основном из селективного захвата специфических антигенов M. pneumoniae, перед добавлением образцов сыворотки крови человека. Эта селективность обеспечивается инкубацией сырого антигена M. pneumoniae с поликлональной антисывороткой M. pneumoniae , продуцируемой у кроликов в лаборатории, и превращением ее в видоспецифичным путем адсорбции против группы гетерологичных бактерий, принадлежащих или не принадлежащих к классу Mollicutes, разделяющих антигены с M. pneumoniae виды и/или известные колонизирующие дыхательные пути. Процедуру адсорбции повторяли трижды, а ее эффективность по устранению перекрестной реактивности проверяли иммуноблоттингом. Разработанный ИФА-анализ представляет собой комбинацию сэндвича и непрямого ИФА. Вкратце, колодцы ИФА-пластины сначала покрываются поликлональной антисывороткой, специфичной для M. pneumoniae. Затем добавляется антиген M. pneumoniae и захватывается между антисывороткой и антителами, присутствующими в образце сыворотки для тестирования. Сформированный иммунологический комплекс обнаруживается вторичным фермент-конъюгированным антителом (пероксидазо-конъюгированный IgG). Реакции визуализируются добавлением хромогенного субстрата, а поглощение измеряется спектрофотометрически. Этот внутренний ИФА схематично представлен на рисунке 1. Домашний ИФА оказался эффективным в выявлении инфекции M. pneumoniae и в настоящее время является одним из наиболее практикуемых тестов в рутинной диагностической деятельности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящее исследование было проведено в соответствии с этическими аспектами, установленными этическим комитетом Института Пастера в Тунисе.

1. Этапы подготовки к ИФА: предварительные требования и предварительная обработка

  1. Бактериальные штаммы и питательные среды
    ПРИМЕЧАНИЕ: Виды молликутов и бактерии с стенками, используемые в настоящем исследовании, и их питательные среды перечислены в таблице 1.
    1. Рост видов Mollicutes
      1. Инокулируют 200 мкл из запаса глицерина каждого вида в 1 800 мкл среды.
      2. Выращивайте молликуты статически при 37 °C с 5% CO2 в течение 2-4 дней до тех пор, пока не будет наблюдаться изменение рН (показатель рН фенол красный).
      3. Увеличить масштаб культур до 10 мл, добавив 1/10-го разбавления культуры в среду и дать им снова вырасти в тех же условиях.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно метаболизму, некоторые виды Mollicutes человека (M. pneumoniae, M. genitalium и M. fermentans) подкисляют среду за счет ферментации глюкозы, а некоторые другие (M. hominis и Ureaplasma) подщелачивают среду путем гидролиза аргинина или гидролиза мочевины, соответственно. Что касается птичьих микоплазм, то подкисление среды Фрея демонстрирует наличие M. gallisepticum, в то время как ее подщелачивание доказывает рост M. imitans.
      4. Распределите 50 мкл культур на агаровые пластины, чтобы подтвердить рост бактерий. Поддерживайте агаровые пластины при 37 °C с 5% CO2 и регулярно наблюдайте за ними под микроскопом для появления типичных колоний жареных яиц (Mycoplasmas) и темных ежоподобных колоний (Ureaplasmas).
    2. Рост видов, не относящихся к молликутам
      1. Культивируйте бактерии, не относящиеся к моллюскам, в 3 мл среды при 37 °C в течение ночи (встряхивание при 200 об/мин).
      2. Сравните мутность культур с контрольными средами, чтобы подтвердить рост.
      3. Увеличьте масштаб культур до 10 мл, добавив 1/100-е разбавление культуры в среду и позвольте им снова расти в тех же условиях.
  2. Препарат антигена
    1. Антигенный препарат вида Молликутес
      1. Собирают цельные белки (присутствующие в подтвержденных культурах M. pneumoniae и других видов Mollicutes) путем центрифугирования при 40 000 х г при 4 °C в течение 30 мин.
      2. Откажитесь от супернатанта и трижды промойте гранулы 1 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS, pH 7,4) серией из трех центрифугаций с теми же условиями.
      3. Повторное суспендирование каждого антигена в 500 мкл PBS.
    2. Антигенный препарат немолликутных видов
      1. Центрифугируйте выращенные на ночь культуры бактерий, не относящихся к молликутам, по 1 500 х г в течение 15 мин.
      2. Повторно суспендировать каждую бактериальную гранулу в 500 мкл PBS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию белка определяют с использованием классического метода количественного определения Брэдфорда с бычьим сывороточным альбумином в стандартнойкомплектации 21. Концентрация белка у видов молликутов обычно колеблется в пределах 0,7-4,8 мг/мл. Для других видов бактерий концентрация белка может достигать 20 мг/мл. Все антигены хранятся при -20 °C до их последующего использования.
  3. Скрининг перекрестной реактивности с помощью иммуноблоттинга
    1. Денатурировать бактериальные белки путем смешивания 8 мкл каждого антигена с равным объемом буфера образца (0,5 М Трис-HCl; рН 6,8, 10% глицерина [v/v], 10% SDS [мас./об.] и 0,2% бромфенола синего), инкубировать смесь при 100 °C в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Денатурация выполняется для покрытия белков отрицательным зарядом и разрушения их вторичных структур, что позволяет им проходить через полиакриламидный гель и разделяться в соответствии с их молекулярными массами.
    2. Подвергайте денатурированные белки (100 мкг белка/лунку) электрофорезу додецилсульфат-полиакриламидного геля (SDS-PAGE) методом 22 Леммли с12 % разделяющим гелем и 5% укладывающим гелем. После этого переносят белки электрофоретически на нитроцеллюлозную мембрану методом23 Towbin et al.
    3. Погрузите нитроцеллюлозную мембрану в 5% обезжиренное молоко в PBS в течение 30 минут, чтобы заблокировать незанятые поверхности. Инкубируют белковые пятна при комнатной температуре в течение 2 ч с кроличьей поликлональной антисывороткой M. pneumoniae (произведенной в Институте Пастера в Тунисе), разведенной до 1/200 в PBS-Tween 20, затем с пероксидазой хрена (HRP)-конъюгированной анти-кроликовой IgG, разведенной до 1/2000 в PBS-Tween 20 в течение 1 ч при комнатной температуре.
    4. Смойте несвязанные антитела PBS и получите результаты, подвергнув нитроцеллюлозный лист воздействию раствора субстрата (4-хлор-1-нафтол, H2O2). Остановите реакцию, добавив воду через 5-15 мин.
  4. Процедура адсорбции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для устранения перекрестных реакций между поликлональными антисыворотками M. pneumoniae и антигенами гетерологичных бактерий используется процедура адсорбции, ранее описанная Беном Абдельмуменом и Роем24 .
    1. Подготовьте пул антигенов из 12 гетерологичных бактерий (предположительно разделяющих антигены с M. pneumoniae), смешайте его в микроцентрифужной трубке и отрегулируйте концентрацию белка, соответствующую половине антисыворотки, подлежащей адсорбации в эксперименте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем и концентрация варьируются между различными анализами. Этот шаг в основном зависит от концентрации антитела, подлежащего адсорбированию. Например, если концентрация антител = 3,56 мг/мл, концентрация пула антигенов (состоящего из 12 гетерологичных бактерий) должна составлять 1,78 мг/мл (следовательно, примерно 0,148 мг каждого антигена).
    2. Центрифугируют антигенную смесь при 14 000 х г в течение 10 мин при 4 °C, собирают объединенную гранулу и инкубируют ее с очищенным поликлональным анти-M. pneumoniae IgG в течение 2 ч при 37 °C с медленным перемешиванием.
    3. После инкубации центрифугируют суспензию при 14 000 х г в течение 10 мин при 4 °C и восстанавливают супернатант (который соответствует специфическому поликлональному M . pneumoniae antiserum).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить специфичность поликлональной антисыворотки M. pneumoniae , повторите процедуру адсорбции три раза. Прежде чем его можно будет использовать в ИФА-анализе, адсорбированную поликлональную антисыворотку M. pneumoniae следует проверить иммуноблоттингом на отсутствие перекрестных реакций против включенного набора бактерий.

2. Этапы ИФА: Сам анализ

  1. Покрытие микропластин с захватным антителом
    1. Разбавляют захватное антитело (M. pneumoniae предварительно адсорбированная поликлональная антисыворота) до концентрации 10 мкг/мл в 0,1 М карбонатно-бикарбонатного буфера (рН 9,6).
    2. Покройте 96-луночную ИФА-пластину, добавив 100 мкл разбавленного антитела захвата в каждую лунку.
    3. После ночной инкубации при 4 °C удаляют раствор покрытия и промывают пластину пять раз промывочным буфером (композиция [на л]: 146,29 г NaCl, 39,4 г Tris-HCl, 0,2 г тимеросала и 0,5 мл Tween 20; рН 7,3).
  2. Блокировка
    1. Блокируют оставшиеся связующие поверхности скважин с покрытием, добавляя 100 мкл блокирующего раствора (0,5% казеина в PBS) в каждую скважину.
    2. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
    3. Удалите блокирующий раствор пипеткой и вымойте пластину пять раз с помощью промывочного буфера.
  3. Применение антигена
    1. Добавьте равное количество цельных белков M. pneumoniae во все покрытые лунки (10 нг/лунку).
    2. Дайте реакции произойти в течение 2 ч при комнатной температуре.
    3. Удалите избыток раствора антигена и промойте пластину пять раз с помощью промывочного буфера.
  4. Применение тестовых образцов и средств контроля
    1. Разбавьте тестовые образцы (сыворотки человека) и контрольные (ссылочные положительные и отрицательные сыворотки) до 1/200, 1/400 и 1/800 в PBS-Tween 20.
    2. Добавить 100 мкл разреженных проб и контрольных образцов в соответствующие скважины. Проводите каждую реакцию в двух экземплярах. Пометьте лунки, не содержащие ни антигена, ни сыворотки, как пустые.
    3. После инкубации тарелки в течение 90 мин при комнатной температуре удалите растворы сыворотки и промыть пластину пять раз с помощью промывочного буфера.
  5. Применение фермент-конъюгированного детектирующего антитела
    1. Разбавьте фермент-конъюгированные детектирующие антитела, HRP-конъюгированные анти-кролики и античеловеческий IgG до 1/10000 в PBS-Tween 20.
    2. Пипетка 100 мкл соответствующего разбавленного детектирующего антитела к каждой лунке.
    3. После инкубации пластины в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте удаляют несвязанные антитела обнаружения и промывают пластину пять раз моющим буфером.
  6. Обнаружение и анализ данных
    1. Добавьте 100 мкл раствора хромогена 3,3', 5,5' тетраметил-бензидина (TMB) для визуализации связывания антиген-антитело.
    2. Дайте пластине развиться в течение 30 мин при комнатной температуре, затем добавьте 100 мкл стоп-раствора (7,5%H2SO4), чтобы остановить ферментативную реакцию.
    3. Считайте поглощение на длине волны 450 нм с помощью микропластичного считывателя и отсортируйте результаты на основе расчета индекса позитивности (IP).
      IP = Поглощение тестируемой сыворотки / Поглощение отсечки
      IP < 0.7: Отрицательный результат
      IP = 0,7: Тест должен быть повторен в течение 2 недель
      IP > 0.7: Положительный результат
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формула IP разрабатывается в лаборатории, а значение 0,7 настраивается после оптимизации. Для дублирующих реакций рассчитывается среднее значение поглощения. Оптимальное разведение в сыворотке крови и концентрация антигена устанавливаются методом тетер-подборщика ИФА (данные не показаны). Пороговое значение = OD (оптическая плотность) эталонной положительной сыворотки (разбавленной при том же разведении, что и образец). Этот OD должен быть как минимум в три раза выше значения OD отрицательного элемента управления.

3. Этапы после ИФА: оценка результатов и проверка теста

  1. Способность собственного ИФА специфически диагностировать инфекцию M. pneumoniae у тестируемых пациентов оценивается с помощью дополнительных иммуноблотов с использованием антигенов M. pneumoniae и гетерологичных бактерий для подтверждения положительности тестируемых человеческих сывороток в антителах M. pneumoniae и их негативности у других подозреваемых бактерий (данные не показаны).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммуноблоттинговая активность неадсорбированной поликлональной Mycoplasma pneumoniae против оболочки к гетерологичным бактериям
Перекрестная реактивность действительно существует, как показано в результатах иммуноблоттинга (рисунок 2), и по сравнению с положительным контролем (полоса 1), некоторые из антигенов M. pneumoniae разделяются с проверенными бактериями. Интенсивность этих перекрестных реакций была переменной. На...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем документе представлено общее описание собственной ИФА, в основном разработанной для обеспечения специфического скрининга M. pneumoniae инфекция. Приведены подробности о протоколе самого анализа ИФА, а также о некоторых этапах предварительной и постобработки. Специфика этого анализа обеспечивается техникой адсорбции. Эта процедура была ранее описана в ИФА-тестах, разработанных для диагностики человека и птицы. Mycoplasmas17,24. Он так...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что конкурирующих интересов нет.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось Министерством здравоохранения Туниса и Министерством высшего образования и научных исследований Туниса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4-хлор-1-нафтолSigma-AldrichC6788-50 TAB
Bacto пептонBD211677
Bacto триптонBD211705
бычьим сывороточным альбуминомSigma-AldrichA9647-50 G
Карбонатный бикарбонатный буферSigma-AldrichC3041-50 Кап
казеинSigma-AldrichC7078-1 КГ
CMRL1066 VWRP0058-N1L
D-глюкозаSigma-AldrichG7528-1KG
Difco PPLO БульонBD255420Frey media
ELISA plate-ReaderMULTISKAN GO, Thermo ScientificRef: 51119200
Фетальная бычья сывороткаCapricorn ScientificFBS-12A
Козья пероксидаза-конъюгированная античеловеческаяIgG Abcamab6759
Козья пероксидаза, конъюгированная с противокроличьим IgGLife Technologies656120
Соляная кислота 37%Prolab2025.290
Перекись водорода (H2O2), раствор 30%ScharlauHI01361000
L-аргининSigma-AldrichA5006-1KG
LB бульонПолучено в Институте Пастера в ТунисеПредоставлено лабораторией бактериологии Института Пастера в Тунисе
Mycoplasma pneumoniae поликлональная антисыворотка, полученная у кроликовПроизведена в Институте Пастера в ТунисеСыворотка получена путем иммунизации кроликов в Институте Пастера в Тунисе
НикотинамидадениндинуклеотидSigma-AldrichN7004-10G
Nunc Maxisorp плоскодонный 96-луночный микротитровальный планшет Invitrogen44-2404-21
Пенициллин G натрия (1 MIU)PANPHARMA
Фенол красныйfluka chemika77660
Обезжиренное молокоMP Biomedicals902887
Бикарбонат натрия Sigma-AldrichS6297-1KG
Карбонат натрияSigma-AldrichS7795-1KG
Хлорид натрия (NaCl)НовахимPS02805
Серная кислота (H2SO4) 95-97%Merck1007311011
ThimerosalUSB22215
Подложка TMB (3,3', 5,5' ТетраМетил-Бензидин раствор)Abcamab142042
Тризма основаниеSigma-AldrichT6791-1 KG
Tween 20Sigma-Aldrich1379-500 мл
Дрожжевой экстракт, порошок, UltrapureThermo Scientific J23547 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
  2. Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
  3. Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
  4. Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
  5. Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
  6. Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
  7. Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
  8. Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
  9. Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
  10. Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
  11. Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 79-82 (1993).
  12. Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
  13. Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
  14. Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
  15. Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
  16. Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
  17. Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
  18. Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
  19. Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
  20. Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
  21. Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  23. Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  24. Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
  25. Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
  26. Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
  27. Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 243-249 (1993).
  28. Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
  29. Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
  30. Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
  31. Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
  32. Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248(2021).
  33. Corning and Falcon Microplates Selection Guide: For Assays and Drug Discovery. Corning Inc. , Available from: https: //www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/CLS-C-DL-MP-014REV9.pdf (2022).
  34. Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
  35. Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
  36. Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
  37. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ELISAMycoplasma pneumoniae

Похожие статьи