Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Моделирование плоскоклеточного рака полости рта и пищевода в 3D-органоидах

4.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64676

⸱

23 декабря 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 2Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, 3Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, 4Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, 5Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, 6Department of Genetics and Development, Columbia University, 7Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описаны ключевые этапы создания и характеристики 3D-органоидов полости рта и пищевода мышей, которые представляют собой нормальные, предопухолевые и плоскоклеточные поражения карциномы, вызванные химическим канцерогенезом.

Аннотация

Плоскоклеточный рак пищевода (ESCC) распространен во всем мире, на его долю приходится 90% всех случаев рака пищевода каждый год, и является самым смертоносным из всех плоскоклеточных карцином человека. Несмотря на недавний прогресс в определении молекулярных изменений, сопровождающих инициацию и развитие ESCC, прогноз пациента остается неблагоприятным. Функциональная аннотация этих молекулярных изменений является необходимым следующим шагом и требует моделей, которые охватывают молекулярные особенности ESCC и могут быть легко и недорого манипулированы для функциональной аннотации. У мышей, получавших миметический 4-нитрохинолиновый 1-оксид табачного дыма (4NQO), предсказуемо образуется ESCC и преднеоплазия пищевода. Следует отметить, что поражения 4NQO также возникают в полости рта, чаще всего на языке, а также в преджелудке, которые имеют многослойный плоский эпителий. Однако этими мышами нельзя просто манипулировать для проверки функциональных гипотез, поскольку создание изогенных моделей мышей требует много времени и ресурсов. Здесь мы преодолеваем это ограничение, генерируя трехмерные (3D) органоиды, полученные из отдельных клеток, у мышей, получавших 4NQO, чтобы охарактеризовать мышиные ESCC или предопухолевые клетки ex vivo. Эти органоиды улавливают характерные черты ESCC и преднеоплазии пищевода, могут быть дешево и быстро использованы для формирования изогенных моделей и могут быть использованы для экспериментов по сингенной трансплантации. Мы демонстрируем, как генерировать 3D-органоиды из нормальной, предопухолевой и SCC мышиной ткани пищевода, а также поддерживать и криоконсервировать эти органоиды. Применение этих универсальных органоидов широко и включает использование генетически модифицированных мышей и дальнейшую характеристику с помощью проточной цитометрии или иммуногистохимии, генерацию изогенных органоидных линий с использованием технологий CRISPR, а также скрининг лекарств или сингенную трансплантацию. Мы считаем, что широкое внедрение методов, продемонстрированных в этом протоколе, ускорит прогресс в этой области в борьбе с тяжелым бременем ESCC.

Введение

Плоскоклеточный рак пищевода (ESCC) является самым смертоносным из плоскоклеточных карцином человека из-за его поздней диагностики, резистентности к терапии и метастазирования 1,2. ESCC возникает из многослойного плоского эпителия, который выстилает просветную поверхность пищевода. Плоский эпителий состоит из пролиферативных базальных клеток и дифференцированных клеток в супрабазальном клеточном слое. В физиологических условиях базальные клетки экспрессируют такие маркеры, как p63, Sox2 и цитокератин K5 и K14, в то время как дифференцированные клетки экспрессируют K4, K13 и IVL. Базальные клетки сами по себе неоднородны и включают предполагаемые стволовые клетки, определяемые такими маркерами, как K153 и CD734. В гомеостазе базальные клетки подвергаются постмитотической терминальной дифференцировке в супрабазальном клеточном слое, тогда как дифференцированные клетки мигрируют и десквамируются в просвет для полного обновления эпителия. Напоминая о своих клетках происхождения, ESCC в разной степени демонстрирует плоскоклеточную дифференцировку. ESCC часто сопровождается мультифокальными гистологическими поражениями-предшественниками, известными как интраэпителиальная неоплазия (IEN) или дисплазия, включающие атипичные базалоидные клетки. В дополнение к эпителиальным изменениям, ESCC отображает ремоделирование тканей в субэпителиальном компартменте, где происходит активация ассоциированных с раком фибробластов (CAF) и рекрутирование иммунных / воспалительных клеток для содействия микроокружению, способствующему развитию опухоли.

Патогенез ESCC включает генетические изменения и воздействие факторов риска окружающей среды. Ключевые генетические поражения включают инактивацию генов-супрессоров опухолей TP53 и CDKN2A (p16INK4A) и активацию онкогенов CCND1 (циклин D1) и EGFR, которые приводят к нарушению функции контрольных точек клеточного цикла, аберрантной пролиферации и выживаемости в условиях генотоксического стресса, связанного с воздействием канцерогенов окружающей среды. Действительно, генетические изменения тесно взаимодействуют с поведенческими и экологическими факторами риска, чаще всего с употреблением табака и алкоголя. Табачный дым содержит канцерогены для человека, такие как ацетальдегид, который также является основным метаболитом алкоголя. Ацетальдегид индуцирует аддукты ДНК и межцепочечные сшивки ДНК, что приводит к повреждению ДНК и накоплению мутаций ДНК и хромосомной нестабильности. Учитывая чрезмерные митогенные стимулы и аберрантную пролиферацию от активации онкогенов, злокачественной трансформации эпителиальных клеток пищевода способствуют механизмы, позволяющие справляться с генотоксическим стрессом, включая активацию антиоксидантов, аутофагию и эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ). Интересно, что эти цитопротекторные функции часто активируются в раковых стволовых клетках ESCC (CSCs), которые характеризуются высокой экспрессией CD44 (CD44H) и обладают возможностями инициации опухоли, инвазии, метастазирования и резистентности к терапии 5,6,7.

ESCC был смоделирован в клеточной культуре и на моделях грызунов 8,9. За последние три десятилетия были разработаны надежные генно-инженерные мышиные модели ESCC. К ним относятся трансгенные мыши CCND1 и EGFR 10,11 и мыши с нокаутом p53 и p120Ctn 12,13. Тем не менее, единичные генетические изменения обычно не приводят к быстрому началу ESCC. Эта проблема была решена с помощью канцерогенов пищевода, которые хорошо повторяют генетические поражения человека в ESCC14. Например, 4-ниттрохинолин-1-оксид (4NQO) ускоряет развитие ESCC у трансгенных мышей CCND1 15. В последние годы предполагаемые эпителиальные стволовые клетки пищевода, клетки-предшественники и их соответствующие судьбы были исследованы на моделях мышейс прослеживаемой клеточной линией 3,4. Кроме того, эти мыши с прослеживаемой клеточной линией были использованы для изучения клеток происхождения ESCC и того, как такие клетки приводят к образованию CSC CD44H, с помощью обычной гистологии и молекулярной характеристики на основе омиксов7.

Одной из новых областей, связанных с этими моделями мышей, является новое применение методов культивирования клеток для анализа живых ESCC и клеток-предшественников в трехмерной (3D) органоидной системе, в которой архитектура исходных тканей повторяется ex vivo 7,8,9. Эти 3D-органоиды быстро выращиваются из одноклеточной суспензии, выделенной из тканей мышей, включая первичные и метастатические опухоли (например, поражения лимфатических узлов, легких и печени). Клетки встраиваются в экстракт базальной мембраны (BME) и питаются четко определенной средой для культивирования клеток, не содержащей сыворотки. 3D-органоиды растут в течение 7-10 дней, и полученные сферические структуры поддаются субкультуре, криоконсервации и анализам для анализа различных клеточных свойств и функций, включая маркеры CSC, EMT, аутофагию, пролиферацию, дифференцировку и апоптотическую гибель клеток.

Эти методы могут быть широко применены к 3D-органоидным культурам, полученным из любой многослойной плоской эпителиальной ткани, такой как слизистая оболочка головы и шеи (ротовая полость, язык, глотка и гортань) и даже преджелудка. Слизистая оболочка головы и шеи примыкает к пищеводу, и эти две ткани имеют сходную тканевую организацию, функцию и восприимчивость к заболеваниям. Плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC) и ESCC имеют общие генетические поражения и факторы риска окружающей среды, связанные с образом жизни, такие как воздействие табака и алкоголя. Подчеркивая это сходство, у мышей, получавших миметик табачного дыма 4NQO, легко развиваются как HNSCC, так и ESCC. Учитывая легкость, с которой описанные ниже протоколы могут быть применены к моделированию HNSCC, мы включаем конкретные инструкции по созданию 3D-органоидных культур из этих поражений.

Здесь мы приводим подробные протоколы для создания 3D-органоидов пищевода мышей (MEO), представляющих нормальные, предопухолевые и ESCC-поражения, которые развиваются у мышей, получавших 4NQO. Можно использовать различные штаммы мышей, в том числе распространенные лабораторные штаммы, такие как C57BL / 6, прослеживаемые по клеточному происхождению и другие генетически модифицированные производные. Мы подчеркиваем ключевые этапы, включая выделение нормального или больного эпителия пищевода мыши, приготовление одноклеточных суспензий, культивирование и мониторинг растущих 3D-органоидов, субкультуру, криоконсервацию и обработку для последующего анализа, включая морфологию и другие приложения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты на мышах были спланированы и проведены в соответствии с правилами и в соответствии с протоколом #AABB1502 животных, рассмотренным и одобренным Комитетом по уходу за животными и их использованию Колумбийского университета. Мыши были размещены в надлежащем учреждении по уходу за животными, которое обеспечивает гуманное обращение с мышами и обеспечивает надлежащую ветеринарную помощь для мышей и обучение лабораторного персонала технике безопасности.

1. Лечение мышей 4NQO для индуцирования поражений пищевода IEN и ESCC (время рассмотрения: до 28 недель)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения MEO, представляющих опухолевые поражения пищевода, мышей подвергают 4NQO-опосредованному химическому канцерогенезу, как ранее описано Tang et al.14. Нормальные/неопухолевые MEO генерируются из необработанных мышей.

  1. Мышей
    1. Разместите от четырех до пяти мышей в клетке и акклиматизируйте их в животноводческом помещении не менее чем за 1 неделю до начала эксперимента. Чтобы уменьшить вероятность того, что возрастные расстройства приведут к преждевременному прекращению полного 28-недельного эксперимента, начните с мышей в возрасте от 8 до 16 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовались мыши C57BL/6 весом около 20-30 г. Для более коротких экспериментов можно использовать более старых мышей. Допустимы самцы или самки мышей. Контрольные (без лечения, см. раздел 1.3.1) мыши должны быть подобраны по возрасту и полу.
  2. Подготовка питьевой воды, содержащей 4NQO
    1. Приготовьте исходный раствор 4NQO 1 мг / мл в этиленпропиленгликоле (таблица материалов). Растворите 100 мг 4NQO в 100 мл 99,9% этиленпропиленгликоля в стеклянном стакане объемом 500 мл, покрытом герметизирующей пленкой. Тщательно перемешайте при комнатной температуре (RT) с помощью магнитной мешалки при 800 об/мин в течение 30 минут. Хранить при температуре 4 °C.
    2. Добавьте 900 мл автоклавной деионизированной воды к 100 мл исходного раствора 4NQO 1 мг/мл и перемешайте путем инверсии в пластиковом градуированном цилиндре объемом 2 л, покрытом герметизирующей пленкой. Объем 1 л 100 мкг/мл 4NQO в 10% этиленпропиленгликоле будет обслуживать две клетки для мышей, оснащенные бутылкой для питья объемом 500 мл.
      ВНИМАНИЕ: Следует отметить, что 4NQO является синтетическим химическим канцерогеном, который может вызвать рак. Работайте в нитриловых перчатках и лабораторном халате с длинными рукавами, а также в обуви с закрытым носком. Подумайте о надлежащей защите глаз, защите лица и головных уборах. Для утилизации отходов 4NQO должен быть помещен в маркированный контейнер в соответствии с институциональными руководящими принципами по управлению опасными отходами по охране окружающей среды и технике безопасности.
  3. Лечение 4NQO и мониторинг
    1. Прикрепите бутылку для питья и вводите мышам 4NQO через питьевую воду ad libitum в течение 16 недель. Используйте 10% (мас./об.) пропиленгликоля в качестве средства контроля (без обработки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более короткая продолжительность лечения 4NQO может быть использована для индукции IEN.
    2. Пополняйте воду один раз в неделю.
    3. Взвешивайте каждую мышь еженедельно, помещая ее в пластиковый контейнер на лабораторных весах.
    4. В конце 16-недельного периода лечения 4NQO начните давать мышам регулярную питьевую воду в течение периода наблюдения после 4NQO на срок до 12 недель (рис. 1).
    5. Ежедневно наблюдайте за мышами на наличие признаков дистресса (например, нарушение подвижности, сгорбленный габитус и замкнутое поведение), дисфагии и обезвоживания. Кроме того, еженедельно оценивайте мышей на предмет изменений массы тела или потребления пищи и жидкости. Если масса тела снизится более чем на 10% по сравнению с первоначальной массой тела, кормите мышей жидкой пищевой добавкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Потеря массы тела, невосприимчивая к жидким пищевым добавкам, может свидетельствовать о ESCC, и мышей, которые теряют более 20% массы тела, следует усыпить. Важно отметить, что MEO могут быть получены из преждевременно усыпленных мышей. Обратите внимание, что мыши C57BL/6 без генетических модификаций обычно не проявляют признаков заболеваемости или не имеют видимых поражений ESCC до конца периода наблюдения после 4NQO.
  4. Подготовка животных
    1. Усыпляют мышей в камере CO2 , заполненной CO2 со скоростью потока, которая вытесняет 30-70% объема камеры в минуту. Подтвердите смерть от вывиха шейки матки.
    2. Прикрепите конечности и нос мыши в положении лежа на спине к диссекционной платформе с помощью игл 21 G.
    3. Продезинфицируйте вентральную поверхность мыши 70% этанолом.
  5. Вскрытие (время рассмотрения: 0,5 ч)
    1. Откройте кожу, ущипнув мех и кожу в середине живота, чтобы убедиться, что она высвобождается из внутренних органов внизу. С помощью хирургических ножниц сделайте краниокаудальный вентральный срединный разрез от нижней части живота до подбородка.
    2. Начиная со среднего разреза, используйте хирургические ножницы, чтобы сделать радиальные разрезы, простирающиеся до конечностей с обеих сторон мыши. Слейте шкуру лоскутами.
    3. Чтобы обнажить шейную трахею, используйте рассекающие ножницы, чтобы разделить слюнные железы по средней линии. Трахея залегает глубоко в железах.
    4. Чтобы обнажить грудную трахею, удаляют грудину.
      1. Аккуратно зажмите и приподнимите брюшину щипцами, а ножницами разделите брюшину краниокаудально и латерально вдоль грудной клетки.
      2. Осторожно оттяните печень от каудальной поверхности диафрагмы и с помощью ножниц сделайте небольшой разрез в диафрагме в стернальной выемке, особенно на дорсальной поверхности мечевидного отростка. Это освобождает легкое и сердце от висцеральной плевры.
      3. Отделите грудную клетку от грудного содержимого. Вставьте ножницы в разрез диафрагмы и рассеките краниально до шейного пояса. Во время этого рассечения плотно придерживайтесь дорсальной поверхности грудины, чтобы избежать повреждения органов внизу. Следите за тем, чтобы плоскость рассечения находилась спереди от трахеи.
      4. Разрежьте ножницами ребра по обе стороны от грудины и удалите грудину. Убедитесь, что грудное содержимое обнажено.
    5. Обнажить брюшной отдел пищевода. Аккуратно приподнимите живот вперед, удерживая антральный отдел щипцами. Рассеките ножницами селезенку, поджелудочную железу и брыжейку желудка и пищевода.
    6. Обнажить грудной отдел пищевода (рис. 2).
      1. Аккуратно поднимите трахею сразу же каудально к щитовидному хрящу и рассеките пищевод тыльной стороны трахеи с помощью ножниц радужной оболочки.
      2. Разделите трахею на щитовидном хряще ножницами радужной оболочки.
      3. Очистите трахею от оставшейся части пищевода путем тщательного рассечения в каудальном направлении.
      4. Удалите легкое, сердце и тимус в массовом порядке вместе с трахеей. Следите за тем, чтобы избежать повреждения пищевода при рассечении и делении аорты и полой вены.
    7. Разделите живот у привратника ножницами.
    8. Отделите пищевод от позвонка, придерживая антральный отдел щипцами и рассекая краниально.
    9. Разделите пищевод на уровне щитовидного хряща и массово соберите пищевод и желудок (рис. 3).
    10. Разделите желудок и пищевод, разделив пищевод на кардии (рис. 4, верхняя панель, красная линия).
    11. Рассеките любую фасцию на внешней поверхности пищевода. Чтобы зарезервировать образец для гистологии (необязательно), удалите половину пищевода и разделите его в продольном направлении ножницами. Поместите оставшийся неповрежденный пищевод в холодный PBS на льду.
    12. Вскройте желудок по большей кривизне и достаточно промойте PBS. Отделите предбрюшную полость и промойте холодным PBS. Поместите предсердие в холодный PBS на льду.
    13. Чтобы собрать язык, удалите иглу 21 G на носу и вытащите язык пинцетом. Отрежьте язык как можно длиннее. Поместите язык в холодный PBS на лед.

2. Создание культуры органоидов пищевода мышей (MEO)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол также может быть использован для создания органоидной культуры мышиного языка с добавлением стадии, на которой ткань языка измельчается перед трипсинизацией. Смотрите примечание на шаге 2.2.3.

  1. Приготовление реагентов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Список реагентов можно найти в таблице материалов. Готовьте и храните исходные растворы в соответствии с инструкциями производителя, если не указано иное.
    1. Убедитесь, что одноразовые аликвоты матрицы базальной мембраны (BME), используемые в этом протоколе, хранятся при температуре -20 °C до дня использования, затем размораживаются на льду или при 2-8 °C и хранятся на льду все время, когда они не используются.
    2. Растворите 250 мг ингибитора трипсина сои (ИППП) в 1000 мл PBS (исходная концентрация 250 мг / мл) и простерилизуйте его (0,22 мкм). Распределите аликвоты по 50 мл в конические пробирки и храните до 6 месяцев при температуре 4 °C.
    3. Подготовьте органоидную среду мыши (MOM): дополните усовершенствованный DMEM/F12 1 мМ N-ацетил-L-цистеином (NAC), 2% R-спондином и кондиционированной средой Noggin (RN CM), 1x добавкой N-2, 1x добавкой B-27, 10 мМ HEPES, 1x антибиотиком-антимикотиком, 1x добавкой GlutaMAX и 100 нг/мл эпидермального фактора роста мыши (mEGF). Приготовьте MOM 500 мл за раз, разделите его на аликвоты по 50 мл и храните при температуре 2-8 ° C до готовности к использованию. Добавьте 0,5 мкг/мл амфотерицина B и 10 мкМ Y-27632 непосредственно перед использованием.
    4. Перед использованием предварительно подогрейте MOM, 0,25% трипсина и ингибитор трипсина (ИППП) сои до 37 °C в водяной или бисерной ванне.
  2. Выделение кератиноцитов из рассеченной ткани мыши (время рассмотрения: 2 ч)
    1. Переведите ткань пищевода в 500 мкл диспазы в PBS (всего 2,5-5 единиц) и инкубируйте в термомиксере в течение 10 мин при 37 ° C и 800 об/мин.
    2. Перенесите ткань в культуральную чашку и аккуратно удалите мышечный слой из эпителия с помощью щипцов (рис. 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг также может быть выполнен опытным исследователем перед инкубацией с диспазой.
    3. Перенесите эпителий в микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 мкл 0,25% трипсина, и инкубируйте в термомиксере в течение 10 мин при 37 °C и 800 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если исходным материалом является ткань языка, перед добавлением трипсина измельчите ткань стерильным скальпелем на более мелкие кусочки, размером примерно 1-2мм2 .
    4. Кратковременно центрифугу в течение 5-10 с при 2000 х г для гранулирования ткани. Подготовьте коническую пробирку объемом 50 мл с сетчатым фильтром 100 мкм. Круговыми движениями перенесите тканевую/клеточную суспензию через сетчатый фильтр с широким наконечником.
    5. Добавьте 3 мл ИППП через ситечко, круговыми движениями смывая.
    6. Потрите ситечко основанием туберкулинового шприца объемом 1 мл, чтобы протолкнуть клетки.
    7. Промыть ситечко 3 мл PBS 3-5 раз, протирая ситечко основанием шприца между стирками.
    8. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 10 мин при 4 ° C, чтобы гранулировать ячейки.
    9. Удалите надосадочную жидкость, оставив 1 мл раствора в пробирке.
    10. Ресуспендируют гранулу в оставшемся 1 мл и переносят клеточную суспензию через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм в новую коническую трубку объемом 50 мл.
    11. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 10 мин при 4 ° C, чтобы гранулировать ячейки.
    12. Ресуспендировать гранулы в 100 мкл MOM; При необходимости отрегулируйте громкость. Выполните автоматический подсчет ячеек с помощью исключения трипанового синего.
  3. Посев исходной клеточной суспензии (время рассмотрения: <1 ч)
    1. Предварительно разогрейте 24-луночную тарелку для культивирования клеток в инкубаторе с температурой 37 °C.
    2. Планшет 5,000 жизнеспособных клеток в 75% (об./об.) БМЭ/МОМ с общим объемом 50 мкл на лунку. Увеличьте количество покрытых скважин и подготовьте достаточное количество ячеек в BME для одной дополнительной скважины в соответствии с приведенными ниже примерами расчетов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Криоконсервируйте любые избыточные клетки в криоконсервирующей среде (10% ДМСО в FBS) при максимальной концентрации 1 x 106 клеток / мл. Храните криовиалы в морозильном контейнере в течение ночи при температуре -80 °C. Переведите их в парофазный жидкий азот для длительного хранения.
    3. В микроцентрифужной пробирке сначала приготовьте соответствующее разбавление ячеек в MOM, а затем добавьте BME с помощью наконечника с широким отверстием непосредственно перед нанесением покрытия.
    4. Используя наконечник отверстия шириной 200 мкл, медленно добавьте каплю объемом 50 мкл в центр лунки, избегая контакта между наконечником и дном или стенками скважины (рис. 5). Будьте осторожны, чтобы не приложить слишком много усилий, чтобы вытеснить жидкость из наконечника, иначе купол сплющется.
    5. Дайте BME затвердеть в течение 30 минут в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2, относительной влажностью (RH) 95%.
    6. Осторожно добавьте 500 мкл МОМ в лунку с добавкой 0,5 мкг/мл амфотерицина B и 10 мкМ Y-27632.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте амфотерицин ко всем MOM на протяжении всей исходной первичной культуры. Добавьте Y-27632 только в день прохождения (день 0) для всех проходов.
    7. Меняйте МОМ на 3-4 день, а затем каждые 2-3 дня после этого до готовности к прохождению.
    8. На 7-10 день сфотографируйте органоиды и измерьте скорость образования органоидов (OFR), разделив количество образованных органоидов на количество первоначально засеянных клеток.
      Примеры расчетов:
      figure-protocol-1
  4. Пассажирование и криоконсервация органоидов пищевода мышей (МЭО) (время рассмотрения: <1,5 ч)
    1. Разморозьте и держите BME на льду. Перед использованием разогрейте MOM, 0,05% трипсина и ИППП до 37 °C на водяной или бисерной бане. Предварительно разогрейте 24-луночную тарелку для культивирования клеток в инкубаторе с температурой 37 °C.
    2. Используя наконечник микропипетки с широким отверстием, соберите органоиды в куполе BME вместе с надосадочной жидкостью. Нарушайте BME, пипетируя вверх и вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соедините лунки, содержащие идентичные образцы, в одну микроцентрифужную пробирку.
    3. Кратковременно центрифугу в течение 10-15 с при 2000 x g для гранулирования органоидов. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
    4. Осторожно вытесните гранулу и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл 0,05% трипсина.
    5. Инкубируйте трубку (трубки) в термомиксере при 37 °C и 800 об/мин в течение 10 мин.
    6. Инактивируйте трипсин 600 мкл ИППП.
    7. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C, чтобы гранулировать ячейки.
    8. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендировать клеточную гранулу в 100 мкл MOM. Выполните автоматический подсчет ячеек с помощью исключения трипанового синего.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Громкость может быть отрегулирована по мере необходимости.
    9. Планшет 2,000-5,000 жизнеспособных клеток в 75% (об./об.) БМЭ/МОМ с общим объемом 50 мкл на лунку. Увеличьте количество покрытых скважин и подготовьте достаточное количество ячеек в BME для одной дополнительной скважины в соответствии с примерами расчетов, упомянутыми ранее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Криоконсервируйте любые избыточные клетки в криоконсервирующей среде (10% ДМСО в FBS) при максимальной концентрации 1 x 106 клеток / мл. Храните криовиалы в морозильном контейнере в течение ночи при температуре -80 °C. Переведите их в парофазный жидкий азот для длительного хранения.
    10. В микроцентрифужной пробирке сначала приготовьте соответствующее разбавление ячеек в MOM, а затем добавьте BME с помощью наконечника с широким отверстием непосредственно перед нанесением покрытия.
    11. Используя наконечник скважины шириной 200 мкл, медленно добавьте каплю объемом 50 мкл в центр скважины, избегая контакта между наконечником и дном или стенками скважины. Будьте осторожны, чтобы не приложить слишком много усилий, чтобы вытеснить жидкость из наконечника, иначе купол сплющется.
    12. Инкубируйте планшет в течение 30 минут в инкубаторе с температурой 37 °C, относительной влажностью 5% CO2,95%.
    13. Осторожно добавьте 500 мкл МОМ в лунку с добавлением 10 мкМ Y-27632.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте Y-27632 только в день прохождения (день 0). Нет необходимости добавлять его во время смены носителя. Добавление амфотерицина В больше не требуется.
    14. Меняйте МОМ на 3-4 день, а затем каждые 2-3 дня после этого до готовности к прохождению.
    15. На 7-10 день снимите органоиды и измерьте OFR.
  5. Размораживание и восстановление органоидов пищевода мышей (MEO) (время рассмотрения: <1 ч)
    1. Разморозьте и держите BME на льду. Предварительно разогрейте 24-луночную тарелку для культивирования клеток в инкубаторе с температурой 37 °C.
    2. Приготовьте 10 мл холодного или RT MOM или PBS в конической пробирке объемом 15 мл.
    3. Разморозьте криовиал на водяной бане с температурой 37 °C или в ванне с шариками в течение примерно от 30 с до 1 минуты или до тех пор, пока не останется небольшая ледяная гранула.
    4. Предварительно смачиваемым наконечником пипетки медленно переносите клеточную суспензию в пробирку, содержащую MOM или PBS, по каплям.
    5. Центрифугируйте пробирку в течение 300 x g и 4 °C в течение 5 мин, чтобы гранулировать ячейки.
    6. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендировать клеточную гранулу в 100 мкл MOM; При необходимости отрегулируйте громкость. Выполните автоматический подсчет ячеек с помощью исключения трипанового синего.
    7. Планшет 5 000-10 000 жизнеспособных клеток в 75% (об./об.) БМЭ/МОМ с общим объемом 50 мкл на лунку. Увеличьте количество покрытых скважин и подготовьте достаточное количество ячеек в BME для одной дополнительной скважины в соответствии с примерами расчетов, упомянутыми ранее.
    8. Перейдите к остальным этапам протокола пассажирования и криоконсервации органоидов пищевода мышей (MEO) (см. этап 2.4.11).

3. Подготовка органоидов к заделке парафина (время рассмотрения: <1 ч [плюс 1,5 ч на приготовление реагента])

  1. Используя наконечник микропипетки с широким отверстием, соберите по три лунки на микроцентрифужную пробирку. Соберите органоиды в куполе BME вместе с надосадочной жидкостью. Нарушайте BME, пипетируя вверх и вниз.
  2. Кратковременно центрифугу в течение 10-15 с при 2000 x g для гранулирования органоидов. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
  3. Осторожно вытесните гранулу и ресуспендируйте гранулу в 300 мкл 4% параформальдегида (PFA).
  4. Зафиксируйте органоиды на ночь при температуре 4 °C.
  5. Кратковременно центрифугу в течение 10-15 с при 2000 x g для гранулирования органоидов. Удалите и выбросьте как можно больше PFA.
  6. Аккуратно вытесните гранулу и ресуспендируйте гранулу в 500 мкл PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные органоиды можно хранить при температуре 4 ° C до 2 недель, прежде чем переходить к следующему этапу.
  7. Приготовьте 50 мл агарового геля (2% агара плюс 2,5% желатина).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте агаровый гель заранее, из-за времени инкубации, с последующим проведением цикла автоклава.
    1. Ресуспендировать 1 г бактоагара и 1,25 г желатина в 50 мл воды в 150 мл автоклавируемого стеклянного стакана.
    2. Взбейте суспензию и оставьте на 30-60 минут при RT.
    3. Автоклав в течение 20 мин при 121 °C.
    4. Слегка охладите и распределите аликвоты по 5 мл в конические пробирки по 15 мл.
    5. Хранить до 6 месяцев при RT.
  8. Подготовьте заделочную поверхность, перевернув микроцентрифужную стойку для пробирок и покрыв поверхность листом герметизирующей пленки. Этикетка с соответствующим идентификатором (идентификаторами) органоидов.
  9. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 5 мин, чтобы гранулировать органоиды. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
  10. Тем временем разжижают агаровый гель, помещая коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую агаровый гель, в стеклянный стакан объемом 150 мл, содержащий 100 мл воды, и разогревая в микроволновой печи на максимальной мощности в течение 1-2 минут или до тех пор, пока вода не начнет кипеть и агаровый гель не перейдет в жидкое состояние.
    ВНИМАНИЕ: Перед разогревом в микроволновой печи ослабьте крышку конической трубки, содержащей агаровый гель.
  11. Частично погрузите микроцентрифужную пробирку, содержащую органоидную гранулу, в теплую воду, не вводя воду в микроцентрифужную пробирку.
  12. Аккуратно наложите органоидную гранулу, добавив 50 мкл агара по боковой стороне пробирки.
  13. Не нарушая гранулы (не ресуспендировать, сохраняйте гранулы в целости и сохранности), перенесите гранулу в капле агарового геля на герметизирующую пленку на поверхности заделки.
  14. Повторите шаги 3.12 и 3.13 с дополнительными 50 мкл жидкого агарового геля, чтобы собрать оставшиеся органоидные гранулы, и осторожно добавьте к той же капле геля.
  15. Инкубируйте каплю, содержащую органоидную гранулу, в течение 45 мин при 4 °C.
  16. С помощью щипцов осторожно перенесите каплю, содержащую органоидную гранулу, на кассету с меткой патологии.
  17. Храните кассету в 70% этаноле при температуре 4 °C до 1 месяца.
  18. Приступайте к заделке парафина с помощью обычной гистологической обработки для приготовления парафиновых блоков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол описывает процесс получения органоидов пищевода мышей (MEO) из нормальной ткани пищевода или опухолевой ткани ESCC у мышей, обработанных 4NQO, в соответствии со специфической схемой лечения, состоящей из 16 недель введения 4NQO в питьевую воду с последующим периодом наблюдения от 10 до 12 недель (рис. 1). Затем мышей усыпляют для рассечения языка или ткани пищевода (рис. 2 и рис. 3). Описан способ выделения эпителиальн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существует несколько важных шагов и соображений для создания и анализа MEO в описанных здесь протоколах. Для обеспечения воспроизводимости и строгости экспериментов MEO важны как биологические, так и технические реплики. Для биологических реплик обычно достаточно двух-трех независимых мышей, несущих ESCC, в каждом экспериментальном условии. Однако соответствующее количество биологических реплик может варьироваться в зависимости от параметров, подлежащих проверке в отдельных исследованиях. Например, в настоящее время неиз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Общие ресурсы (проточная цитометрия, молекулярная патология, конфокальная и специализированная микроскопия) в Комплексном онкологическом центре им. Герберта Ирвинга при Колумбийском университете за техническую поддержку. Мы благодарим докторов Алана Дила, Адама Басса и Квок-Кин Вонга (NCI P01 «Механизмы канцерогенеза пищевода») и сотрудников лабораторий Рустги и Накагава за полезные обсуждения. Это исследование было поддержано следующими грантами NIH: P01CA098101 (H.N. и A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02

(Дж.Г.) R01CA266978 (К.Л.), R01DK132251 (К.Л.), R01DE031873 (К.Л.), P30DK132710 (К.М. и Х.Н.) и P30CA013696 (A.K.R.). Х.Н. и К.Л. являются лауреатами премии Колумбийского университета им. Герберта Ирвинга по комплексному онкологическому центру Multi-PI Pilot Award. Х.Н. является лауреатом премии Фонда исследований анемии Фанкони. F.M.H. является лауреатом премии Фонда Марка за исследования рака (20-60-51-MOME) и премии Американской ассоциации исследований рака. J.G. является лауреатом премии Американской гастроэнтерологической ассоциации (AGA).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% трипсин-ЭДТАThermo Fisher Scientific25-300-120
0,25% трипсин-ЭДТАThermo Fisher Scientific25-200-114
0,4% трипан синийThermo Fisher ScientificT10282
1 мл туберкулиновый шприц без иглыBD309659
1,5 мл микроцентрифужная пробиркаThermo Fisher Scientific05-408-129
100 &микро; m клеточное сетчатое фильтрThermo Fisher Scientific22363549
15 мл конические пробиркиThermo Fisher Scientific14-959-53A
200 &микро; L широкопроходные наконечники для микропипетокThermo Fisher Scientific212361A
21 G иглыBD305167
24-луночная пластинаThermo Fisher Scientific12-556-006
4-нитролинолин-1-оксид (4NQO)Tokyo Chemical IndustryNO250
50 мл конические трубкиThermo Fisher Scientific12-565-270
6 лунок пластинаThermo Fisher Scientific12556004
70 & микро; m клеточное сетчатое фильтрThermo Fisher Scientific22363548
99,9% этилен пропиленгликольSK picglobal
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634028
амфотерицин BGibco, Thermo Fisher Scientific15290018Stock Concentration 250 &микро; г/мл, конечная концентрация 0,5 &; г/мл
антибиотика-антимикотикаThermo Fisher Scientific15240062концентрация 100x, конечная концентрация 1x
B-27 добавкаThermo Fisher Scientific17504044концентрация 50x, конечная концентрация 1x
Bacto агарBD214010
CO2 инкубатор, например, Heracell 150iThermo Fisher Scientific51026406или эквивалент
Countess II FL Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX1000или эквивалент
CryovialsThermo Fisher Scientific03-337-7D
DietGel 76AClear H2O72-07-5022
Диметилсульфоксид (ДМСО)MilliporeSigmaD4540
DispaseCorning 354235Складская концентрация 50 Ед/мл, конечная концентрация 2,5&ндаш; 5 Ед/мл
Ножницы для препарированияVWR25870-002
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (PBS)Thermo Fisher Scientific14190250Концентрация 1x
Фетальная бычья сыворотка (FBS)HyCloneSH30071.03
ЩипцыVWR82027-386
Контейнер для заморозкиCorning432002или эквивалент
желатинаThermo Fisher ScientificG7-500
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Концентрация материала 100x, конечная концентрация 1x
HEPESThermo Fisher Scientific15630080Концентрация материала 1 M, конечная концентрация 10
mM Горячая плита/мешалкаCorningPC-420Dили эквивалент
Lab Ванна с броневыми шариками (или водяная баня)VWR89409-222или эквивалентные
лабораторные весыOhaus 71142841или эквивалент
экстракта базальной мембраны Matrigel (BME)Corning
MinispinEppendorf22620100или эквивалентный
штатив для микроцентрифугSouthern Labware0061
N-2 добавкаThermo Fisher Scientific17502048Концентрация 100x, конечная концентрация 1x
N-ацетилцистеин (NAC)Sigma-AldrichA9165Концентрация 0,5 M, конечная концентрация 1 мМ
Парапленка M оберткаThermo Fisher ScientificS37440
Параформальдегид (PFA)MilliporeSigma158127-500G
Патологоанатомическая кассетаThermo Fisher Scientific22-272416
Фазово-контрастный микроскопNikonили аналог
Рекомбинантный эпидермальный фактор роста мыши (mEGF)Peprotech315-09-1mgСтоковая концентрация 500 нг/&м; L, конечная концентрация 100 нг/мл
RN кондиционированная клеточная среда, экспрессирующая R-Spondin1 и Noggin (RN CM)N/AN/AДоступно через Organoid and Cell Culture Core по запросу, конечная концентрация 2%
Sorval ST 16R центрифугаThermo Fisher Scientific75004380или эквивалентный
ингибитор трипсина сои (ИППП)MilliporeSigmaT9128Стоковая концентрация 250 &; г/мл
ThermoMixer CThermo Fisher Scientific14-285-562 PMили эквивалент
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Исходная концентрация 10 мМ, конечная концентрация 10 мкм; М
Микроцентрифуга 354234

Ссылки

  1. Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
  2. Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
  3. Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
  4. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
  5. Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
  6. Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
  7. Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758(2017).
  8. Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
  9. Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
  10. Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
  11. Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
  12. Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
  13. Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
  14. Tang, X. -H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
  15. Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).
  16. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  17. Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224(2013).
  18. Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
  19. Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
  20. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
  21. Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
  22. Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
  23. Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479(2021).
  24. Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182(2021).
  25. Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

3D-органоидыкультура органоидовмикроокружение опухолиредактирование CRISPRвысокопроизводительный скринингткань пищевода мышизаливка парафиномдиссоциация клетокформирование органоидов
Моделирование плоскоклеточного рака полости рта и пищевода в 3D-органоидах
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.