Методическая статья

Инновационная вставка, напечатанная на 3D-принтере, предназначена для простого 2D- и 3D-культивирования клеток

DOI:

10.3791/64655

⸱

6 января 2023 г.

 ,  ,  , 
1Laboratoire de Biochimie Médicale et Biologie Moléculaire, Université de Reims Champagne-Ardenne, 2UMR CNRS 7369, Matrice Extracellulaire et Dynamique Cellulaire-MEDyC, Université de Reims Champagne-Ardenne Reims, 3BASF Beauty Care Solutions, 4Service Biochimie-Pharmacologie-Toxicologie, Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Reims

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье недавно разработанный вкладыш, напечатанный на 3D-принтере, представлен в качестве модели совместной культуры и подтвержден путем изучения паракринной межклеточной связи между эндотелиальными клетками и кератиноцитами.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Классический анализ непрямой коммуникации между различными типами клеток обуславливает необходимость использования кондиционированных сред. Более того, производство кондиционированных сред остается трудоемким и далеким от физиологических и патологических состояний. Несмотря на то, что несколько моделей кокультивирования коммерчески доступны, они по-прежнему ограничены специфическими анализами и в основном предназначены для двух типов клеток.

Здесь используются напечатанные на 3D-принтере вставки, совместимые с многочисленными функциональными анализами. Вкладыш позволяет разделить одну лунку 6-луночной пластины на четыре отсека. Можно установить широкий спектр комбинаций. Кроме того, в каждой стенке компартментов спроектированы окна таким образом, чтобы потенциальная межклеточная коммуникация между каждым компартментом была возможна в питательной среде в зависимости от объема. Например, паракринная межклеточная коммуникация может быть изучена между четырьмя типами клеток в монослое, в 3D (сфероиды) или путем объединения обоих. Кроме того, в один и тот же отсек можно поместить различные типы клеток в формате 2D или 3D (органоиды). Отсутствие дна во вставках, напечатанных на 3D-принтере, позволяет использовать обычные условия культивирования на пластине, возможное нанесение покрытия на пластину, содержащую вкладыш, и прямую визуализацию с помощью оптической микроскопии. Наличие нескольких компартментов дает возможность собирать различные типы клеток независимо друг от друга или использовать в каждом компартменте разные реагенты для экстракции РНК или белка. В данном исследовании представлена подробная методология использования нового вкладыша, напечатанного на 3D-принтере, в качестве системы совместного культивирования. Чтобы продемонстрировать некоторые возможности этой гибкой и простой модели, ранее опубликованные функциональные тесты клеточной коммуникации были выполнены в новых 3D-печатных вставках и продемонстрировали свою воспроизводимость. Напечатанные на 3D-принтере вставки и традиционная клеточная культура с использованием кондиционированных сред привели к аналогичным результатам. В заключение, напечатанная на 3D-принтере вставка, представляет собой простое устройство, которое может быть адаптировано к многочисленным моделям кокультур с адгезивными типами клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo клетки общаются друг с другом либо напрямую (контакт с клетками), либо опосредованно (путем секреции молекул). Для изучения клеточной коммуникации могут быть разработаны различные модели кокультур, такие как прямая кокультура (различные типы клеток находятся в прямом взаимодействии в одном и том же колодце) и компартментализированная кокультура (различные типы клеток находятся в непрямом взаимодействии в разных компартментах культуральной системы)1. Кроме того, кондиционированные среды могут быть использованы для систем совместного культивирования, где непрямое взаимодействие обеспечивается за счет того, что секретируемые молекулы, содержащиеся в кондиционированных средах эффекторного типа клеток, переносятся в клетку-ответчиктипа 1.

В случае исследований паракринной клеточной коммуникации непрямые системы кокультур предоставляют модели, которые в полной мере отражают клеточные взаимодействия in vivo. Были разработаны и коммерциализированы системы косвенного совместного культивирования, позволившие создать модели косвенной кокультуры 2,3. К сожалению, большинство косвенных систем совместного культивирования предусматривают только два отсека. Другие системы косвенного совместного культивирования предусматривают несколько компартментов, но они менее масштабируемы по сравнению с системой, представленной в настоящей рукописи. Некоторые из них не позволяют провести классическую визуализацию под микроскопом, и в них часто представлены специфические методы нанесения. В нескольких исследованиях паракринная связь между различными типами клеток исследуется с помощью моделиусловной среды 4,5,6,7. Это более простой способ исследования по сравнению с системами косвенной совместной культуры, поскольку он не требует установления конкретных методов или материалов1. С другой стороны, приготовление кондиционированных сред занимает много времени и позволяет получить информацию только об односторонней клеточной сигнализации (от эффектора к ответителю)1.

В данной работе предложен новый, простой способ исследования клеточной коммуникации. Позволяя комбинировать несколько типов клеток в прямом или косвенном взаимодействии, а также в 2D или 3D форматах, напечатанные вставки предоставляют множество преимуществ для простой настройки моделей совместного культивирования. Напечатанная на 3D-принтере вставка, адаптированная для установки в лунки 6-луночных планшетов, имеет круглую форму и позволяет разделить лунку на четыре отсека (два больших и два маленьких; Рисунок 1А). Напечатанные на 3D-принтере вставки характеризуются отсутствием дна. Таким образом, ячейки находятся в непосредственном контакте с пластиной, на которую ставится вкладыш. Кроме того, каждый отсек может быть покрыт независимо от других. Кроме того, поведение клеток можно легко проследить под оптическими микроскопами. Наличие коммуникационных окон в каждой стенке вставки позволяет добавлять в оптимальное время общую среду для проведения различных экспериментов по со-культуре. Для изучения прямой и/или косвенной связи между несколькими типами клеток могут быть выполнены многочисленные комбинации кокультивирования. Например, может быть спроектирована модель непрямой кокультуры между четырьмя различными типами клеток в монослое и/или в 3D (сфероиды). Комбинация моделей прямой и непрямой совместной культуры также может быть выполнена путем смешивания различных типов клеток в одном и том же компартменте. Влияние сложных структур (органоидов, тканевых эксплантов и т.д.) на различные типы клеток может быть еще одним примером моделей, которые могут быть созданы. Кроме того, напечатанные на 3D-принтере вкладыши совместимы с функциональными анализами клеточной биологии (пролиферация, миграция, образование псевдотрубок, дифференцировка и т. д.) и биохимическими тестами (выделение ДНК, РНК, белка, липидов и т. д.). Наконец, напечатанные на 3D-принтере вкладыши обеспечивают широкий спектр экспериментальных схем моделей кокультур с возможностью одновременного комбинирования различных анализов в одном эксперименте в разных отсеках.

Представлены некоторые возможности напечатанных на 3D-принтере вставок, чтобы проверить их в качестве быстрой и простой в использовании модели совместной культуры. По сравнению с ранее опубликованным исследованием, проведенным по коммуникации паракринных клеток, продемонстрирована способность напечатанных на 3D-принтере вставок быть ценной моделью кокультуры. Для оценки этого момента было проведено сравнение регуляции пролиферации и миграции эндотелиальных клеток кератиноцитами между напечатанной на 3D-принтере системой вкладышей и классической системой с использованием кондиционированных сред. Напечатанные на 3D-принтере вставки позволяют быстро получать результаты, аналогичные традиционным системам, использующим кондиционированные носители. Действительно, напечатанные на 3D-принтере вставки обеспечивают надежную модель для изучения клеточных взаимодействий в обоих направлениях без необходимости производства кондиционированных сред и с возможностью параллельного выполнения анализов пролиферации и миграции в одном и том же эксперименте.

В заключение в данной работе предлагается новая и готовая к использованию модель для изучения клеточной коммуникации. Совместимые со всеми типами адгезивных клеток, напечатанные на 3D-принтере вставки позволяют выполнять многочисленные комбинации кокультур, которые направлены на то, чтобы быть ближе к условиям in vivo .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-вставки (Рисунок 1A) приобретаются в промышленных масштабах и печатаются с использованием фотополимерной смолы, биосовместимой с клеточными культурами и автоклавированием (см. Таблицу материалов). В этом разделе описан подробный протокол для создания модели совместной культуры с помощью вставок (см. рис. 1B). Также приведены некоторые примеры приложений.

1. Размещение стерилизованного вкладыша в 6-луночные планшеты

  1. Смешайте два компонента, входящие в комплект (см. Таблицу материалов), пищевой кремний (реагент А) и катализатор (реагент В), в соотношении 10:1 (v/v) в соответствии с инструкциями производителя. (Рисунок 1Ba). Используйте шпатель, стерилизованную 70% этанолом, чтобы смешать два компонента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем приготовляемой кремниевой смеси зависит от количества закрепляемых вставок. Избыток катализатора может привести к слишком быстрому затвердеванию кремниевой смеси.
  2. Нанесите вставки на силиконовую смесь пинцетом так, чтобы смесь равномерно распределилась по нижнему краю вставок (рисунок 1Bb). Поместите вставки в лунки 6-луночного планшета и слегка надавите на пластины, чтобы убедиться, что вставки находятся в тесном контакте с планшетом, чтобы избежать утечки среды для клеточной культуры (Рисунок 1Bc).
  3. Поставьте пластину при температуре 37 °C, чтобы поддержать процесс затвердевания кремния в течение 1 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время затвердевания зависит от количества добавленного катализатора.
  4. После застывания простерилизовать пластины со вкладышами, погрузив их в ванну с 70% этиловым спиртом на срок от 30 мин до 1 ч.
  5. Выбросьте спирт с помощью пипетки и дайте планшету высохнуть (крышка открыта) в течение ночи в колпаке для клеточных культур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Спирт должен быть полностью испарен перед выполнением следующего шага, чтобы избежать фиксации клеток и токсичности. Готовую к использованию пластину, содержащую вкладыши, можно хранить в течение нескольких дней перед использованием в сухом и стерильном состоянии при комнатной температуре.

2. Покрытия, такие как поли-L-лизин или поли-HEMA (дополнительный этап)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте покрытие не выполняется, и приведены шаги, информирующие о возможности нанесения покрытия на пластины.

  1. Приготовьте раствор для покрытия в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Рассмотрим объем 200-400 мкл для самых больших отсеков и объем 50-100 мкл для самых маленьких отсеков для покрытия вставки. Добавьте раствор для покрытия в отдельные отсеки.
  3. Дайте покрытию высохнуть в соответствии с указаниями производителя в стерильных условиях.

3. Засев клеток

  1. Культивирование кератиноцитов наружной оболочки корня (KORS) и дермальных микрососудистых эндотелиальных клеток человека (HDMEC) в соответствии с рекомендациями производителя. Приготовьте клеточную суспензию, как только клетки достигнут слияния.
    1. Выбросьте среду из колб и добавьте 5 мл трипсина, чтобы отделить клетки (см. Таблицу материалов).
    2. Поместите колбу с KORS при температуре 37 °C с 5% CO2 на 5 минут. Инкубируйте колбу с HDMEC в течение 5 минут при комнатной температуре.
    3. Раствор трипсина, содержащий KORS, смешать с 5 мл среды мезенхимальных стволовых клеток (МСКМ) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и факторов роста (базальная среда с набором добавок, см. таблицу материалов). Раствор трипсина, содержащий HDMEC, смешивают с 5 мл эндотелиальной клеточной среды (ECM) с добавлением 5% FBS и факторов роста (см. таблицу материалов).
    4. Переложите клетки в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте суспензии KORS и HDMEC при 200 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 2 мл соответствующей среды.
    6. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего красителя (см. таблицу материалов).
    7. Добавьте 10 мкл смеси в камеру счетного предметного стекла.
    8. Вставьте ползунок для подсчета клеток в систему подсчета клеток (см. Таблицу материалов) и определите номер ячейки и жизнеспособность.
    9. Приготовьте клеточную суспензию в концентрации 0,5 x 105 клеток/мл в соответствующей среде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если для разных типов клеток требуется разное время адгезии и/или для достижения идеального слияния, посев клеток может быть выполнен в разные моменты времени в зависимости от типа клеток.
  2. Распределите пипеткой от 800 мкл до 1 мл клеточной суспензии в отдельные большие отсеки и 100-150 мкл в отдельные малые отсеки.
    1. Засейте KORS в дозе 1 x 10 5 клеток/мл в MSCM с добавлением5% FBS и факторов роста в одном из больших отсеков.
    2. Семенной HDMEC в ECM с добавлением 5% FBS и факторов роста в дозе 2,5 x 103 клеток/мл в малых компартментах и 1,25 x 105 клеток/мл в другом большом компартменте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ пролиферации может быть выполнен в малых компартментах, а анализ миграции и жизнеспособности может быть выполнен в больших компартментах. Концентрация засеянных клеток была оптимизирована в соответствии с рекомендациями производителя. Такая концентрация обеспечивает хорошую жизнеспособность клеток через 24-48 ч инкубации.
  3. Поместите планшет для клеточной культуры при температуре 37 °C с 5%CO2 или в обычных условиях, чтобы обеспечить адгезию и/или созревание клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубируйте клетки в течение 24-48 ч без смены среды. При необходимости среда отсеков может быть изменена независимо.

4. Реализация совместной культуры ( Рисунок 1Bd)

ПРИМЕЧАНИЕ: Реализация совместной культуры соответствует времени, когда добавляется общая среда. Добавление уникальной среды для всех типов клеток в различных компартментах обеспечивает возможность паракринной связи между клетками благодаря наличию коммуникационных окон (яйцевидных отверстий в стенках 3D-печатных вставок). Чтобы внедрить совместную культуру, выполните шаги 4.1-4.3.

  1. Опорожните питательные среды из различных отсеков вкладышей с помощью пипетки. В случае культуры 3D-сфероидных клеток очень осторожно утилизируйте среду.
  2. Промойте ячейки 1 мл теплого PBS с температурой 37 °C в больших отсеках и 200 мкл теплого PBS с температурой 37 °C в маленьких отсеках. Обеспечьте бережную стирку, чтобы не отсоединить клетки.
  3. Добавьте 3 мл общей среды, подобранной так, чтобы она была совместима со всеми типами клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании используется базальный ECM (без FBS и факторов роста). Убедитесь, что среда покрывает все отсеки (уровень над коммуникационными окнами [яйцевидные отверстия в стенах], как показано на рисунке 1А).
  4. Поместите планшет с кокультурами при температуре 37 °C с 5% CO2 на 24-48 ч.

5. Наблюдение за клетками, подсчет и выскабливание

  1. Наблюдайте за морфологией и подсчитывайте количество клеток различных компартментов во время эксперимента под оптическим микроскопом через 24-48 ч инкубации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемое количество ячеек зависит от используемых типов клеток (размер, морфология и т.д.) и от размера отсека. В этом эксперименте в больших отсеках подсчитывают от 0,5 x 10 6-1 x10 6 KORS/мл и от 0,25 x 10 6-0,75 x 10 6 HDMECs/мл.
  2. Отделите клетки с помощью трипсина для подсчета клеточной суспензии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для решения для отделения клеток рассмотрите объем 100-500 мкл для самых больших компартментов и объем 10-50 мкл для самых маленьких компартментов.
  3. Проверьте жизнеспособность с помощью окрашивания трипановым синим (см. шаги 3.1.6-3.1.8).

6. Очистка вставок для вторичной переработки

  1. Снимите вкладыши с 6-луночной пластины в конце эксперимента, слегка покрутив (Рисунок 1Be).
  2. Снимите силикон со вставок, потянув за него. При необходимости с помощью шпателя удалите остатки силикона, прилипшие к стенкам вставок (рисунок 1Bf).
  3. Промойте вкладыши обычными моющими средствами для клеточных культур и чистящими средствами (пример приведен в таблице материалов).
  4. Стерилизуйте вкладыши для дальнейшего использования в автоклаве (твердый цикл, 121 °C в течение 20 минут) или погрузив их в ванну с 70% этанолом на 1 час.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описываются два примера возможных анализов (анализы пролиферации и миграции) с использованием напечатанных на 3D-принтере вставок (рис. 1Bd).

7. Анализ пролиферации клеток - WST-1

  1. Выполните шаги 1-3.1 для культивирования клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги, описанные в этом разделе, чтобы внедрить систему кокультивирования, чтобы исследовать влияние секретома KORS на пролиферацию HDMEC. Ячейки KORS используются для сравнения данных, опубликованных ранее8.
    1. Высевают KORS в дозе 1 x 10 5 клеток/мл в среду мезенхимальных стволовых клеток (МСКМ) с добавлением5% FBS и факторов роста в больших компартментах.
    2. Поместите планшет для клеточной культуры при температуре 37 °C с 5%CO2 на 24 часа.
    3. Высевают HDMEC в эндотелиальную клеточную среду (ECM) с добавлением 5% FBS и факторов роста в дозе 2,5 x 103 клеток/мл в небольших компартментах.
    4. Поместите планшет с клеточной культурой при температуре 37 °C с 5% CO2 на 24-48 ч.
    5. Выбросьте среду из всех отсеков и внедрите систему кокультивирования, добавив 3 мл недополненного базального ECM (общая среда для клеточных культур для всех отсеков вкладышей, напечатанных на 3D-принтере).
  2. Разводят WST-1 в общей клеточной культуре ECM (окончательное разведение 1:10) для приготовления раствора WST-1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для объема раствора WST-1 приготовьте не менее 500 мкл дополнительного раствора для заготовки.
  3. Выбросьте питательную среду из вкладыша с помощью пипетирования.
  4. Добавьте раствор WST-1 в выбранные отсеки (150 мкл для маленьких отсеков и 600 мкл для больших). Поставьте пластину при температуре 37 °C с 5% CO2.
  5. По истечении оптимального 30-минутного времени инкубации клеток перенесите 100 мкл инкубационной среды из каждого состояния на 96-луночный планшет.
  6. Оцените колориметрическую реакцию с помощью микропланшетного ридера в диапазоне от 420 нм до 480 нм.
    1. Наденьте пластину на микропланшет считывателя и нажмите на кнопку редактирования нового протокола.
    2. Выберите конкретный тип используемой 96-луночной пластины (см. Таблицу материалов) и длину волны 450 нм.
    3. Нажмите на кнопку начать измерение.

8. Анализ миграции клеток - устройство с двумя миграционными камерами

  1. Выполните шаги 1-3.1 для культивирования клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги, описанные в этом разделе, чтобы внедрить систему кокультивирования, чтобы исследовать влияние секретома KORS на пролиферацию HDMEC.
    1. Засейте KORS в дозе 1 x 10 5 клеток/мл в MSCM с добавлением5% FBS и факторов роста в одном из больших отсеков.
    2. Поместите планшет для клеточной культуры при температуре 37 °C с 5%CO2 на 24 часа.
    3. Поместите устройство с двумя миграционными камерами в другой большой отсек вкладышей.
    4. Засейте HDMEC в ECM , добавив 5% FBS и факторы роста в 7 x 105 клеток/лунку устройства с двумя миграционными камерами.
    5. Поместите планшет для клеточной культуры при температуре 37 °C с 5%CO2 на 24 часа.
    6. Утилизируйте носитель и устройство с двумя миграционными камерами через 24 часа или в оптимальное время в зависимости от типа мигрируемой ячейки. Реализуйте систему кокультивирования, добавив 3 мл недополненного базальногоEC M.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Действуйте осторожно, чтобы не отсоединить ячейки. Если клетки действительно чувствительны к отслоению, вызванному добавлением общей среды, снимите устройство с двумя миграционными камерами после добавления общей среды.
  2. Понаблюдайте и сделайте снимок поверхности, покрытой клетками в разные моменты времени, под фазово-контрастным микроскопом при 10-кратном увеличении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Снимки сделаны с помощью фазово-контрастного микроскопа (см. Таблицу материалов). Снимки сохраняются на USB-накопителе, а затем анализируются с помощью плагина инструмента для заживления ран программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
  3. Измерьте непокрытую поверхность с помощью классического программного обеспечения для количественного анализа.
    1. Откройте изображение в программе и активируйте инструмент для заживления ран, доступный в списке макросов.
    2. Нажмите на кнопку m , чтобы измерить непокрытую поверхность изображения миграции.
    3. Непокрытая поверхность рассчитывается по следующей формуле:
      Процент покрытия = ([средняя площадь без ячеек в момент T0 − средняя площадь без ячеек в момент времени T]/средняя площадь без ячеек в момент T0) × 100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Напечатанные на 3D-принтере вкладыши полностью адаптированы к большинству методов клеточной биологии (таких как анализ образования псевдотрубок, 3D-культуры) и для биохимических экспериментов (таких как экстракция ДНК, РНК, белка).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящей работе была описана оптимизированная система кокультур для получения устойчивых, надежных и значимых данных, сопоставимых с классическими методами, за счет использования условных сред. Напечатанные на 3D-принтере вставки имитируют условия микроокружения in vivo различных типов клеток при взаимодействии, преодолевая трудности и трудоемкое производство кондиционированных сред перед экспериментами. Ранее опубликованное исследование было проведено повторно для анализа косвенных взаимодействий между двумя...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Непрямая клеточная коммуникация обычно исследуется с использованием кондиционированных сред или устройств для совместной культивации. Подготовка условной среды занимает много времени на начальном этапе экспериментов, и этот метод ограничен односторонним анализом эффектов. Предыдущее исследование Colin-Pierre et al.8 С использованием кондиционированных сред была проведена непрямая клеточная коммуникация между двумя типами клеток (HDMEC и KORS). Данные предыдущего исследования продемонстрир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было проведено в сотрудничестве с BASF Beauty Care Solutions. Г-жа Чарли Колин-Пьер (Charlie Colin-Pierre) является докторантом BASF/CNRS.

Мы хотели бы поблагодарить г-на Мехди Селлами за концепцию вставок, напечатанных на 3D-принтере.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АвтоклавGetingeAPHPSolid cycle, 121 град; C за 20 мин
Biomed ClearFormlabsRS-F2-BMCL-01Оттиск выполнен компанией 3D-Morphoz (Реймс, Франция)
Моющие средства для клеточных культур TounettA18590/0116
Реагент для пролиферации клеток WST-1Roche11,64,48,07,001
Счетное стеклоNanoEnTekEVE-050
Культуральная вставка 2 лунки в μ-чашке 35 ммIbidi80206устройство с двумя миграционными камерами. 
Среда эндотелиальных клетокScienCell1001Базальная среда +/- 25 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS, 0025), 5 мл добавки для роста эндотелиальных клеток (ECGS, 1052) и 5 мл раствора пенициллина/стрептомицина (P/S, 0503).
Автоматизированный счетчик ячеек EVE NanoEnTekNESCT-EVE-001E 
EVOS XL CoreFisher ScientificAMEX120010-кратным увеличением
Пищевой силиконовый реагент и набор катализаторовArtificinaRTV 3428 A и B (10:1)
Принтер FORM 3BFormlabsPKG-F3B-WSVC-DSP-BASICОттиск выполнен компанией 3D-Morphoz
Дермальные микрососудистые эндотелиальные клетки человека (HDMEC)ScienCell2000
Кератиноциты наружной корневой оболочки (KORS)ScienCell2420
Macro Wound Healing Tool Программное обеспечениеImageJПрограммное обеспечение, используемое для измерения непокрытой поверхности (для Миграционные анализы)
Среда мезенхимальных стволовых клеток ScienCell7501Базальная среда +/-25 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS, 0025), 5 мл добавки для роста мезенхимальных стволовых клеток (MSCGS, 7552) и 5 мл раствора пенициллина/стрептомицина (P/S, 0503)
Считыватель микропланшетов SPECTRO star NANOBMG LabtechBMG LABTECH программное обеспечение
PBSPromocellC-40232без Ca2+ / Mg2+
Trypan Blue StainNanoEnTekEBT-001
Trypsin / EDTAPromocellC-41020Инкубация KORS при 37 ° C с 5% CO2 в течение 5 мин. Инкубация HDMEC в течение 5 мин при комнатной температуре
96-луночным планшетом Nunclon Delta SurfaceThermoscientific167008

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
  2. Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825(2019).
  3. Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113(2018).
  4. Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
  5. Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318(2021).
  6. Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311(2017).
  7. Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
  8. Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172(2021).
  9. Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
  10. Wu, A. -L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352(2021).
  11. Oudart, J. -B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
  12. Martinotti, S., Ranzato, E. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).
  13. Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97(2018).
  14. Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D Printed InsertCell Co CultureIntercellular CommunicationConditioned MediaKeratinocyte CultureEndothelial CellsSpheroid CultureOrganoid CultureCell Migration AssayOptical Microscopy

Похожие статьи