Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Долгосрочное культивирование отдельных Caenorhabditis elegans на твердых средах для продольного флуоресцентного мониторинга и аверсивных вмешательств

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64682

⸱

2 декабря 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол культивирования изолированных отдельных нематод на твердых средах для отслеживания физиологических параметров на протяжении всей жизни и количественной оценки флуоресценции. Эта система культивирования включает в себя барьер пальмитиновой кислоты вокруг лунок с одним червяком, чтобы предотвратить бегство животных, что позволяет использовать аверсивные вмешательства, включая патогенные бактерии и химические стрессоры.

Аннотация

Caenorhabditis elegans широко используются для изучения биологии старения. Стандартной практикой в исследованиях старения C. elegans является культивирование групп червей на твердых средах для роста нематод (NGM), что позволяет эффективно собирать данные на уровне популяции для выживания и других физиологических фенотипов, а также периодический отбор проб субпопуляций для количественной оценки флуоресцентных биомаркеров. Ограничениями этого подхода являются неспособность (1) следить за отдельными червями с течением времени для развития возрастных траекторий для интересующих фенотипов и (2) контролировать флуоресцентные биомаркеры непосредственно в контексте культуральной среды. Альтернативные подходы к культивированию используют жидкую культуру или микрофлюидики для мониторинга отдельных животных с течением времени, в некоторых случаях включая количественную оценку флуоресценции, с компромиссом, заключающимся в том, что культурная среда контекстуально отличается от твердого NGM. WorMotel представляет собой ранее описанное микрофабрикованное многолуночное устройство для культивирования изолированных червей на твердых NGM. Каждый червь содержится в колодце, содержащем твердый NGM, окруженный рвом, заполненным сульфатом меди, контактным репеллентом для C. elegans, позволяющим проводить продольный мониторинг отдельных животных. Мы считаем, что сульфата меди недостаточно, чтобы предотвратить бегство червей при воздействии аверсивных вмешательств, распространенных в исследованиях старения, включая ограничения в питании, патогенные бактерии и химические агенты, вызывающие клеточный стресс. Многолуночные устройства также отлиты из полидиметилсилоксана, который создает артефакты с высоким фоном при флуоресцентной визуализации. Этот протокол описывает новый подход к культивированию изолированных круглых червей на твердых NGM с использованием коммерчески доступных полистирольных микролотков, первоначально разработанных для типирования лейкоцитарного антигена человека (HLA), что позволяет измерять выживаемость, физиологические фенотипы и флуоресценцию на протяжении всей жизни. Барьер пальмитиновой кислоты предотвращает бегство червей даже при наличии аверсивных состояний. Каждая пластина может культивировать до 96 животных и легко адаптируется к различным условиям, включая диетические ограничения, РНКи и химические добавки, и совместима с автоматизированными системами сбора данных о продолжительности жизни и активности.

Введение

C. elegans являются мощным модельным организмом для исследований в области генетики, клеточной биологии и молекулярной биологии, поскольку они легко культивируются в лаборатории, имеют короткое время генерации и продолжительность жизни, имеют высокую степень гомологии белка с млекопитающими и имеют прозрачную структуру тела, которая позволяет in vivo визуализировать флуоресцентные белки и красители1. В результате многолетнего использования C. elegans в качестве основной модельной системы в ряде областей, включая биологию развития и старение, их рост и развитие хорошо изучены, их геном был полностью секвенирован, и было создано множество мощных генетических инструментов, включая полногеномные библиотеки питания РНК-интерференции и тысячи мутантных и трансгенных штаммов. Исторически сложилось так, что C. elegans культивируются как популяции на твердых агаровых нематодных питательных средах (NGM), а фенотипы оцениваются вручную либо путем прямого наблюдения, либо путем визуализации и последующего анализа. Флуоресцентная микроскопия используется для захвата различных молекулярных фенотипов с использованием красителей или трансгенно экспрессируемых флуоресцентных меток у отдельных C. elegans. Флуоресцентная визуализация обычно включает в себя фиксацию или парализацию животного на предметных стеклах, содержащих тонкие агарозные подушечки, что является инвазивным и часто смертельным. Он также включает использование химических веществ, таких как левамизол или азид натрия, которые потенциально могут вмешиваться в молекулярный процесс, представляющий интерес 2,3. Вместе эти подходы позволяют собирать перекрестные данные на уровне популяции по широкому спектру фенотипов, но не позволяют отслеживать отдельных животных с течением времени.

В последние годы появилось несколько подходов к культивированию изолированных C. elegans, что позволяет исследователям фиксировать динамические изменения физиологических и молекулярных фенотипов животных с течением времени с использованием новых технологий визуализации. Одной из категорий подхода к культуре C. elegans являются микрофлюидные устройства, в том числе WormFarm4, чип Nemalife5 и чип «поведения» Chronis et al.6, а также различные другие 7,8,9. С ними связаны методы культивирования на основе жидкости, в которых используются многолуночные планшеты для характеристики отдельных червей или небольших популяций с течением времени10,11. Микрофлюидика и микропланшетные системы обеспечивают отличные количественные измерения фенотипических реакций у C. elegans вплоть до одного животного, но культуральная среда представляет собой ключевое ограничение. Подавляющее большинство прошлых исследований C. elegans, особенно в области старения, было завершено на твердых средах на основе агара. Жидкая культура заставляет C. elegans непрерывно плавать и представляет собой особый экологический контекст, который может изменить лежащую в основе биологию. Например, у животных, культивируемых в жидких средах, резко изменилось содержание жира и экспрессия генов, особенно генов, участвующих в реакции на стресс, по сравнению с животными, культивируемыми на твердом веществе NGM12,13 на основе агара. Альтернативная категория методов визуализации на одном животном включает устройства из полидиметилсилоксана (PDMS), которые изолируют отдельных животных на твердых средах, чтобы более точно имитировать стандартную среду, в которой находятся черви, культивируемые на твердых NGM в групповой культуре на пластинах Петри. WorMotel - это 240-луночное устройство PDMS, предназначенное для культивирования отдельных животных на твердых средах. Каждая лунка заполняется модифицированным NGM с использованием низкоплавкой агарозы вместо агара и засевается бактериальной пищей, создавая твердую среднюю среду, аналогичную наиболее распространенной системе культивирования с использованием пластин Петри. Стенки колодца круглые, что позволяет визуализировать каждое животное независимо от его местоположения в колодце (избегая визуального затемнения, вызванного животным возле стены в многолуночной пластине). Медный купорос в узком рву, окружающем каждый колодец, используется в качестве отпугивающего фактора для содержания животных в их колодцах14,15. Ограничением этого подхода является то, что сульфат меди неэффективен для предотвращения бегства червей при наличии неблагоприятных условий окружающей среды, включая диетические ограничения, патогенные бактерии или химические вещества, вызывающие клеточный стресс (например, паракват).

Второй системой, в которой используются твердые среды, является загон для червей, в котором используется гидрогель для создания небольшой герметичной среды для каждого червя на предметном стекле, что позволяет осуществлять долгосрочный мониторинг индивидуально изолированных животных16. Ключевым ограничением является то, что животные должны быть запечатаны в окружающую среду в виде яиц, что требует использования стерильных животных для предотвращения размножения и ограничивает лекарственное лечение одним применением. Испытания многодозовых лекарств могут быть выполнены в WorMotel либо путем проведения нескольких раундов воздействия перед переносом червей в устройство, либо путем местного добавления дополнительных лекарств в лунки во время эксперимента; Однако в последнем случае фактическая доза воздействия после добавления дополнительного лекарственного средства в существующую лунку трудно поддается точному количественному определению и зависит от того, насколько быстро лекарство разлагается. И WorMotel, и Worm Corral отлично подходят для визуализации светлого или темного поля для сбора информации, связанной с активностью и физиологией животных (например, ростом и развитием). Хотя эти системы могут быть использованы для мониторинга флуоресценции, по нашему опыту, PDMS, используемая для создания других технологий визуализации с одним червем, склонна к образованию микропузырьков, улавливанию твердых частиц и другим небольшим аномалиям, которые генерируют нерегулярные флуоресцентные артефакты, которые мешают последовательной визуализации флуоресценции и количественной оценке, особенно в диапазоне излучения для GFP, наиболее распространенного флуорофора, используемого в исследованиях C. elegans. На сегодняшний день живая флуоресцентная визуализация отдельных животных C. elegans в продольном направлении в основном опирается на микрофлюидные устройства17.

Здесь мы описываем новый метод культивирования отдельных C. elegans на твердых средах, который совместим как с аверсивными вмешательствами, так и с прямой флуоресцентной визуализацией. Этот подход аналогичен по концепции другим технологиям визуализации с одним червем, за исключением того, что изготовленный по индивидуальному заказу чип PDMS заменяется коммерчески доступными полистирольными микролотками, первоначально разработанными для анализов микроцитотоксичности (также обычно называемыми лотками Терасаки)18. Эти микролотки имеют лунки, которые могут быть заполнены твердой средой и засеяны бактериальной пищей, точно имитирующей среду, в которой находятся животные в соответствии со стандартной методологией культивирования твердых NGM. Каждая скважина окружена аверсивным барьером из пальмитиновой кислоты, а не медного купороса. Пальмитиновая кислота обычно используется для предотвращения выхода червей из твердых сред, используя стандартную групповую культуру на пластинах Петри в экспериментах, где черви подвергаются воздействию неприятной среды, такой как диетические ограничения или воздействие химического стрессора. Микролотки также создают минимальный и стабильный флуоресцентный фон, что позволяет получать флуоресцентные изображения животных непосредственно в их культурной среде. Эта новая система культивирования на основе твердого агара для одного животного не только позволяет отслеживать отдельных животных на протяжении всей жизни и контролировать рост, развитие, активность и продолжительность жизни, но также совместима с прямой флуоресцентной микроскопией. Поскольку черви могут быть визуализированы без паралича или фиксации, биомаркеры флуоресценции in vivo могут быть количественно количественно определены в продольном направлении у отдельных животных, оставшихся на их питательных средах, что позволяет наблюдать динамические изменения в течение жизни каждого животного. Эта система культивирования также совместима с автоматизированными системами текущего поколения для отслеживания продолжительности жизни и других показателей здоровья14,19. Мы предоставляем подробный протокол культивирования отдельных C. elegans в этой системе на основе микролотков, обсуждаем потенциальные подводные камни и устранение неполадок, а также обсуждаем преимущества и ограничения по сравнению с другими системами и, в частности, обновленный и оптимизированный протокол WorMotel15.

Каждая среда для культивирования одного червя состоит из микролотка, установленного внутри стандартного однолуночного лотка с помощью специального адаптера, напечатанного на 3D-принтере (рис. 1A). Лунки заполнены питательной средой из низкоплавкой агарозной нематоды (lmNGM), засеяны концентрированными бактериями в качестве источника пищи и окружены оболочкой из пальмитиновой кислоты для предотвращения бегства червей (рис. 1B). Пространство между микролотком и стенками однолунковой пластины заполняется насыщенными кристаллами воды для поддержания влажности (рис. 1Б). На крышку лотка наносится моющее покрытие для предотвращения образования конденсата. В каждую лунку добавляется по одному червяку, а однолуночный лоток герметизируется Parafilm для поддержания влажности и обеспечения кислородного обмена. До шести микролотков могут быть подготовлены параллельно одним практикующим исследователем.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Рецепты

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте исходные растворы перед началом подготовки пластин для микролотков.

  1. Исходные растворы для низкоплавких сред для роста агарозных нематод (lmNGM)
    1. Приготовьте 1 М К 2 ГПО4, растворив 174,18 г К2ХПО4 в1 л стерильной деионизированной воды во флаконе объемом 1 л. Автоклавируйте раствор при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 минут и храните его при комнатной температуре (RT).
    2. Приготовьте 1 М КПi (рН 6,0), растворив 136,09 г KH2HPO4 в 1 л стерильной деионизированной воды во флаконе объемом 1 л. Титруют раствор 1 М К2HPO4 до достижения рН 6,0. Автоклавируйте раствор при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин и храните его при RT.
    3. Приготовьте 1 М CaCl 2, растворив 73,5 г CaCl2 в 500 мл стерильной деионизированной воды в бутылке объемом 500 мл. Автоклавируйте раствор при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 минут и храните его при RT
    4. Приготовьте 1 М MgSO 4, растворив 123,25 г MgSO4 в 500 мл стерильной деионизированной воды во флаконе объемом 500 мл. Автоклавируйте раствор при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин и храните его при RT.
    5. Приготовьте 3 М NaCl для lmNGM: в чистой бутылке объемом 100 мл смешайте 100 мл сверхчистой воды и 18,20 г NaCl. Автоклав при 121 °C, 15 фунтов/кв. дюйм, в течение 30 мин.
    6. Приготовьте 5 мг / мл холестерина, смешав 2,5 г холестерина, 275 мл 100% этанола и 25 мл стерильной деионизированной воды в янтарной бутылке объемом 500 мл. Автоклавируйте раствор при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин и храните его при RT.
    7. Приготовьте 50 мМ фтордезоксиуридина (FUdR), растворив 0,1231 г FUdR в 10 мл стерильной деионизированной воды в конической пробирке объемом 15 мл. Для стерилизации раствора используйте шприц объемом 10 мл и фильтр 0,22 мкм. Аликвотируйте по 1 мл раствора в 10 микроцентрифужных пробирок и храните их при -20 °C.
    8. Приготовьте 50 мг / мл карбенициллина, растворив 500 мг карбенициллина в 10 мл стерильной деионизированной воды в конической пробирке объемом 15 мл. Для стерилизации раствора используйте шприц объемом 10 мл и фильтр 0,22 мкм. Аликвотируйте по 1 мл раствора в 10 микроцентрифужных пробирок и храните их при -20 °C.
    9. Приготовьте 1 мМ изопропил ß-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG), растворив 2,38 г IPTG в 10 мл стерильной деионизированной воды в конической пробирке объемом 15 мл. Для стерилизации раствора используйте шприц объемом 10 мл и фильтр 0,22 мкм. Аликвотируйте по 1 мл раствора в 10 микроцентрифужных пробирок и храните их при -20 °C.
    10. Приготовьте 100 мг/мл ампициллина, растворив 1 г ампициллина в 10 мл стерильной деионизированной воды в конической пробирке объемом 15 мл. Для стерилизации раствора используйте шприц объемом 10 мл и фильтр 0,22 мкм. Аликвотируйте 1 мл раствора ампициллина по 100 мг/мл в 10 микроцентрифужных пробирок и храните пробирки при -20 °C.
  2. Подготовка питательных сред нематод (NGM) для общего содержания C. elegans
    1. Чтобы сделать 50 тарелок, растворите 10 г агара Bacto, 1,5 г NaCl и 1,25 г пептона Bacto в 486 мл сверхчистой воды в колбе объемом 1 л. Стерилизуйте среду, автоклавируя ее в жидком цикле при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение не менее 30 минут.
    2. После автоклава дайте среде остыть до 55 °C. Затем добавьте в раствор 12,5 мл 1 М КПi, 500 мкл 1 М MgSO4, 500 мкл 1 М CaCl2 и 500 мкл холестерина 5 мг/мл.
    3. Используя стерильный метод, налейте 10 мл среды, приготовленной на этапе 1.2.2, в каждую 60-миллиметровую пластину (всего 50). Оставьте пластины со средой не менее чем на 30 минут для застывания. Пипеткой нанесите 300 мкл выращенной на ночь бактериальной культуры на центр планшета и оставьте пластину на скамейке. Дайте культуре высохнуть и загустеть в течение 1-2 дней. Храните эти пластины NGM вместе с бактериями при температуре 4 °C.
  3. Приготовление пресмеси lmNGM
    1. В колбе Эрленмейера объемом 250 мл смешайте 2 г легкоплавкой агарозы, 0,25 г пептона, 1 мл 3 М NaCl и 99 мл сверхчистой воды. Автоклавируйте раствор при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин.
    2. Аликвотируйте 10 мл lmNGM в пробирки и накройте парапленкой, чтобы предотвратить потерю жидкости. Закройте тюбики крышками и дайте им остыть и затвердеть.
  4. Приготовьте 85 мМ NaCl для бактериальной пищи: во флаконе объемом 100 мл смешайте 515,61 мг NaCl и залейте до 100 мл сверхчистой водой. Автоклав при 121 °C, 15 фунтов/кв. дюйм, в течение 30 мин.
  5. Приготовьте водопоглощающие кристаллы полиакриламида, растворив 1 г суперабсорбирующего полимера типа S в 150 мл сверхчистой воды в автоклавируемой бутылке для отжима. Отрежьте наконечник, чтобы обеспечить достаточный размер дозирования. Автоклав при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин, накройте фольгой и встряхните, чтобы кристаллы перемешались.
  6. Приготовьте раствор моющего средства, соединив 3 мл 100% Tween-20 с 7 мл сверхчистой воды в коническом флаконе объемом 15 мл.
  7. Приготовьте 5 мг / мл холестерина, смешав 2,5 г холестерина, 275 мл 100% EtOH и 25 мл сверхчистой воды в бутылке объемом 500 мл.
  8. Приготовьте рабочий раствор пальмитиновой кислоты
    1. Измельчите 500 мг твердой пальмитиновой кислоты в ступке и пестике и соедините ее с 15 мл Tween-20 в коническом флаконе объемом 50 мл. Смешайте путем вихря, растворяя как можно больше кристаллов.
    2. Добавьте 17,5 мл 100% этанола и встряхните раствор, чтобы растворить как можно больше пальмитиновой кислоты.
    3. Добавьте 17,5 мл сверхчистой воды и тщательно встряхните. Осторожно нагрейте раствор в ванне с шариками при температуре 80 °C до полного растворения пальмитиновой кислоты. Некоторое количество пальмитиновой кислоты может выпадать в осадок при охлаждении.
  9. Приготовьте лизогенный бульон (LB), смешав 20 г порошка LB с 1 л деионизированной воды в стакане объемом 1 л или больше. Аликвотируйте 500 мл бульона в два стакана по 500 мл. Автоклавируйте бульон при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин. Храните приготовленный бульон при РТ.
  10. Приготовление агаровых пластин из лизогенного бульона (LB)
    1. Смешайте 10 г порошка LB и 7,5 г агара Bacto в 500 мкл деионизированной воды в колбе объемом 1 л. Автоклавируйте раствор в жидкостном цикле при 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 30 мин.
    2. При желании добавляют дополнительные антибиотики (500 мкл 100 мкг/мл ампициллина) после охлаждения автоклавной среды до 55 °C. Используя стерильную технику, сделайте агаровые пластины LB, наливая 20 мл среды в каждую 100-миллиметровую пластину (всего 25). Храните пластины при температуре 4 °C.

2. Подготовка популяции синхронизированных по возрасту червей

  1. Подготовьте популяцию синхронизированных по возрасту червей, готовых к добавлению в микролоток на личиночной стадии 4 (L4). В качестве альтернативы могут быть добавлены черви на любой стадии жизни (FUdR следует исключить из среды микролотка, если черви добавляются на стадии развития раньше, чем L4, чтобы предотвратить остановку развития).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен за 2 дня до добавления червей в микролоток, если целевой стадией жизни в начале эксперимента является L4. Время синхронизации может быть отрегулировано, чтобы позволить червям достичь желаемой стадии жизни.
  2. Температура может повлиять на продолжительность жизни. Для получения стабильных результатов используйте стандартные пластины NGM (см. Раздел 1) для поддержания C. elegans при 20 ° C и переносите червей на свежие тарелки, если у них заканчивается бактериальная пища.
  3. Из запасных пластин со многими молодыми взрослыми червями используйте стандартный подход для создания популяции, синхронизированной по возрасту, чаще всего обесцвечивая20 или откладывая яйцапо времени 21.
  4. Изолируйте яйца и добавьте их в тарелку NGM с пятнами бактерий. При использовании C. elegans дикого типа яйца вылупляются и образуют червей, достигая личиночной стадии L4 через 2 дня.

3. Подготовка культуры бактерий

  1. За день до начала эксперимента привите нужный бактериальный источник пищи. Подготовьте ~ 5 мл бактериальной культуры на тарелку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальная полоса может быть приготовлена за 1 месяц и храниться при температуре 4 ° C для источника пищи E. coli.
    1. Нанесите бактерии на отдельные колонии на агаровую пластину LB из замороженного глицеринового бульона.
    2. Выращивают культуру при температуре 37 °C в течение ночи.
    3. Инокулируйте жидкий бульон LB с одной колонией на инокуляцию.
    4. Встряхивать при ~250 об/мин при 37 °C в течение 12-16 часов.

4. Нанесение покрытия пальмитиновой кислотой на микролоток

ПРИМЕЧАНИЕ: Пальмитиновая кислота служит аверсивным барьером, предотвращающим бегство животных из отдельных лунок. Покрытие наносится на всю нижнюю поверхность микролотка, за исключением внутренних поверхностей лунок. Нистатин добавляют к пальмитиновой кислоте для смягчения грибкового загрязнения. При желании этот шаг можно выполнить за 1 день до начала эксперимента.

  1. Установите ванну с шариками на 80 °C, чтобы дать время для предварительного нагрева.
  2. Непосредственно перед использованием аликвотируют 1 мл рабочего раствора пальмитиновой кислоты на микролоток в отдельный стерильный контейнер (обычно конический флакон объемом 15 мл) и добавляют 4 мкл 10 000 ЕД/мл нистатина на 1 мл раствора пальмитиновой кислоты перед нагреванием.
  3. Распылите внутри и снаружи микролотка этанол (70% или более) до насыщения и стряхните излишки этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточный этанол должен испаряться во время обработки в УФ-сшивании (этап 4.4).
  4. Используйте УФ-сшивающий агент для стерилизации микролотка (следующие инструкции относятся к УФ-сшивающему агенту, используемому в этом исследовании):
    1. Поместите микролоток и крышку в УФ-сшивающий агент отдельно (т. е. не ставьте крышки на пластины, так как ультрафиолетовое излучение не проникает в пластик).
    2. Закройте дверцу и включите УФ-сшивающий агент.
    3. Нажмите «Время», введите 20 минут и нажмите «Пуск».
    4. Через 20 минут переверните тарелку и крышку и повторите шаги 4.2.2-4.2.3.
    5. Надев перчатки, поместите крышки на микролоток, чтобы предотвратить загрязнение после стерилизации.
  5. Рабочий раствор пальмитиновой кислоты тщательно перемешать путем вихряния и инвертирования.
  6. Поместите конический флакон объемом 15 мл с рабочим раствором пальмитиновой кислоты в ванну для шариков и дайте всем видимым кристаллам полностью раствориться перед использованием.
  7. Поместите микролоток на выступ, окружающий ванну с шариками, с закрытыми крышками на ~ 2 минуты, чтобы он прогрелся.
  8. Снимите крышку микролотка. Медленно добавьте 200 мкл рабочего раствора пальмитиновой кислоты через заднюю стенку (длинную сторону) микролотка. Закройте крышки и оставьте микролоток на ванну для шариков на 2-3 минуты, чтобы раствор пальмитиновой кислоты осяд на дно микролотка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что все дно микролотка не будет полностью покрыто до шага 4.10, раствор должен равномерно распределяться более чем по половине нижней поверхности. Если раствор пальмитиновой кислоты распределяется неравномерно, включите вихревой или вибрационный двигатель рядом с микролотком. Это обеспечит небольшую вибрацию, которая поможет раствору пальмитиновой кислоты легче распространяться. Держите крышки микролотков на месте, чтобы смягчить загрязнение.
  9. Повторите шаг 4.8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно половина или более дна микролотка должны быть заметно покрыты жидкой пальмитиновой кислотой.
  10. Поверните микролоток на 180° и повторите шаги 4.8 и 4.9 с другой стороны лотка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дно лотка Terasaki будет покрыто тонким слоем раствора пальмитиновой кислоты только после того, как полный объединенный объем будет добавлен с обеих сторон (этапы 4.9 и 4.10). Может потребоваться более или менее смесь пальмитиновой кислоты в зависимости от приготовления смеси, температуры и других факторов. Как правило, от 400 до 800 мкл смеси пальмитиновой кислоты будет достаточно, чтобы покрыть все дно микролотка. Как только дно микролотка будет заметно покрыто, не следует добавлять дополнительную пальмитиновую кислоту, так как это может загрязнить лунки.
  11. Сушите лоток в стерильной сушильной камере или вытяжке с ламинарным потоком не менее 1 часа без крышки. В качестве альтернативы выполните этот шаг за день до загрузки пластин (раздел 5), высушив микролоток с закрытой крышкой при RT в течение не менее 16 часов.

5. Загрузка микролотка средой для роста нематод с низким содержанием расплава (lmNGM)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом методе вместо обычного агара используется стандартный NGM, смешанный с легкоплавкой агарозой. Агар может начать желироваться при 45 ° C. При работе с небольшими объемами, необходимыми для заполнения лунок микролотка, NGM на основе агара часто забивает наконечник пипетки и/или создает неровные поверхности лунок из-за быстрого гелеобразования. NGM, использующий низкоплавкую агарозу, начинает гелеобразить при ~ 28 °C, что позволяет легко пипетировать расплавленную среду и последовательно формировать плоские поверхности скважин. Приготовьте lmNGM в тот же день, когда черви должны быть помещены в микролоток. Если вы готовите микролоток с lmNGM, засеваете бактерии и загружаете C. elegans в течение одного дня, убедитесь, что животные находятся в желаемом возрасте или близки к нему, прежде чем начинать этот набор шагов.

  1. Поместите таз для пипеток в ванну с шариками при температуре 80 °C, чтобы она согрелась.
  2. Растопите одну 10 мл пресмеси lmNGM на каждый готовящийся микролоток (шаг 1.1) в микроволновой печи в течение ~30-45 с.
    1. Поместите пробирки с предварительной смесью lmNGM в стакан объемом 200 мл без крышки, чтобы они не опрокинулись.
    2. Через ~ 10-15 с или когда предварительная смесь lmNGM только начинает пузыриться, приостановите микроволновую печь, вылейте смесь lmNGM в стерильный стакан объемом 200 мл и возобновите приготовление в микроволновой печи.
    3. Сделайте паузу по мере необходимости, чтобы он не закипел, и перемешайте.
    4. Прекратите разогревать в микроволновой печи, как только весь lmNGM превратится в жидкость без кусочков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одной аликвоты объемом 10 мл достаточно, чтобы заполнить в общей сложности 192 лунки (два микролотка).
  3. Приготовьте lmNGM, добавив следующие компоненты в указанном порядке к теплой агарозе с низким расплавом (объемы указаны на 10 мл низкоплавкой агарозы): 250 мкл 25 мМ KPi (рН 6), 10 мкл 1 М CaCl2, 10 мкл 1 М MgSO4 и 10 мкл 5 мг/мл холестерина
    1. Если исследователь планирует исследовать взрослых животных с течением времени и ему необходимо предотвратить размножение, также добавьте 10 мкл 50 мМ FUdR.
    2. При проведении эксперимента по питанию РНК-интерференцией с использованием распространенного штамма HT115 РНКi E. coli и связанных с ним плазмид РНКi также добавьте 5 мкл 50 мг/мл карбенициллина (для выбора плазмиды РНКи) и 12 мкл 1 мМ IPTG (для индукции экспрессии двухцепочечной РНК из плазмиды РНКи).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные добавки могут быть включены в зависимости от селективных антибиотиков и других химических веществ, необходимых для желаемого источника пищи. На этом этапе к lmNGM также могут быть добавлены лекарства или химические стрессоры. NGM и lmNGM содержат одинаковую конечную концентрацию NaCl, но различаются по способу добавления NaCl в среду. Для NGM весь NaCl добавляется во время подготовки среды (этап 1.2). Для lmNGM часть NaCl добавляют во время подготовки среды (этап 5.3) и порцию с бактериальной пищей (раздел 6). Причина этого изменения связана с небольшим объемом носителя в каждом микролотке. Добавление 5 мкл концентрированных бактерий, взвешенных в LB, в лунку, содержащую 20 мкл среды, существенно изменит питательный состав среды (путем добавления компонентов LB в сопоставимом объеме). Чтобы избежать этого, бактерии вместо этого ресуспендируют в растворе NaCl для удаления компонентов LB, предотвращая осмотический стресс для бактерий. NaCl, добавляемый в среду, соответственно уменьшается, чтобы учесть соль, добавленную к бактериям.
  4. Налейте lmNGM в подогретый таз для пипеток.
  5. Положив микролоток на столешницу, введите в каждый микролоток 20 мкл lmNGM. Накрывайте микролоток при заправке пипетки, чтобы свести к минимуму загрязнение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг проще с электронной повторяющейся пипеткой.

6. Засеивание лунок микролотков бактериальной пищей

ПРИМЕЧАНИЕ: 5 мкл 10-кратного концентрированного корма из инокулированной культуры на ночь достаточно, чтобы кормить одного C. elegans в течение всей его жизни.

  1. Перенесите бактерии из ночной культуры в конический флакон объемом 50 мл.
  2. Центрифуга при ~ 3 500 x g в течение 20 мин.
  3. Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируют культуру бактерий в 10-кратной концентрации (1/10 объема исходной культуры) раствором NaCl 85 мМ.
  4. Перед добавлением бактерий в лунки визуально осмотрите микролоток, чтобы убедиться, что твердый lmNGM полностью содержится в каждой лунке. Если какой-либо lmNGM свисает со стороны колодца, соскребите излишки lmNGM наконечником пипетки. Эта избыточная среда может привести к тому, что пища попадет в пальмитиновую кислоту, если ее не очистить.
  5. Осторожно нанесите 5 мкл 10-кратной концентрированной бактериальной культуры на поверхность lmNGM в каждой лунке. Старайтесь не допускать, чтобы культура бактерий стекала через стенку колодца и попадала в пальмитиновую кислоту, так как это привлечет червей, покидающих колодец.
  6. Дайте микролоткам высохнуть в стерильной сушильной камере или вытяжке с ламинарным потоком в течение ~35 минут. Проверяйте каждые ~ 5 минут и следите за тем, чтобы не пересушить. Удаляйте, когда несколько лунок будут заметно слегка влажными, так как лунки будут высыхать дальше, пока добавляются нематоды.

7. Заключение каждого микролотка в однолуночную пластину

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе микролоток устанавливается внутри стандартной однолуночной пластины с помощью специальной вставки, напечатанной на 3D-принтере, и окружен водопоглощающими кристаллами. Затем однолуночная пластина закрывается и герметизируется Parafilm. Это обеспечивает кислородный обмен, предотвращая загрязнение и поддерживая достаточную влажность, чтобы предотвратить высыхание lmNGM в ходе многонедельных экспериментов (эксперименты с продолжительностью жизни червей могут длиться 6-8 недель, если изучать мутации, продлевающие продолжительность жизни, или условия окружающей среды). Во время приготовления обязательно накрывайте тарелку всякий раз, когда что-то не добавляется активно, чтобы свести к минимуму бактериальное или грибковое загрязнение.

  1. Стерилизуйте однолуночную пластину, адаптер и крышку, напечатанные на 3D-принтере, окунув каждую в 10% раствор отбеливателя. Тщательно смойте стерильной деионизированной водой. Вытрите насухо рабочей салфеткой.
  2. Опрыскайте однолуночную пластину и адаптер, напечатанный на 3D-принтере, а также крышку раствором этанола 70% или более и протрите рабочей салфеткой. Дайте остаткам этанола высохнуть на воздухе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: УФ-излучение также можно использовать после отбеливания и этанола с теми же параметрами, что и микролоток, как описано выше на шаге 4.4.
  3. Поместите стерильный вкладыш, напечатанный на 3D-принтере, в стерильную однолуночную пластину.
  4. Простерилизуйте подготовленный микролоток снаружи, сбрызнув его 70% этанолом.
  5. Поместите микролоток в адаптер, напечатанный на 3D-принтере, в однолунковой пластине.
  6. Откажитесь от крышки микролотка.
  7. Обильно распределите кристаллы воды поверх 3D-печатной вставки между внешней стенкой микролотка и внутренней стенкой однолуночной пластины.
  8. Немедленно добавьте червей (раздел 8) или запечатайте микролоток, чтобы использовать его на следующий день. Закройте крышку лотка и используйте один кусок парапленки, чтобы обернуть все четыре стороны, чтобы запечатать микролоток. Повторите этап запечатывания с помощью Parafilm еще два раза, чтобы получить в общей сложности три слоя.
  9. После запечатывания микролотка оставьте его на стенде при РТ на срок до 4 дней, прежде чем добавлять червей (раздел 8).

8. Добавление червей в микролоток

ПРИМЕЧАНИЕ: Один червь может быть добавлен вручную в каждую лунку путем переноса животных из популяций червей с синхронизацией по возрасту (раздел 2) с помощью платинового пика. Переводите животных только на нужном этапе жизни. Если процесс переноса занимает более 1 часа, lmNGM в лунках микролотка может высохнуть. Перенос групп от 10 до 20 червей за раз может ускорить этот шаг, но требуется некоторая практика, чтобы последовательно выпускать только одно животное в лунку.

  1. Добавьте по одной нематоде в лунку, как только они достигнут желаемой стадии жизни.
  2. Наденьте крышку на микролоток при сборе червей с исходной пластины, чтобы свести к минимуму загрязнение.

9. Финишная подготовка культурной среды к длительному использованию

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются для обеспечения того, чтобы среда и черви в микролотке оставались гидратированными в течение всего эксперимента.

  1. Добавьте ~ 40 мкл раствора моющего средства в крышку однолуничной пластины и используйте рабочую салфетку, чтобы равномерно покрыть крышку. Это покрытие предотвратит образование конденсата с течением времени после герметизации пластины. Используйте дополнительные рабочие салфетки, чтобы распределить раствор моющего средства до тех пор, пока зрение через крышку не исказится (обычно для этого требуется около двух рабочих салфеток).
  2. Осмотрите кристаллы воды, чтобы убедиться, что они находятся на одном уровне с верхним краем микролотка и не переполняются. При необходимости добавьте или удалите кристаллы воды в тарелку.
  3. Используя следующий подход, оберните лоток Parafilm (всего три штуки), чтобы гарантировать, что уплотнение Parafilm прослужит долго.
    1. Слегка растяните первый кусок парапленки, чтобы покрыть две стороны лотка.
    2. Слегка растяните второй кусок парапленки и накройте остальные стороны лотка.
    3. Растяните последний кусок Parafilm и полностью оберните все четыре стороны лотка, покрывая первый и второй кусочки Parafilm. Правильно запечатанный микролоток может оставаться гидратированным в течение ~ 2 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте целостность Parafilm каждые 1-2 недели на протяжении всего эксперимента и заменяйте его по мере необходимости.
    4. Протрите верхнюю часть лотка рабочей салфеткой, влажной с 70% этанолом, чтобы удалить отпечатки пальцев.
  4. Наклейте этикетки на однолуночную пластину с помощью скотча. Теперь микролоток готов к визуализации и долгосрочному хранению для мониторинга червей с течением времени. Между сеансами визуализации держите лоток при температуре 20 °C. Микролоток можно открывать и снова закрывать несколько раз для дозирования лекарств или других процедур, но его следует свести к минимуму, чтобы предотвратить загрязнение и потерю влаги.

10. Визуализация отдельных червей в лунках микролотков

ПРИМЕЧАНИЕ: Целью данного протокола является подробное описание того, как подготовить среду для культивирования микролотков. После подготовки и заселения червями среды культивирования одного червя в микролотке можно использовать для продольного мониторинга многих фенотипов с использованием методов, установленных для стандартного культивирования на планшетах Петри. В следующем разделе приведены основные инструкции по измерению некоторых распространенных фенотипов. Флуоресцентная визуализация должна выполняться в вертикальном микроскопе. Преломление света через поднос Терасаки сведено к минимуму в темном помещении.

  1. Продолжительность жизни: Измерьте продолжительность жизни, осторожно постукивая по боковой или верхней части тарелки или светя ярко-синим светом на тарелку и наблюдая за каждым животным. Засчитывайте животное «мертвым», если оно не двигается в течение нескольких секунд. Повторяйте эту задачу каждые 1-3 дня, пока все черви не погибнут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда культивирования микролотков совместима с системами, которые автоматизируют сбор и анализ изображений для оценки продолжительности жизни14,19.
  2. Стандартная микроскопия: Выполняйте визуализацию светлого поля (или темного поля) на отдельных лунках или на всем лотке с помощью камеры или сканера высокого разрешения. Эти данные визуализации могут быть использованы для различных фенотипов, включая размер животного 22,23,24, развитие 25, активность 14,19 и продолжительность жизни.
  3. Флуоресцентная микроскопия: Выполняйте флуоресцентную визуализацию на отдельных лунках вручную или с помощью моторизованной платформенной системы. Однолуночные лотки совместимы со стандартными многолуночными пластинчатыми адаптерами. Соотношение сигнал/шум сводится к минимуму, если аппарат помещен в коробку с черными стенками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку черви визуализируются, оставаясь свободными для ползания, эта культуральная система хорошо подходит для визуализации с низким разрешением, чтобы захватить флуоресценцию всего тела и локализацию флуорофоров в грубых тканях. Визуализация с высоким разрешением и большим увеличением обычно требует, чтобы животные были обездвижены, чтобы предотвратить движение. Несмотря на то, что должна быть возможность местного применения парализующего агента (например, азида натрия или левамизола) к каждой лунке и продолжения визуализации с более высоким разрешением, это исключило бы повторные измерения одного и того же червя в более поздние моменты времени. Культуральная система, как описано, также не предназначена для инвертирования, что препятствует использованию систем инвертированного микроскопа.
    1. Если светлое поле не используется для измерения продолжительности жизни, а улавливается только флуоресценция, измерьте продолжительность жизни вручную. Оставление синего света (используемого для возбуждения GFP) на черве в течение 5 с побудит животное двигаться. Если животное не двигалось в течение 5 с, считайте животное мертвым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанная здесь среда культивирования одного червя на основе микролотка может быть использована для мониторинга различных фенотипов, включая продолжительность жизни и продолжительность здоровья, активность и движение, форму тела и геометрию ползания, а также экспрессию трансгенно экспрессированных флуоресцентных биомаркеров у отдельных животных с течением времени. Система культивирования микролотков совместима с анализом продолжительности жизни с помощью ручного подсчета очков или сбора изображений и последующего анализа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем новую культуральную систему, которая адаптирует микролотки, первоначально разработанные для анализов типирования тканей на лейкоцитарный антиген человека, чтобы обеспечить изоляцию и характеристику отдельных C. elegans с течением времени в среде твердой среды, которая контекстуально похожа на NGM на основе агара, который является стандартом в исследованиях C. elegans. Эта система совместима с различными вмешательствами, включая диетические ограничения, экзогенное медикаментозное лече...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет каких-либо конфликтов интересов, которые они могли бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH R35GM133588 для G.L.S., грантом на обучение NIHT32GM008659 для Лос-Анджелеса, премией Национальной академии медицины США за катализатор для G.L.S. и Фондом технологической и исследовательской инициативы штата Аризона, управляемым Советом регентов штата Аризона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3D-печатные вставки терасакиCustom printing компанияRobot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		FDM печать, размер сопла 0,6 мм с использованием стандартных систем PLA plus filament
AirClean AC624LF вертикальным вытяжным шкафом с ламинарным потокомFisherScientific 36-100-4376
Bacto пептонThermo Scientific211677
CaCl2 Acros organics349615000
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2Wildtype штамм
карбенициллинGoldbioC-103-25
ХолестеринICN Biomedicals Inc101380
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Стандартный лабораторный корм для C. elegans
EthanolMilliporeex0276-4
Fisher Vortex Genie 2Fisher ScientificG-560
FUdR Research Products InternationalF10705-1.0
Кристаллы гидратирующей воды M2 Polymer TechnologiesТип SТип S суперабсорбирующий полимер
Изопропил ß-D-1-тиогалактопиранизид (IPTG)GoldBioI2481C100
K2HPO4Fisher ChemicalP288-500
KimwipesKimTech34155Task wipes
LB Broth, LennoxBD Difco240230
Leica K5 sCMOS монохромная камераLeica Microsystems11547112
Leica M205 FCA Флуоресцентный стерео микроскопLeica Microsystems10450826
низкоплавкая агарозаResearch Products InternationalA20070-250.0
MgSO4 Fisher ChemicalM-8900
NaClБиореагенты FisherBP358-1
Nunc OmniTray Однолуночная пластинаThermo Scientific264728
НистатинSigmaN1538
Пальмитиновая кислотаAcros organics129700010
Бумажные полотенцаCoastwide Professional365374
Парапленка МПарапленка16-101
Стратаген УФ страталинкер 2400Стратаген400075УФ сшиватель
лотки Terasaki (Лямбда)Одна лямбда151431
термолин Dri-bathThermolyneDB28125
Tween Термо СайентиалJ20605-AP

Ссылки

  1. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19784/ (2006).
  2. Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).
  3. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
  4. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  5. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).
  6. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  7. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , Academic Press. Chapter 13 295-321 (2021).
  8. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  9. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9 (1), 14340(2019).
  10. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496(2011).
  11. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745(2011).
  12. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30(2017).
  13. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562(2018).
  14. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  15. Turner, E., et al. Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  16. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  17. Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).
  18. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  19. Freitas, S. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. , Available from: https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628 (2021).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  21. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  22. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape. PloS One. 8 (2), 57142(2013).
  23. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).
  24. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), Taylor & Francis. 982437(2014).
  25. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).
  26. Peters, M. J., et al. The transcriptional landscape of age in human peripheral blood. Nature Communications. 6 (1), 8570(2015).
  27. Sutphin, G. L., et al. Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity. Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).
  28. Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. Automation of C. elegans lifespan measurement. Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Долгосрочное культивирование отдельных Caenorhabditis elegans на твердых средах для продольного флуоресцентного мониторинга и аверсивных вмешательств
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.