Моделирование плоскоклеточного рака полости рта и пищевода в 3D-органоидах

Samuel Flashner; Cecilia Martin; Norihiro Matsuura; Masataka Shimonosono; Yasuto Tomita; Masaki Morimoto; Ogoegbunam Okolo; Victoria X. Yu; Anuraag S. Parikh; Andres J. P. Klein-Szanto; Kelley Yan; Joel T. Gabre; Chao Lu; Fatemeh Momen-Heravi; Anil K. Rustgi; Hiroshi Nakagawa

doi:10.3791/64676

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Моделирование плоскоклеточного рака полости рта и пищевода в 3D-органоидах

4.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64676

⸱

23 декабря 2022 г.

Samuel Flashner^*¹ , Cecilia Martin^*¹^,² , Norihiro Matsuura¹ , Masataka Shimonosono¹ , Yasuto Tomita¹ , Masaki Morimoto¹ , Ogoegbunam Okolo¹ , Victoria X. Yu¹^,³ , Anuraag S. Parikh¹^,³ , Andres J. P. Klein-Szanto⁴ , Kelley Yan¹^,² , Joel T. Gabre¹^,⁵ , Chao Lu¹^,⁶ , Fatemeh Momen-Heravi¹^,⁷ , Anil K. Rustgi¹^,⁵ , Hiroshi Nakagawa¹^,²^,⁵

¹Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, ²Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, ³Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, ⁴Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, ⁵Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, ⁶Department of Genetics and Development, Columbia University, ⁷Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описаны ключевые этапы создания и характеристики 3D-органоидов полости рта и пищевода мышей, которые представляют собой нормальные, предопухолевые и плоскоклеточные поражения карциномы, вызванные химическим канцерогенезом.

Аннотация

Плоскоклеточный рак пищевода (ESCC) распространен во всем мире, на его долю приходится 90% всех случаев рака пищевода каждый год, и является самым смертоносным из всех плоскоклеточных карцином человека. Несмотря на недавний прогресс в определении молекулярных изменений, сопровождающих инициацию и развитие ESCC, прогноз пациента остается неблагоприятным. Функциональная аннотация этих молекулярных изменений является необходимым следующим шагом и требует моделей, которые охватывают молекулярные особенности ESCC и могут быть легко и недорого манипулированы для функциональной аннотации. У мышей, получавших миметический 4-нитрохинолиновый 1-оксид табачного дыма (4NQO), предсказуемо образуется ESCC и преднеоплазия пищевода. Следует отметить, что поражения 4NQO также возникают в полости рта, чаще всего на языке, а также в преджелудке, которые имеют многослойный плоский эпителий. Однако этими мышами нельзя просто манипулировать для проверки функциональных гипотез, поскольку создание изогенных моделей мышей требует много времени и ресурсов. Здесь мы преодолеваем это ограничение, генерируя трехмерные (3D) органоиды, полученные из отдельных клеток, у мышей, получавших 4NQO, чтобы охарактеризовать мышиные ESCC или предопухолевые клетки ex vivo. Эти органоиды улавливают характерные черты ESCC и преднеоплазии пищевода, могут быть дешево и быстро использованы для формирования изогенных моделей и могут быть использованы для экспериментов по сингенной трансплантации. Мы демонстрируем, как генерировать 3D-органоиды из нормальной, предопухолевой и SCC мышиной ткани пищевода, а также поддерживать и криоконсервировать эти органоиды. Применение этих универсальных органоидов широко и включает использование генетически модифицированных мышей и дальнейшую характеристику с помощью проточной цитометрии или иммуногистохимии, генерацию изогенных органоидных линий с использованием технологий CRISPR, а также скрининг лекарств или сингенную трансплантацию. Мы считаем, что широкое внедрение методов, продемонстрированных в этом протоколе, ускорит прогресс в этой области в борьбе с тяжелым бременем ESCC.

Введение

Плоскоклеточный рак пищевода (ESCC) является самым смертоносным из плоскоклеточных карцином человека из-за его поздней диагностики, резистентности к терапии и метастазирования ^1,2. ESCC возникает из многослойного плоского эпителия, который выстилает просветную поверхность пищевода. Плоский эпителий состоит из пролиферативных базальных клеток и дифференцированных клеток в супрабазальном клеточном слое. В физиологических условиях базальные клетки экспрессируют такие маркеры, как p63, Sox2 и цитокератин K5 и K14, в то время как дифференцированные клетки экспрессируют K4, K13 и IVL. Базальные клетки сами по себе н....