Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Совместная ферментация Marsdenia tenacissima с Ganoderma lucidum и противораковый эффект продуктов ферментации

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64687

⸱

16 декабря 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Minzu University of China, 2Ministry of Education, Key Laboratory of Ethnomedicine (Minzu University of China)

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье мы описываем протокол создания систематической и всеобъемлющей системы совместной ферментации для производства продуктов биотрансформации, богатых острыми сапонинами, с использованием Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (MT) в качестве среды для ферментации Ganoderma lucidum. Это послужит методологическим ориентиром для разработки других этнических наркотиков.

Аннотация

Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (МТ), как традиционная китайская и дайская фитотерапия, обладает противовоспалительными, антибактериальными и противоопухолевыми свойствами. Тем не менее, большинство его основных активных веществ являются агликонами, такими как тенацигенин А и тенацигенин В. Поскольку биодоступность МТ низкая, а его лекарственные активные компоненты трудно синтезировать, его в первую очередь изучают методом биотрансформации. Данное исследование направлено на получение продуктов биотрансформации, богатых острыми сапонинами, с использованием МТ в качестве среды для ферментации Ganoderma lucidum (G. lucidum).

Путем предварительного скрининга трех лекарственных грибов было обнаружено, что G. lucidum и Ophiocordyceps sinensis (O. sinensis) в целом могут расти в среде для МТ; Следовательно, эффективность ферментации двух типов грибов была проверена с использованием мышиной модели рака легких. Наконец, для дальнейших исследований была выбрана совместная ферментация G. lucidum и MT. Нецелевой метаболомический анализ проводили на продуктах МТ с коферментацией G. lucidum . Мы идентифицировали 12 специфических сапонинов МТ из продуктов ферментации и получили мономерное соединение тенацигенин А из продуктов ферментации.

Большая часть тенацигенина показала значительную тенденцию к росту через уровни тенацигенина А и тенацигенина В. Результаты показали, что эффективность МТ улучшилась после ферментации G. lucidum. Кроме того, биотрансформация стероидных гликозидов C21 в МТ была центральной реакцией в этом процессе ферментации. Таким образом, в этом исследовании была создана систематическая и всесторонняя система коферментации и метод фармакодинамической оценки МТ, который не только способствовал полному использованию эффективных активных веществ в МТ, но и послужил методологической основой для разработки других этнических препаратов.

Введение

Рак легких относится к категории «карбункул легких» в традиционной китайской медицине. Патогенез карбункула легких заключается в слабости здоровой «Ци» пациентов, дисбалансе Инь и Ян, токсинах и застое в легких, приводящих к дисфункции легких, закупорке крови и потере жидкости в легких. Таким образом, длительный застой крови и токсины мокроты в легких образуют легочную массу1. Поэтому усиление Ци и устранение патогенных факторов является основным принципом лечения рака легких. Методы питания Инь для баланса Инь и Ян, очищения от жара, детоксикации и рассеивания застоя, дополнения Ци и питания Инь, а также очищения мокроты используются для лечения и предотвращения образования карбункулов легких2.

Marsdenia tenacissima (MT) — лекарственное растение, принадлежащее к семейству Asclepiadaceae (Marsdenia ssp.), также известное как Wuguteng. Он обладает эффектами очищения от жара и детоксикации, облегчения кашля и астмы, а также обладает противоопухолевыми свойствами3. Инъекция Сяоайпин, препарат, изготовленный из одной травы МТ, широко используется в клиниках и показывает хороший терапевтический противоопухолевый эффект4. Однако с увеличением населения спрос на МТ резко возрос. Соответственно, запасы диких ресурсов МТ недостаточны, а качество культивируемого лекарственного сырья неравномерно. Существуют такие проблемы, как низкое качество растительного сырья, нестабильное содержание ингредиентов и низкая биодоступность, которые серьезно угрожают развитию МТ. Среди этих биологически активных соединений сапонины из МТ были тщательно изучены. Было идентифицировано более 100 сапонинов из МТ; их можно разделить на два основных типа: (1)С21 стероидные гликозиды в МТ, включая тенациссозид А-, марсденозид А-М, тенацигенозид А-Л и тенацигенин А-D. (2) Пентациклические тритерпены, такие как олеаноловая кислота и урсоловая кислота. Многие исследования показали, что противоопухолевая активность экстрактов петролейного эфира выше, чем у высокополярных молекул МТ. Следовательно, целесообразно превращать основной полисахарид сапонинов из МТ в другой минорный агликон МТ с более высокой биодоступностью и биологической активностью.

Биотрансформация, также известная как биокатализ, относится к физиологическим и биохимическим реакциям трансформации или структурной модификации экзогенных субстратов с использованием родственных ферментов в биологических системах6. Он является более экономичным, безопасным, регионально селективным и стереоселективным, чем традиционный химический синтез, и может производить некоторые биологически активные соединения, которые трудно получить с помощью обычной синтетической химии 7,8. Таким образом, развитие традиционной китайской медицины и природных лекарств имеет важное значение для содействия модернизации и интернационализации традиционной китайской медицины.

Система коферментации МТ была создана с использованием биотрансформации. Исходное лекарственное сырье было преобразовано микробными ферментными системами. С одной стороны, экстракт МТ использовался в качестве субстрата для получения ферментационной культуры грибов в этом режиме. В то же время грибковая ферментация сократила цикл размножения бактерий, снизила производственные затраты и повысила эффективность производства9. С другой стороны, повышенное осаждение активных компонентов в результате грибковой ферментации является полезным, производя химические компоненты и повышая эффективность10. Использование технологии жидкостной двусторонней ферментации полезно для защиты активных ингредиентов лекарственных материалов, повышения эффективности, экономии источников лекарств и может повысить эффективность за счет предоставления методов структурной модификации активных ингредиентов растительных материалов. Большое значение имеет повышение уровня модернизации традиционной китайской медицины.

В этом исследовании G. lucidum, O. sinensis и Inonotus obliquus (I. obliquus) были выбраны в качестве ферментационных микроорганизмов на ранней стадии после обзора литературы, а штаммы были предварительно подвергнуты скринингу. Затем были определены окончательные штаммы ферментации путем изучения эффективности скрининговых штаммов на модели опухолевой мыши. Наконец, первичные метаболиты и вторичные метаболиты продуктов ферментации были систематически проанализированы и оценены с помощью LC-MS, и мы получили мономерное соединение, тенацигенин А, из продуктов ферментации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данное исследование было проведено в соответствии с рекомендациями Центра экспериментальных животных Университета Миньцзу (No. ECMUC2019008AA). Протокол был одобрен Комитетом по этике экспериментальных животных Университета Миньцзу. МТ был собран в провинции Куньмин, провинция Юньнань.

1. Подготовка к учебе

  1. Экстрагируйте MT горячей водой (100 °C; MT/water = 1/10, w/v) в течение 30 мин и соберите остаток экстракции MT в качестве исследуемого материала.
  2. Поддерживайте клеточную линию рака легкого мыши LLC в модифицированной среде Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина во влажной атмосфере при 37 °C при 5%CO2.
  3. Держите мышей C57BL/6J в возрасте 6-8 недель и весом 19 ± 2 г в помещении с контролируемой окружающей средой с циклом свет/темнота 12 ч/12 часов и с неограниченным доступом к пище и воде. Регулярно дезинфицируйте их.

2. Предварительный скрининг штаммов

  1. Ввести три штамма грибов в твердую среду картофельного декстрозного агара (PDA) стерильными методами и культивировать их в темноте при температуре 28 °C. После того как посуда полностью покроется грибками, храните ее при температуре 4 °C.
  2. Штаммы, законсервированные в твердой среде КПК, инокулируют в затравочный раствор колбы первой ступени и культивируют при температуре 28 °С, с встряхиванием при 120 об/мин в течение 4-5 суток. Ввести жидкость грибов первой стадии в колбу с жидкостью вторичных грибов в объемном соотношении 1:20 в шейкер постоянной температуры на 4-5 дней.
  3. Разведите МТ водой до 100 мг/л (МТ/вода) и добавьте раствор в агар до образования твердой среды. Инокулируйте по 1 мл вторичной грибковой жидкости каждого из трех штаммов в твердую культуру, содержащую только MT, а затем разделите на системы культур G. lucidum-MT, I. obliquus-MT и O. sinensis-MT. Поместите эти системы культивирования при температуре 28 °C без встряхивания в темноте.
  4. Через некоторое время понаблюдайте за ростом штаммов в вышеуказанных трех системах культивирования и выберите штаммы, которые могут расти только с помощью МТ, для дальнейшего скрининга.

3. Повторное просеивание отбора штаммов

Примечание: После предварительного скрининга только G. lucidum и O. sinensis могли нормально расти на твердой среде, содержащей МТ. Для дальнейшего выбора системы с хорошим противоопухолевым эффектом противоопухолевая эффективность была проверена на модели трансплантированной опухоли мыши.

  1. Инокулируют G. lucidum и O. sinensis в жидкую среду, содержащую только MT-MT с совместным брожением G. lucidum (MGF) и MT с совместным брожением O. sinensis (MOF), и ферментируют в течение 10 дней при 28 °C с встряхиванием при 180 об/мин.
  2. После брожения процедите мицелий через марлю и просушите его. Экстракт с 80% этанолом 3 х 12 ч.
  3. Проверьте противоопухолевую активность ферментированного и неферментированного МТ у мышей с опухолевыми клетками ООО C57BL/6J.
    1. Подкожно вводят клетки LLC (1,0 × 106 клеток по 0,2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) на мышь) в правый фланг самцов мышей C57BL/6J (кроме контрольной группы).
    2. Чтобы убедиться в успешности создания модели, прикоснитесь к опухолевым узелкам и убедитесь, что их размер составляет ~5 мм. Случайным образом сгруппируйте мышей с опухолями (n = 10 в группе) в модельную группу, группу MGF, группу MOF, группу MT и группу цисплатина (положительный контроль). Вводите физиологический раствор в контрольную группу (без опухолевых клеток) и модельную группу. Убейте мышей в жертве после 14 дней лечения и соберите опухолевую ткань.

4. Анализ химического состава продуктов брожения

ПРИМЕЧАНИЕ: После проверки эффективности ферментации в этом исследовании в качестве ферментационного штамма был выбран G. lucidum . Проведен метаболомный анализ МГФ методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС)11.

  1. Извлечь 10 мг MT, G. lucidum и MT с помощью совместного брожения G. lucidum (MGF) с 500 мкл метанола:H2O (7:3), встряхнуть при 4 °C в течение 1 мин, обработать ультразвуком в течение 30 мин и центрифугировать в течение 20 мин при 1 200 × г. Соберите надосадочную жидкость, отфильтруйте их через мембрану из поливинилиденфторида толщиной 0,22 мкм и введите в установку для жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС).
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью масс-спектрометрии высокого разрешения были построены сверхэффективные метаболиты, разделенные жидкостной хроматографией (UPLC), и библиотека образцов контроля качества (QC) (см. Таблицу материалов).
  2. Используйте следующие условия UPLC: колонка C18 (100 мм x 2,1 мм; 8 мкм), подвижная фаза A-0,1% (v/v) муравьиной кислоты в сверхчистой воде, подвижная фаза B-ацетонитрил. Установите профиль градиентного элюирования равным 0 мин 5% B; 2 мин 5% В; 14 мин 98% В; 17 мин 98% В; 17,1 мин 5% В; 20 мин 5% при расходе 0,3 мл/мин.
  3. Обнаружение и идентификация метаболитов с помощью масс-спектрометрии с высоким разрешением. Установите температуру колонки на 40 °C, температуру автоматического инжектора на 4 °C и объем впрыска на 2 μL. Поддерживайте следующие условия MS: напряжение источника ионов электроспрея: +5 500/-4 500 В; давление газа завесы, источника ионов 1 и источника ионов 2: 35, 60 и 60 фунтов на квадратный дюйм соответственно; температура ионного источника: 600 °C; Потенциал деполимеризации: ± 100 В.
  4. Подготовьте контрольные образцы (QC), смешав равные объемы экстрактов MT, GL и MGF, и назовите три реплики QC 1-3 соответственно. Обрабатывайте и обнаруживайте образцы для контроля качества и анализа, выполняя те же действия. Вставляйте образец контроля качества для каждых трех образцов, чтобы исследовать повторяемость обнаружения и анализа.

5. Экстракция и выделение продуктов брожения

  1. Полученный из бродильного бульона экстракт брожения растворить в дистиллированной воде и тщательно размешать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь из 40 л ферментационного бульона было получено 2 кг ферментационного экстракта.
  2. На участке 4 элюируют фракции этанола 10%, 30%, 50%, 70% и 95% с помощью колонны макропористой адсорбционной смолы и соберут фракции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь было получено 10,72 г 95% фракции этанола, 34,72 г 70% фракции этанола, 61,57 г 50% фракции этанола и 79,7 г 30% фракции этанола.
  3. Исходя из полярности фракций, элюируйте 70% фракцию этанола с помощью силикагелевой колоночной хроматографии с элиацетатом:элюирование метанола и соберите фракции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь были собраны Fr. 1-Fr. 7.
  4. Проводят колоночную хроматографию Sephadex LH-20 для дальнейшей очистки фракций (здесь Fr. 3 и Fr. 4) с последующим полупрепаративным разделением жидкой фазы после очистки с использованием 1,0 г каждой фракции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя полупрепаративную жидкостную хроматографию и колоночную хроматографию с силикагелем, мы выделили и очистили 95% фракцию этанола.
  5. Выполнение микроспектроскопии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса и сравнение структуры соединения (соединений) со структурами из баз данных для 600М и 700М и определение плоской структуры соединения (соединений).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном случае для определения молекулярной массы смеси был использован гибридный масс-спектрометр. Мы определили структуру одного соединения (см . дополнительный рисунок S1).

6. Статистический анализ

  1. Повторите все эксперименты по брожению шесть раз. Оцените статистическую значимость с помощью t-критерия Стьюдента. Выразите все данные в виде среднего ± SD, повторите все эксперименты в трех экземплярах и установите p < 0,05 для статистической значимости (*0,01 ≤ p ≤ 0,05, **0,001 ≤ p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001).
  2. Используйте программное обеспечение SCIEX OS для идентификации метаболитов в основном на основе погрешности массы, времени удержания, совпадения изотопов, оценки чистоты библиотеки MS/MS и вычислительной молекулярной формулы. Используйте следующие параметры настройки библиотеки: погрешность массы < 5 ppm, разность изотопных отношений < 20 и оценка библиотеки > 50.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Предварительные результаты скрининга штаммов
Чтобы исследовать грибы, способные к совместному брожению с МТ, мы выбрали три гриба: G. lucidum, I. obliquus и O. sinensis. Во-первых, штаммы были активированы: G. lucidum, I. obliquus и O. sinensis были инокулированы в среду PDA, как показано на рисунке 1A-C; На рисунке 1D-F

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

После экспериментов по скринингу штаммов мы обнаружили, что не все лекарственные грибы могут нормально выживать на растительном сырье. Без какой-либо дополнительной среды выживание лекарственных грибов зависит от разложения компонентов в лекарственных материалах с помощью их собственных ферментов для синтеза необходимых источников углерода и азота. Можно сделать вывод, что I. obliquus может не содержать ферментов, способных разрушать сапонины МТ. Для G. lucidum и O....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (81973977). Образцы МТ были идентифицированы профессором Тунсян-Лю и хранились в Школе фармацевтики Университета Миньцзу в Китае.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АцетонитрилTonguang Fine Chemicals Company, Пекин, Китай20200923
AgarSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd., СШАNO.20080107
АвтоклавBinJiang Medical Co., Ltd., Цзянъинь, КитайLS-50LD
инкубатор постоянного встряхиванияZhicheng Inc. Все права защищены., Шанхай, КитайZWY-100D
Ganoderma lucidumBeNa Culture Collection, Пекин, Китай31732
Inonotus obliquusBeNa Culture Collection, Пекин, Китай117822
LLC Мышиная клетка рака легкихНациональная инфраструктура клеточных линий, Пекин, КитайPUMC000673
Самцы мышей C57BL/6JVital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., Бэййн, КитайNo.1100112107024684
МетанолTonguang Fine Chemicals Company, Пекин, Китай20210723<
em>Ophiocordyceps sinensisBeNa Culture Collection, Пекин, Китай118371
Poly tetra fluoroethyleneJinteng Experiment Equipment Co., Ltd., Тяньцзин, КитайNo.997
QTRAP 5500 LC/MSAB Sciex Pte. Ltd., СШАCV20231711
Ротационный испарительBUCHI Co., Ltd., Шанхай, КитайR-300
ШприцZhiyu Medical Instrument Co., Ltd., Цзинагсу, КитайV500111
Сверхчистый стендBOXUN Medica Bioological Instrument Co., Ltd., Шанхай, КитайSW-CJ-LFD

Ссылки

  1. Jansen, B. J., Liang, H., Ye, J. International Conference on Cognitive Based Information Processing and Applications (CIPA 2021). 85, Springer Nature. (2021).
  2. WANG, J., et al. Literature-based research on common syndromes of cough variant asthma). Chinese General Practice. , (2022).
  3. Meng, H., et al. Influence of different substrate and plant growth regulators on rooting of cutting of Marsdenia tenacissima. Journal of Yunnan Agricultural University. 29 (4), 540-543 (2014).
  4. Xing, W., Chen, B., Mi, H., Wu, Y. Textual research of Wuguteng. Zhong yao cai=Zhongyaocai=. Journal of Chinese Medicinal Materials. 26 (7), 524-526 (2003).
  5. Yin, C. Investigation of Polyoxypregnane Compounds Isolated from Marsdenia Tenacissima for the Anti-Cancer Activity and Circumvention of Multidrug Resistance. The Chinese University of Hong Kong. , Hong Kong. Doctoral Dissertation (2019).
  6. Singer, A. C., Crowley, D. E., Thompson, I. P. Secondary plant metabolites in phytoremediation and biotransformation). Trends in Biotechnology. 21 (3), 123-130 (2003).
  7. Bianchini, L. F., et al. Microbial biotransformation to obtain new antifungals. Frontiers in Microbiology. 6, 1433(2015).
  8. Pimentel, M. R., Molina, G., Dionísio, A. P., Maróstica Junior, M. R., Pastore, G. M. The use of endophytes to obtain bioactive compounds and their application in biotransformation process. Biotechnology Research International. 2011, 576286(2011).
  9. Hsu, B. Y., Lu, T. J., Chen, C. H., Wang, S. J., Hwang, L. S. Biotransformation of ginsenoside Rd in the ginseng extraction residue by fermentation with lingzhi (Ganoderma lucidum). Food Chemistry. 141 (4), 4186-4193 (2013).
  10. Wang, D., et al. Biotransformation of gentiopicroside by asexual mycelia of Cordyceps sinensis. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 17 (11), 3195-3197 (2007).
  11. Li, R., et al. Nontargeted metabolomics study and pharmacodynamic evaluation of bidirectional fermentation for Ganoderma lucidum with Marsdenia tenacissima. Frontiers in Pharmacology. , 4590(2022).
  12. Zhang, H., et al. Five new C21 steroidal glycosides from the stems of Marsdenia tenacissima. Steroids. 75 (2), 176-183 (2010).
  13. Deng, J., Liao, Z., Chen, D. Marsdenosides A-H, polyoxypregnane glycosides from Marsdenia tenacissima. Phytochemistry. 66 (9), 1040-1051 (2005).
  14. Xia, Z. -H., et al. Pregnane glycosides from the stems of Marsdenia tenacissima. Journal of Asian Natural Products Research. 6 (2), 79-85 (2004).
  15. Deng, J., Liao, Z., Chen, D. Three new polyoxypregnane glycosides from Marsdenia tenacissima. Helvetica Chimica Acta. 88 (10), 2675-2682 (2006).
  16. Hu, Y., et al. Mechanism of Marsdenia tenacissima extract promoting apoptosis of lung cancer by regulating Ca2+/CaM/CaMK signaling. Journal of Ethnopharmacology. 251, 112535(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.