Методическая статья

Антиген-захват фермент-связанный иммуносорбентный анализ для специфического обнаружения Mycoplasma pneumoniae

DOI:

10.3791/64645

⸱

24 февраля 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При инфекции Mycoplasma pneumoniae серологические тесты могут давать хорошие результаты, но с низкой специфичностью из-за иммунологической перекрестной реакции. Собственный ИФА захвата антигена, описанный в этой статье, гарантирует высокую видовую специфичность и, как было показано, является надежным скрининговым тестом для точной диагностики M. pneumoniae.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycoplasma pneumoniae - это прокариот с дефицитом клеточной стенки, который, как известно, в основном колонизирует дыхательные пути человека и является эндемичным, с эпидемическим пиком каждые 6 лет, у детей старшего возраста и молодых людей. Диагностика M. pneumoniae является сложной задачей из-за привередливой природы возбудителя и возможности бессимптомного носительства. Лабораторная диагностика инфекции M. pneumoniae на основе титрования антител в образцах сыворотки пациентов остается наиболее практикуемым методом. Из-за потенциальной проблемы иммунологической перекрестной реактивности с использованием поликлональной сыворотки для M. pneumoniae был разработан иммуносорбентный анализ антиген-захвата (ИФА) для улучшения специфичности серологической диагностики. Пластины ИФА покрыты поликлональными антителами M. pneumoniae , выращенными у кроликов и специфичными после адсорбции против панели гетерологичных бактерий, которые разделяют антигены с видами M. pneumoniae и/ или, как известно, колонизируют дыхательные пути. Реагирующие гомологичные антигены M. pneumoniae затем специфически распознаются по соответствующим антителам в образцах сыворотки. Дальнейшая оптимизация физико-химических параметров, которым подвергается ИФА захвата антигена, привела к получению высокоспецифичного, чувствительного и воспроизводимого ИФА.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микоплазмы являются одними из самых маленьких и простых известных прокариот. Они в основном отличаются от других бактерий отсутствием структуры клеточной стенки. Таким образом, микоплазмы были классифицированы в отдельный класс под названием Mollicutes1. Дефицит клеточной стенки придает внутреннюю устойчивость этим микроорганизмам против некоторых антимикробных агентов и в значительной степени отвечает за их полиморфизм. Микоплазмы имеют малый геном и уменьшенные размеры, что ограничивает их метаболические и биосинтетические возможности и объясняет их паразитарную и сапрофитную природу1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящее исследование было проведено в соответствии с этическими аспектами, установленными этическим комитетом Института Пастера в Тунисе.

1. Этапы подготовки к ИФА: предварительные требования и предварительная обработка

  1. Бактериальные штаммы и питательные среды
    ПРИМЕЧАНИЕ: Виды молликутов и бактерии с стенками, используемые в настоящем исследовании, и их питательные среды перечислены в таблице 1.
    1. Рост видов Mollicutes
      1. Инокулируют 200 мкл из запаса глицерина каждого вида в 1 800 мкл среды.
      2. Выращивайте молликуты статически при 37 °C с 5% CO2 в течение 2-4 дне....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммуноблоттинговая активность неадсорбированной поликлональной Mycoplasma pneumoniae против оболочки к гетерологичным бактериям
Перекрестная реактивность действительно существует, как показано в результатах иммуноблоттинга (рисунок 2), и по сравнению с положительным контролем (полоса 1), некоторые из антигенов M. pneumoniae разделяются с проверенными бактериями. Интенсивность этих перекрестных реакций была переменной. На.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем документе представлено общее описание собственной ИФА, в основном разработанной для обеспечения специфического скрининга M. pneumoniae инфекция. Приведены подробности о протоколе самого анализа ИФА, а также о некоторых этапах предварительной и постобработки. Специфика этого анализа обеспечивается техникой адсорбции. Эта процедура была ранее описана в ИФА-тестах, разработанных для диагностики человека и птицы. Mycoplasmas17,24. Он так.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что конкурирующих интересов нет.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось Министерством здравоохранения Туниса и Министерством высшего образования и научных исследований Туниса.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4-хлор-1-нафтолSigma-AldrichC6788-50 TAB
Bacto пептонBD211677
Bacto триптонBD211705
бычьим сывороточным альбуминомSigma-AldrichA9647-50 G
Карбонатный бикарбонатный буферSigma-AldrichC3041-50 Кап
казеинSigma-AldrichC7078-1 КГ
CMRL1066 VWRP0058-N1L
D-глюкозаSigma-AldrichG7528-1KG
Difco PPLO БульонBD255420Frey media
ELISA plate-ReaderMULTISKAN GO, Thermo ScientificRef: 51119200
Фетальная бычья сывороткаCapricorn ScientificFBS-12A
Козья пероксидаза-конъюгированная античеловеческаяIgG Abcamab6759
Козья пероксидаза, конъюгированная с противокроличьим IgGLife Technologies656120
Соляная кислота 37%Prolab2025.290
Перекись водорода (H2O2), раствор 30%ScharlauHI01361000
L-аргининSigma-AldrichA5006-1KG
LB бульонПолучено в Институте Пастера в ТунисеПредоставлено лабораторией бактериологии Института Пастера в Тунисе
Mycoplasma pneumoniae поликлональная антисыворотка, полученная у кроликовПроизведена в Институте Пастера в ТунисеСыворотка получена путем иммунизации кроликов в Институте Пастера в Тунисе
НикотинамидадениндинуклеотидSigma-AldrichN7004-10G
Nunc Maxisorp плоскодонный 96-луночный микротитровальный планшет Invitrogen44-2404-21
Пенициллин G натрия (1 MIU)PANPHARMA
Фенол красныйfluka chemika77660
Обезжиренное молокоMP Biomedicals902887
Бикарбонат натрия Sigma-AldrichS6297-1KG
Карбонат натрияSigma-AldrichS7795-1KG
Хлорид натрия (NaCl)НовахимPS02805
Серная кислота (H2SO4) 95-97%Merck1007311011
ThimerosalUSB22215
Подложка TMB (3,3', 5,5' ТетраМетил-Бензидин раствор)Abcamab142042
Тризма основаниеSigma-AldrichT6791-1 KG
Tween 20Sigma-Aldrich1379-500 мл
Дрожжевой экстракт, порошок, UltrapureThermo Scientific J23547 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
  2. Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ELISAMycoplasma pneumoniae

Похожие статьи