Здесь мы представляем протокол культивирования изолированных отдельных нематод на твердых средах для отслеживания физиологических параметров на протяжении всей жизни и количественной оценки флуоресценции. Эта система культивирования включает в себя барьер пальмитиновой кислоты вокруг лунок с одним червяком, чтобы предотвратить бегство животных, что позволяет использовать аверсивные вмешательства, включая патогенные бактерии и химические стрессоры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Долгосрочное культивирование отдельных Caenorhabditis elegans на твердых средах для продольного флуоресцентного мониторинга и аверсивных вмешательств
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Caenorhabditis elegans широко используются для изучения биологии старения. Стандартной практикой в исследованиях старения C. elegans является культивирование групп червей на твердых средах для роста нематод (NGM), что позволяет эффективно собирать данные на уровне популяции для выживания и других физиологических фенотипов, а также периодический отбор проб субпопуляций для количественной оценки флуоресцентных биомаркеров. Ограничениями этого подхода являются неспособность (1) следить за отдельными червями с течением времени для развития возрастных траекторий для интересующих фенотипов и (2) контролировать флуоресцентные биомаркеры непосредственно в контексте культуральной среды. Альтернативные подходы к культивированию используют жидкую культуру или микрофлюидики для мониторинга отдельных животных с течением времени, в некоторых случаях включая количественную оценку флуоресценции, с компромиссом, заключающимся в том, что культурная среда контекстуально отличается от твердого NGM. WorMotel представляет собой ранее описанное микрофабрикованное многолуночное устройство для культивирования изолированных червей на твердых NGM. Каждый червь содержится в колодце, содержащем твердый NGM, окруженный рвом, заполненным сульфатом меди, контактным репеллентом для C. elegans, позволяющим проводить продольный мониторинг отдельных животных. Мы считаем, что сульфата меди недостаточно, чтобы предотвратить бегство червей при воздействии аверсивных вмешательств, распространенных в исследованиях старения, включая ограничения в питании, патогенные бактерии и химические агенты, вызывающие клеточный стресс. Многолуночные устройства также отлиты из полидиметилсилоксана, который создает артефакты с высоким фоном при флуоресцентной визуализации. Этот протокол описывает новый подход к культивированию изолированных круглых червей на твердых NGM с использованием коммерчески доступных полистирольных микролотков, первоначально разработанных для типирования лейкоцитарного антигена человека (HLA), что позволяет измерять выживаемость, физиологические фенотипы и флуоресценцию на протяжении всей жизни. Барьер пальмитиновой кислоты предотвращает бегство червей даже при наличии аверсивных состояний. Каждая пластина может культивировать до 96 животных и легко адаптируется к различным условиям, включая диетические ограничения, РНКи и химические добавки, и совместима с автоматизированными системами сбора данных о продолжительности жизни и активности.
Введение
C. elegans являются мощным модельным организмом для исследований в области генетики, клеточной биологии и молекулярной биологии, поскольку они легко культивируются в лаборатории, имеют короткое время генерации и продолжительность жизни, имеют высокую степень гомологии белка с млекопитающими и имеют прозрачную структуру тела, которая позволяет in vivo визуализировать флуоресцентные белки и красители1. В результате многолетнего использования C. elegans в качестве основной модельной системы в ряде областей, включая биологию развития и старение, их рост и развитие хорошо изучены, их геном был полностью секвенирован, и был....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Рецепты
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте исходные растворы перед началом подготовки пластин для микролотков.
- Исходные растворы для низкоплавких сред для роста агарозных нематод (lmNGM)
- Приготовьте 1 М К 2 ГПО4, растворив 174,18 г К2ХПО4 в1 л стерильной деионизированной воды во флаконе объемом 1 л. Автоклавируйте раствор при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 минут и храните его при комнатной температуре (RT).
- Приготовьте 1 М КПi (рН 6,0), растворив 136,09 г KH2HPO4 в 1 л стерильной деионизированной воды во флаконе объемом....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Описанная здесь среда культивирования одного червя на основе микролотка может быть использована для мониторинга различных фенотипов, включая продолжительность жизни и продолжительность здоровья, активность и движение, форму тела и геометрию ползания, а также экспрессию трансгенно экспрессированных флуоресцентных биомаркеров у отдельных животных с течением времени. Система культивирования микролотков совместима с анализом продолжительности жизни с помощью ручного подсчета очков или сбора изображений и последующего анализа.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем новую культуральную систему, которая адаптирует микролотки, первоначально разработанные для анализов типирования тканей на лейкоцитарный антиген человека, чтобы обеспечить изоляцию и характеристику отдельных C. elegans с течением времени в среде твердой среды, которая контекстуально похожа на NGM на основе агара, который является стандартом в исследованиях C. elegans. Эта система совместима с различными вмешательствами, включая диетические ограничения, экзогенное медикаментозное лече.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет каких-либо конфликтов интересов, которые они могли бы раскрыть.
Благодарности
Эта работа была поддержана NIH R35GM133588 для G.L.S., грантом на обучение NIHT32GM008659 для Лос-Анджелеса, премией Национальной академии медицины США за катализатор для G.L.S. и Фондом технологической и исследовательской инициативы штата Аризона, управляемым Советом регентов штата Аризона.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 3D-печатные вставки терасаки | Custom printing компания | Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL | FDM печать, размер сопла 0,6 мм с использованием стандартных систем PLA plus filament |
| AirClean AC624LF вертикальным вытяжным шкафом с ламинарным потоком | Fisher | Scientific 36-100-4376 | |
| Bacto пептон | Thermo Scientific | 211677 | |
| CaCl2 | Acros organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype штамм |
| карбенициллин | Goldbio | C-103-25 | |
| Холестерин | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Стандартный лабораторный корм для C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| FUdR | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Кристаллы гидратирующей воды | M2 Polymer Technologies | Тип S | Тип S суперабсорбирующий полимер |
| Изопропил ß-D-1-тиогалактопиранизид (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Leica K5 sCMOS монохромная камера | Leica Microsystems | 11547112 | |
| Leica M205 FCA Флуоресцентный стерео микроскоп | Leica Microsystems | 10450826 | |
| низкоплавкая агароза | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| NaCl | Биореагенты Fisher | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray Однолуночная пластина | Thermo Scientific | 264728 | |
| Нистатин | Sigma | N1538 | |
| Пальмитиновая кислота | Acros organics | 129700010 | |
| Бумажные полотенца | Coastwide Professional | 365374 | |
| Парапленка М | Парапленка | 16-101 | |
| Стратаген УФ страталинкер 2400 | Стратаген | 400075 | УФ сшиватель |
| лотки Terasaki (Лямбда) | Одна лямбда | 151431 | |
| термолин Dri-bath | Thermolyne | DB28125 | |
| Tween | Термо Сайентиал | J20605-AP |
Ссылки
- Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19784/ (2006).
- Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
