Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сфероиды печени человека из периферической крови для исследований заболеваний печени

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64703

⸱

27 января 2023 г.

 ,  ,  , 
1ACA CELL Biotech GmbH, 2Departamento Ciencias Biomédicas, Universidad Cardenal Herrera-CEU

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем негенетический метод получения аутологичных сфероидов печени человека с использованием мононуклеарных клеток, выделенных из стационарной периферической крови.

Аннотация

Клетки печени человека могут образовывать трехмерную (3D) структуру, способную расти в культуре в течение нескольких недель, сохраняя свою функциональную способность. Из-за своей природы группироваться в культуральных чашках с низкими или отсутствующими адгезионными характеристиками они образуют агрегаты из нескольких клеток печени, которые называются сфероидами печени человека. Формирование 3D-сфероидов печени зависит от естественной склонности печеночных клеток к агрегации в отсутствие адгезивного субстрата. Эти 3D-структуры обладают лучшими физиологическими реакциями, чем клетки, которые ближе к среде in vivo . Использование 3D-культур гепатоцитов имеет множество преимуществ по сравнению с классическими двумерными (2D) культурами, включая более биологически значимое микроокружение, архитектурную морфологию, которая воссобирает естественные органы, а также лучшее прогнозирование состояния болезни и реакций in vivo на лекарства. Для получения сфероидов могут использоваться различные источники, такие как первичная ткань печени или иммортализированные клеточные линии. 3D-ткань печени также может быть сконструирована с использованием эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) для получения гепатоцитов. Мы получили сфероиды печени человека с использованием плюрипотентных стволовых клеток, полученных из крови (BD-PSCs), полученных из необработанной периферической крови путем активации связанного с мембраной GPI-связанного белка человека и дифференцированного в гепатоциты человека. Клетки печени человека, полученные из BD-PSCs, и сфероиды печени человека были проанализированы с помощью световой микроскопии и иммунофенотипирования с использованием маркеров гепатоцитов человека.

Введение

В последние годы трехмерные (3D) системы культивирования сфероидов стали важным инструментом для изучения различных областей исследований рака, открытия лекарств и токсикологии. Такие культуры вызывают большой интерес, поскольку они устраняют разрыв между двумерными (2D) монослоями клеточных культур и сложными органами1.

При отсутствии адгезивной поверхности, по сравнению с 2D-культурой клеток, образование сфероидов основано на естественном сродстве этих клеток к кластеризации в 3D-форме. Эти клетки организуются в группы, состоящие из одного или нескольких типов зрелых клеток. Свободные от чужеродных материалов, эти клетки взаимодействуют друг с другом, как в своем первоначальном микроокружении. Клетки в 3D-культуре намного ближе и имеют правильную ориентацию друг к другу, с более высокой продукцией внеклеточного матрикса, чем в 2D-культурах, и представляют собой близкую к естественной среду 2.

Модели на животных уже давно используются для изучения биологии и болезней человека3. В связи с этим существуют внутренние различия между людьми и животными, что делает эти модели не совсем пригодными для экстраполятивных исследований. Сфероиды и органоиды 3D-культур представляют собой многообещающий инструмент для изучения тканеподобной архитектуры, взаимодействия и перекрестных помех между различными типами клеток, которые происходят in vivo и могут способствовать уменьшению или даже замене моделей животных. Они представляют особый интерес для изучения патогенеза заболеваний печени, а также платформ скрининга лекарств4.

3D-сфероидная культура имеет особое значение для исследований рака, поскольку она может устранить разрыв между клетками и их окружением, уменьшая потребность в трипсинизации или лечении коллагеназой, необходимой для подготовки монослоев опухолевых клеток к 2D-культурам. Опухолевые сфероиды позволяют изучать, как нормальные и злокачественные клетки получают и реагируют на сигналы из своего окружения5 , и являются важной частью исследований биологии опухолей.

По сравнению с монослоем 3D-культуры, состоящие из различных типов клеток, по своим структурным и функциональным свойствам напоминают опухолевые ткани и поэтому подходят для изучения метастазирования и инвазии опухолевых клеток. Вот почему такие сфероидные модели способствуют ускорению исследований рака6.

Сфероиды также помогают разрабатывать технологию создания органоидов человека, потому что биология тканей и органов очень сложна для изучения, особенно у людей. Прогресс в культивировании стволовых клеток позволяет разрабатывать 3D-культуры, такие как органоиды, состоящие из стволовых клеток и тканевых предшественников, а также различные типы зрелых (тканевых) клеток из органа с некоторыми функциональными характеристиками, такими как реальный орган, которые могут быть использованы для моделирования развития органов, заболеваний, но их также можно считать полезными в регенеративной медицине7.

Первичные гепатоциты человека обычно используются для изучения in vitro биологии гепатоцитов человека, функции печени и лекарственно-индуцированной токсичности. Культуры гепатоцитов человека имеют два основных недостатка, во-первых, ограниченную доступность первичной ткани, такой как гепатоциты человека, и, во-вторых, склонность гепатоцитов к быстрой дедифференцировке в 2D-культуре, тем самым теряя свою специфическую функцию гепатоцитов8. 3D-культуры печени превосходят в этом отношении и недавно были изготовлены из дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs)9. Биоинженерные печеночные 3D-сфероиды представляют особый интерес для изучения развития, токсичности, генетических и инфекционных заболеваний печени, а также при открытии лекарств для лечения заболеваний печени10. Наконец, они также могут быть использованы клинически, зная, что острые заболевания печени имеют уровень смертности почти 80%, биоискусственная печень и / или сфероиды печени потенциально могут спасти этих пациентов, обеспечивая частичную функцию печени до тех пор, пока не будет найден подходящий донор11.

Мы разработали протокол генерации сфероидов печени человека с использованием плюрипотентных стволовых клеток, полученных из крови (BD-PSCs), для получения сфероидов разного размера, содержащих от 4000 до 1 x 106 клеток, и проанализировали их с помощью световой микроскопии и иммунофлуоресценции. Мы также проверили способность гепатоцит-специфической функции, оценив экспрессию ферментов цитохрома P450 3A4 (CYP3A4) и 2E1 (CYP2E1), принадлежащих к семейству цитохрома P450, которые играют важную роль в клеточном и лекарственном метаболизме в процессе детоксикации12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Было получено этическое одобрение (ACA CELL Biotech GmbH / 25b-5482.2-64-1) для проведения этих экспериментов, и информированное согласие было подписано всеми донорами перед извлечением крови в соответствии с руководящими принципами учреждения.

1. Получение мононуклеарных клеток (ТНК) из периферической крови человека (ПБ)

  1. Извлеките 30 мл крови от здоровых доноров с помощью обученного медицинского персонала по стандартному протоколу.
  2. Изолируйте PBMNC с использованием сред с градиентом плотности в соответствии с протоколом, опубликованным Becker-Kojić et al.13. Изолируют с помощью пипетки межфазный слой между плазмой и средой с градиентом плотности и используют стерильный фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) для промывки изолированных клеток.
  3. Используйте счетную камеру и подсчитайте количество ячеек стандартными методами.

2. Дедифференцировка МНК при активации гликопротеином, закрепленным на GPI человека

  1. Поместите 6 x 106 мононуклеарных клеток в PBS / 1% бычий сывороточный альбумин (BSA) в полистирольную пробирку (15 мл) и инкубируйте со специфическим антителом в течение 30 мин при 37 ° C в соответствии с Becker-Kojić et al.13.
  2. Центрифугируйте клетки при 300 x g при комнатной температуре и замените PBS/BSA модифицированной средой Дульбекко от Iscove, дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS).
  3. Выращивайте клетки в полистирольных пробирках объемом 15 мл в инкубаторе с 5% CO2 при 37 ° C в течение 8-10 дней, как описано в Becker-Kojić et al.13. На 5-й день (D5) добавьте 1-2 мл среды Iscove с добавлением 10% FBS в каждую пробирку объемом 15 мл.

3. Сортировка вновь образованных дедифференцированных клеток

  1. Центрифугу культивируют клеточную суспензию при комнатной температуре в течение 10 мин при 300 х г и аспирируют стерильной пипеткой полученную надосадочную жидкость по Becker-Kojić et al.13.
  2. Ресуспендируют гранулы, полученные центрифугированием, в 90 мкл холодного буфера PBS (рН PBS 7,2, 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА) и добавляют 10 мкл положительных наноразмерных магнитных шариков CD45 и инкубируют на льду в течение 15 мин.
  3. Промойте клеточную суспензию 2 мл буфера PBS, центрифугируйте ее при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре, добавьте 500 мкл буфера PBS в клетки и тщательно ресуспендируют.
  4. Пипетка 500 мкл предварительно охлажденного буфера PBS в колонку для промывки и поместить ее в магнитное поле с помощью магнитной подставки.
  5. Промойте клетки, помещенные на колонку, дважды 500 мкл буфера PBS и соберите проточные клетки, содержащие отрицательные клетки CD45, в среду Iscove, дополненную 10% FBS.
  6. Используйте счетную камеру для определения количества перепрограммированных ячеек.

4. Подготовка стеклянных покровных листов для генерации гепатоцитов человека

  1. Отделите стеклянные покровные стекла (14 мм) и инкубируйте их в неионогенном моющем средстве в течение 10 минут. Промойте стекла в деионизированной воде до тех пор, пока не останется пузырьков, и инкубируйте их в 1M HCl в течение 30 минут (адаптировано из Marchenko et al.14).
  2. Вымойте стеклянные покровные стекла деионизированной водой не менее 3 раз и высушите их в течение ночи при комнатной температуре. В автоклаве высушите стеклянные покровные стекла в подходящей таре.

5. Покрытие планшетов для клеточных культур биоламинином для 2D-дифференцировки печени BD-PSC

  1. Поместите автоклавные стеклянные покровные стекла стерильным пинцетом в 4-луночные пластины и включите ультрафиолетовое излучение на 30 минут, чтобы обеспечить стерильные условия.
  2. Разморозьте аликвоты биоламинина и добавьте 120 мкл 5 мкг/мл биоламинина в каждый стакан. Оставьте покровные стекла с покрытием на ночь при температуре 4 °C.
  3. Удалите избыток биоламинина и добавьте 200 мкл среды для дифференцировки гепатоцитов, как описано ниже.

6. Приготовление сред для дифференцировки гепатоцитов

  1. Сделайте 500 мл среды для замены сыворотки с нокаутом гепатобласта (KSR)/диметилсульфоксида (ДМСО), состоящей из 76,4% нокаута DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0,5% L-глютамина, 1% заменимых аминокислот (NEAA), 0,1% β-меркаптоэтанола, 1% DMSO и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen / Streptoring).
  2. Приготовьте 500 мл среды для созревания гепатоцитов, содержащей 1% L-глютамина, 10 мкМ гидрокортизона-21-гемисукцината натриевой соли (ГЦК) и 1% Pen/Strep.
  3. Аликвотируйте среду из запаса и добавляйте свежий фактор роста гепатоцитов (HGF) и онкостатин М (OSM) в конечных концентрациях 10 нг/мл и/или 20 нг/мл для каждой смены среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Онкостатин М представляет собой цитокин, принадлежащий к группе цитокинов интерлейкина 6, важный для кроветворения, а также для развития печени.

7. Культивирование печеночных клеток, дифференцированных из BD-PSC

  1. Поместите 3 x 105 клеток BD-PSCS в каждую лунку 4-луночной пластины, покрытой биоламинином.
  2. Поместите 4-луночные планшеты в инкубатор при температуре 37 °C и 5% CO2. Культивируйте клетки в течение 5 дней в среде гепатобласта KSR/DMSO, которая поддерживает энтодермальную дифференцировку, и меняйте среду через день.
  3. Переключитесь на среду для созревания гепатоцитов на 5-й день и культивируйте клетки еще 7-10 дней в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. Меняйте среду каждые 48 ч.

8.3D сфероидная дифференцировка печени

  1. Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры.
  2. Центрифуга BD-дедифференцированная клеточная суспензия в 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать BD-дедифференцированные клетки в среде KSR/DMSO в дозе 2 x 106 клеток/мл.
  3. Пропустите клетки через сетчатый фильтр 40 мкм, чтобы обеспечить суспензию одной ячейки и удалить дополнительный мусор.
  4. Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры и подготовьте достаточный объем для каждой ячейки плотности посева, чтобы распределить необходимый объем на лунку. Подготовьте градиент с верхним посевом 1 x 10 6 ячеек до низкой плотности посева 4000ячеек .
  5. Распределите 100 мкл среды KSR/DMSO в 96 пластинах с низкой посадкой и добавьте 100 мкл разбавления ячеек.
  6. Поместите пластину с низкой насадкой в инкубатор при температуре 37 ° C и 5% CO2 и культивируйте их в течение 5 дней.
  7. Меняйте 50% среды с 3-4 дня после посева, когда сфероиды достаточно уплотняются.
  8. На 5-й день смените среду на среду созревания гепатоцитов и культивируйте клетки еще 7-10 дней для дальнейшего созревания. Меняйте носитель через день.

9. Иммунофлуоресцентный анализ вновь генерируемых 2D-культур клеток печени

  1. Культивируют клетки в соответствии с описанным выше методом дифференцировки в течение 4, 8, 15 и 24 дней и удаляют среду.
  2. Инкубируют клетки с предварительно подогретым фиксатором, состоящим из 4% параформальдегида, в PBS в течение 10 мин. Откажитесь от фиксатора и промойте клетки 2 раза с помощью PBS в течение 5 минут каждая. Немедленно добавьте 0,1% раствор тритона X-100 и проведите в клетках 5 мин. Стирайте 2 раза с помощью PBS.
  3. Добавьте блокирующий раствор из ПБС и 5% БСА и поместите на коромысло на 1 час при комнатной температуре.
  4. Разбавляют первичные антитела в буфере разбавления 1% BSA/PBS следующим образом: альбумин (ALB) 1:50, альфа-1-фетопротеин (AFP) 1:250, цитокератин 18 (CK18) 1:50, ядерный фактор гепатоцитов 4 альфа (HNF4α) 1:1000 и транстиретин (TTR) 1:50. Используйте 50 мкл разведения антител на лунку.
  5. Инкубируют клетки в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем выбросьте раствор антител, промойте клетки в течение 5 минут и повторите шаг промывки 3 раза.
  6. Приготовьте следующие вторичные антитела в буфере для разведения: кролик против куриного IgG (техасский красный) 1:1000, козий антимышиный IgG (488) 1:1000 и козий антикролик (488) 1:500. Используйте 50 мкл разведения антител на лунку и инкубируйте клетки в течение 30 минут при комнатной температуре.
  7. Промойте ячейки 3 раза с помощью PBS в течение 5 минут каждая и установите покровные стекла с монтажными носителями, содержащими DAPI, для микроскопического анализа.

10. Живое окрашивание новообразованных сфероидов печени

  1. Осторожно выбросьте питательные среды, не касаясь сфероидов, добавьте свежеприготовленный PBS с 0,1% раствором тритона X-100 и инкубируйте в течение 5 минут, чтобы проникнуть в клетки.
  2. Промойте сфероиды средством, медленно пипетируя в течение 5 минут, повторите 2 раза.
  3. Инкубируют сфероиды с первичными антителами ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) и CYP3A4 (1:200), приготовленными в PBS с 1% BSA в течение 1 ч в 5%CO2 инкубаторе при 37 °C. Используйте 50 мкл разведения антител на лунку.
  4. Тщательно удалите излишки раствора антител и промойте сфероиды средой 3х.
  5. Приготовьте соответствующие вторичные антитела козьего антимышиного IgG (Cy3), козьего антимышиного IgG (488) и кролика антикуриного IgG (техасский красный) в разведении 1:1000 и 1:500 для козьего антикролика (488) в PBS в 1% BSA. Используйте 50 мкл разведения антител на лунку и инкубируйте в течение 20 мин в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
  6. Тщательно промойте 3 раза средой и оставьте планшет на 30 мин в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 перед проведением флуоресцентной микроскопии.

11. Исследование сфероидов с помощью флуоресцентного микроскопа

  1. Включите источник флуоресцентного света за 10 минут до использования, включите компьютер и откройте программное обеспечение для обработки изображений.
  2. Используйте объектив с 4-кратным увеличением, нажмите кнопку 4x на панели инструментов, чтобы выбрать правильную масштабную линейку, затем поместите 96-луночную пластину на центральную пластину сцены.
  3. Включите светодиодный источник света, используйте фильтр светлого поля и поместите пластину в интересующий колодец с помощью ручки регулировки ступени по оси x-y.
  4. Измените путь освещения камеры, нажмите кнопку Live in Программное обеспечение для обработки изображений, чтобы визуализировать изображение на экране, и убедитесь, что сфероид центрирован с помощью ручек оси X-Y, и сфокусируйтесь с помощью ручки грубой/точной фокусировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Форма сфероидов остается постоянной после нанесения живого окрашивания.
  5. Выберите метод наблюдения за светлым полем на панели инструментов, установите автоматические настройки экспозиции и нажмите кнопку «Снимок» на панели управления камерой, чтобы сделать снимок . Затем сохраните картинку в виде файла .vsi, используя соответствующее имя в интересующей папке.
  6. Поместите экранирующую пластину окружающего света, чтобы выключить светодиодную подсветку, переключитесь на фильтр для B-возбуждения, выберите метод наблюдения 488 на панели инструментов, откройте затвор, сделайте снимок, нажав кнопку «Снимок», закройте затвор, затем сохраните файл, как описано выше.
  7. Повторите это с фильтром для G-возбуждения, используя соответствующий метод наблюдения (техасский красный или CY3). Затем повторите всю процедуру для каждой интересующей скважины.
  8. Верните планшет в инкубатор с 5% CO2 при 37 ° C и культивируйте его, как описано выше.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы успешно дифференцировали BD-PSC человека в клетки-предшественники энтодермы / печени и гепатоциты, применяя двухэтапный протокол. Морфологические изменения в процессе дифференцировки печени показаны на рисунке 1. BD-PSC дифференцируются в гепатоциты, проходящие три различные стадии. Первая стадия представляет собой дифференцировку в энтодермальные клетки L4, вторая - дифференцировку в клетки-предшественники печени (гепатобласт) L8, демонстрирующие типичную полигональную морфологию, а трет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Печень является основным органом в организме человека со многими важными биологическими функциями, такими как детоксикация метаболитов. Из-за тяжелой печеночной недостаточности, такой как цирроз печени и/или вирусный гепатит, во всем мире ежегодно умирает около 2 миллионов человек. Трансплантация печени занимает второе место среди трансплантаций солидных органов во всем мире, но удовлетворяется только около 10% текущей потребности22.

Первичные гепатоциты человека (PHH) ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Соответствующий автор заявляет, что она является патентообладателем, связанным с новым человеческим GPI-сцепленным белком. Она является соучредителем и работает с ACA CELL Biotech GmbH. Другие авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы особенно благодарны за техническую помощь, оказанную Оксаной и Джоном Гринакр. Эта работа была поддержана ACA CELL Biotech GmbH Гейдельберг, Германия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антитела к альбуминуSigma-AldrichSAB3500217получены в курице
Альбумин Фракция VCarl Roth GmbH+Co. KGT8444.4
Альфа-1 ФетопротеинProteintech Germany GmbH14550-1-APкролик поликлональный IgG
Биоламинин 111 LNBioLamina LN111-02человеческий рекомбинантный
CD45 МикрошарикиMiltenyi130-045-801наноразмерные магнитные шарики
Cell StrainerpluriSelect43-10040-40
CellSens Программное обеспечение для визуализацииOlympus
Центрифужные пробирки 50 мл Greiner Bio-One210270
CEROplate 96 лунокOLS OMNI Life Science2800-109-96
CKX53 Olympus
Коммерчески доступное моющее средствоProcter & Gambleнеионогенное моющее средство
CYP2E1-специфичное антителоProteintech Germany GmbH19937-1-APкроличье поликлональное антитело IgG
CYP3A4 Proteintech Germany GmbH67110-1-lgмышиное моноклональное антитело IgG1
Цитокератин 18DakoCytomationM7010мышиное моноклональное антитело IgG1
DMSOSigma-AldrichD8418-50ML
DPBSThermo Fisher Scientific14040091
FBSMerck MilliporeS0115/1030BСнято с производства. Доступно по: TMS-013-B
Стеклянные покровные стекла 14 ммR. Langenbrinck01-0014/1
GlutaMax 100x GibcoThermo Fisher Scientific35050038L-глутамин
Глутаральдегид 25%Sigma-AldrichG588.2-50ML
Антитела козы против мыши IgG Cy3онлайнABIN1673767поликлональные
Козьи антимышиные антитела IgG DyLight 488Антитела онлайнABIN1889284поликлональные
козьи антикроличьи IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-11008
HClSigma-Aldrich30721-1LGL
HepatoZYME-SFM Thermo Fisher Scientific17705021среда для созревания гепатоцитов
HGFThermo Fisher ScientificPHG0324человеческое рекомбинантное
антитело HNF4&alphaSigma-AldrichZRB1457-25ULклон 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-гемисукцинат (соль натрия)BiomolCay18226-100
Замена сыворотки с нокаутом - Multi Species GibcoFisher ScientificA3181501KSR
KnockOut DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12660012снят с производства. Доступно под каталожным No 10-828-010
MACS BufferMiltenyi130-091-221
MACS MultiStandMiltenyi130-042-303магнитная подставка
MEM NEAA 100x GibcoThermo Fisher Scientific11140035
меркаптоэтанолThermo Fisher Scientific3135001050mM
MiniMACS колонкиMiltenyi130-042-201
Nunclon MultidishSigma-AldrichD67894-луночные планшеты
Онкостатин MThermo Fisher ScientificPHC5015человеческий рекомбинантный
параформальдегидSigma-Aldrich158127
PBS стерильныйCarl Roth GmbH+Co. KG9143.2
Пенициллин/стрептомицинBiochrom GmbHA221310000 Ед/мл
PS 15мл тубы стерильныеGreiner Bio-One188171
Кролик против курицы IgG Техасские красныеантитела онлайнABIN637943
Roti Cell Iscoves MDMCarl Roth GmbH+Co. KG9033.1
Roti Mount FluorCare DAPICarl Roth GmbH+Co. KGHP20.1
Roti Sep 1077 человекCarl Roth GmbH+Co. KG0642.2
Антитела к транстиретину Sigma-AldrichSAB3500378производится в курице
Triton X-100Thermo Fisher ScientificHFH101%

Ссылки

  1. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  2. Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620(2019).
  3. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  4. Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).
  5. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
  6. Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).
  7. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  8. Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
  9. Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
  10. Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964(2020).
  11. Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
  12. Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808(2021).
  13. Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634(2021).
  14. Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267(2007).
  15. Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
  16. Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
  17. Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
  18. Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
  19. Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686(2022).
  20. Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
  21. Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
  22. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  23. Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3D-культура гепатоцитовплюрипотентные стволовые клетки из кровидифференцировка в гепатоцитысреда для созревания гепатоцитовиммунофлуоресцентный анализгенерация органоидовмаркеры гепатоцитовпланшеты с низкой адгезией
Сфероиды печени человека из периферической крови для исследований заболеваний печени
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.