В этом протоколе описывается метод мониторинга прогрессирования морфологических изменений с течением времени в матке в индуцируемой мышиной модели рака эндометрия с использованием ультразвуковой визуализации с корреляцией с грубыми и гистологическими изменениями.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Неинвазивная ультразвуковая оценка прогрессирования рака эндометрия при Pax8-направленной делеции опухолевых супрессоров Arid1a и Pten у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Рак матки может быть изучен на мышах из-за простоты обращения и генетических манипуляций в этих моделях. Тем не менее, эти исследования часто ограничиваются оценкой патологии посмертно у животных, усыпленных в несколько моментов времени в разных когортах, что увеличивает количество мышей, необходимых для исследования. Визуализация мышей в лонгитюдных исследованиях может отслеживать прогрессирование заболевания у отдельных животных, уменьшая количество необходимых мышей. Достижения в области ультразвуковой технологии позволили обнаружить изменения в тканях на микрометровом уровне. Ультразвук использовался для изучения созревания фолликулов в яичниках и роста ксенотрансплантата, но не применялся к морфологическим изменениям в матке мыши. В этом протоколе исследуется сопоставление патологии со сравнением изображений in vivo в мышиной модели с индуцированным раком эндометрия. Признаки, наблюдаемые при УЗИ, соответствовали степени изменения, наблюдаемым при грубой патологии и гистологии. Было обнаружено, что ультразвук обладает высокой степенью прогнозирования наблюдаемой патологии, поддерживая включение ультразвукового исследования в лонгитюдные исследования заболеваний матки, таких как рак у мышей.
Введение
Мыши остаются одной из наиболее важных животных моделей репродуктивных расстройств 1,2,3. Существует несколько генетически модифицированных или индуцированных моделей рака яичников и матки у грызунов. Эти исследования обычно опираются на несколько когорт, подвергшихся эвтаназии в разные моменты времени, чтобы зафиксировать продольные тенденции морфологических и патологических изменений. Это препятствует получению непрерывных данных о развитии рака у отдельной мыши. Кроме того, не зная отдельного состояния прогрессирования заболевания мыши, интервенционные исследования основаны на заранее определенных временных точках и усредненных результатах предыдущих когорт, а не на отдельных пороговых значениях для обнаружения прогрессирования у конкретного животного 4,5. Таким образом, подходы к визуализации, которые позволяют проводить продольную оценку на живых животных, необходимы для облегчения доклинических моделей для тестирования новых лекарств или соединений и ускорения понимания патобиологии, а также повышения строгости и воспроизводимости6.
Ультразвуковая визуализация (УЗИ) является привлекательным методом для продольного мониторинга прогрессирования рака матки мышей, поскольку она относительно проста и недорога по сравнению с другими методами визуализации, проста в выполнении и может иметь замечательное разрешение 6,7. Этот неинвазивный метод может фиксировать особенности в микронном масштабе у бодрствующих мышей или у мышей, находящихся под кратковременной седацией, с использованием 5-10-минутного исследования. Ультразвуковая микроскопия была валидирована как метод измерения развития фолликулов яичников мыши 8 и роста имплантированной или индуцированной неоплазии 9,10,11. Высокочастотное УЗИ также использовалось для чрескожных внутриматочных инъекций12 и наблюдения за изменениями матки у крыс в течение циклатечки 13. Высокочастотный УЗИ можно использовать с мышами, удерживаемыми на специализированных стационарных платформах с использованием рельсовой системы для удержания преобразователя/зонда для захвата изображений с высоким разрешением со стандартизированным положением и давлением; Однако это оборудование доступно не во всех учреждениях. Методы сканирования с помощью ручного датчика могут быть приняты с менее специализированным оборудованием и использоваться как для клинической диагностики, так и для исследований на мышах.
Остается открытым вопрос о том, можно ли использовать визуализацию УЗИ с помощью портативных высокочастотных зондов для мониторинга развития рака матки в течение нескольких недель. Подобно кишечнику, матка грызунов представляет собой тонкостенную тонкую структуру, которая очень подвижна в брюшной полости и непрерывна через несколько глубин тканей, что делает визуализацию более сложной, чем с относительно неподвижными органами, такими как почки. Это исследование было направлено на установление корреляции между тканями, наблюдаемыми с помощью ультразвука, и гистопатологией, определение ориентиров для определения местоположения матки мыши и определение возможности продольной оценки рака эндометрия. В этом исследовании представлены данные, показывающие качественное соответствие между внешним видом матки, сфотографированной с помощью УЗИ, и гистопатологией, а также серийной визуализацией мышей в течение нескольких недель. Эти результаты показывают, что портативный УЗИ можно использовать для мониторинга развития рака эндометрия у мышей, тем самым создавая возможность для сбора индивидуальных продольных данных мыши для изучения рака матки без необходимости использования специального оборудования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры и эксперименты с участием мышей проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию Джонса Хопкинса. Для всех процедур надевались соответствующие СИЗ, включая перчатки и одноразовые изолирующие халаты. Были приняты меры предосторожности при обращении с острыми предметами, которые были надлежащим образом утилизированы в красных контейнерах для острых предметов сразу после использования. Подробные сведения обо всех материалах и оборудовании, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .
1. Индукция рака эндометрия у мышей iPAD (индуцируемая двойная делеция Pten, Arid1a ) доксициклином
- Поддерживайте 10 трансгенных мышей Pax8-Cre-Arid1a-Pten с двойной делецией (iPAD) (рис. 1) на смешанном генетическом фоне (129S, BALB/C, C57BL/6), как описано ранее14.
- Соберите исходные ультразвуковые (2D) изображения яичников, яйцевода и матки каждой мыши перед лечением доксициклином.
- Обеспечьте исключительно доксициклинсодержащие рационы мышей (доксициклин гиклат в дозе 625 мг / кг корма) самкам мышей iPAD в течение как минимум 2 недель, начиная с 7-8-недельного возраста, чтобы вызвать делецию гена.
2. Настройка оборудования
- Включите грелку и накройте чистой впитывающей прокладкой (целевая температура: 38 °C).
- Убедитесь, что испаритель изофлурана и бак O2 заполнены достаточно. Долейте и замените, если содержимое низкое.
- Подключите индукционную камеру, носовой обтекатель и систему продувки к испарителю.
- Настройте аппарат УЗИ.
- Выберите датчик (зонд) с диапазоном 32-56 МГц или до 70 МГц для визуализации матки или яичника соответственно.
- Подсоедините зонд и включите машину.
- После загрузки системы используйте панель управления, чтобы войти в систему с учетными данными пользователя и получить доступ к главному экрану.
- На главном экране перейдите на вкладку « Приложения » и выберите «Мышь (маленькая) в режиме живота».
- Нажмите « Сканировать », чтобы вернуться на главный экран, и дождитесь отображения живого изображения.
- Выберите B-Mode из параметров на левой панели инструментов.
- Нажмите « Дополнительные элементы управления », чтобы просмотреть дополнительные инструменты для уточнения изображения, такие как усиление и глубина изображения, или настроить параметры захвата клипа, такие как количество кадров в секунду.
- После выбора настроек изображения вернитесь на главный экран, нажав « Сканировать».
- Включитебак Ø2, направьте поток в индукционную камеру и установите скорость потока 1 л/мин.
3. Подготовка мышей к ультразвуковому скринингу, включая эпиляцию
- Поместите мышь в индукционную камеру. Установите испаритель изофлурана на 2%-3% об./об. для индукции анестезии.
- Определите подходящую глубину анестезии по отсутствию реакции на защемление пальца ноги и частоте дыхания около 1-2 вдохов / с.
- Нанесите стерильную офтальмологическую смазку на каждый глаз. Удалите шерсть со спинки и брюшной полости между последним ребром и тазом с помощью машинок для стрижки соответствующего размера.
- Нанесите тонкий слой крема для депиляции на вентральную и дорсальную области для визуализации (при необходимости).
- Поместите мышь обратно в индукционную камеру примерно на 3-5 минут, чтобы поддерживать соответствующую глубину анестезии, пока крем для депиляции удаляет волосы. Через ≤4 минуты аккуратно сотрите крем чистым влажным бумажным полотенцем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие крема для депиляции вызывает раздражение и может вызвать поражения кожи.
4. Внутрибрюшинное введение жидкости для увеличения контраста между органами
- Нагрейте шприц объемом 3-10 мл, наполненный стерильным раствором изотонической жидкости (например, стерильным 0,9% NaCl или раствором Lactated Ringers) до 35-40 °C, поместив его между грелкой и абсорбирующей прокладкой на несколько минут. Поместите флакон с ультразвуковым гелем на грелку, если в аппарате нет грелки.
- Для мыши 20-25 г вводят 1-2 мл раствора в брюшную полость.
- Закрепите мышь за загривок в одной руке, обнажив брюшное отверстие.
- Держите мышь под углом ~ 20 °, нос направлен к полу, чтобы направить органы краниально под действием силы тяжести.
- С помощью иглы малого калибра (25 G, длиной 5/8, туберкулиновый шприц) прокалывают кожу и брюшную стенку каудального правого квадранта живота.
- Перед введением жидкости, чтобы избежать инъекции в сосудистую сеть или желудочно-кишечный тракт, оттяните назад с минимальным давлением. Если в шприц попала кровь или другой материал, извлеките иглу. Используйте новую иглу и шприц и повторите попытку в немного другом положении.
- Если мышь просыпается во время инъекций, поместите ее обратно в маленькую индукционную камеру для анестезии с 2%-3% изофлураном.
5. Ультразвуковая визуализация при дорсальном доступе
- Расположите мышь в подфюзеляжном положении лежа на впитывающей прокладке над грелкой (рис. 2A-C).
- Надежно поместите носовой конус грызуна на нос и морду мыши. Поддерживайте глубину анестезии с помощью изофлурана, доставляемого через носовой конус, на уровне 1-2% об./об. при 100%O2. При необходимости нанесите стерильную офтальмологическую смазку на каждый глаз.
- Следите за регулярной частотой дыхания мыши (1-2 / с) и отсутствием реакции на ущипывание пальцев ног, чтобы указать, нужно ли корректировать анестезию.
- Поместите небольшое количество (~ 0,5-1 мл) предварительно подогретого ультразвукового геля абаксиально (латерально) к позвоночнику по обе стороны от анестезированной мыши, между последним ребром и тазом.
- Нанесите небольшое количество геля на ультразвуковой датчик.
- Поместите зонд параллельно позвонкам так, чтобы передняя часть зонда находилась на черепной стороне. На головке датчика имеется индикаторная метка, указывающая на правильную ориентацию датчика. Запишите день, время, идентификатор животного, ориентацию зонда и сторону животного (справа, слева, спинной, брюшной) для каждого нового набора собираемых изображений.
- Когда мышь находится в вентральном лежачем положении (спинная кожа касается зонда), медленно просканируйте область в поисках ориентира для почек (рис. 2B и рис. 3). Потянув почку в поле зрения, потяните зонд каудально, чтобы найти яичник - слегка гиперэхогенную овальную или круглую структуру (рис. 4A, B) в очень гиперэхогенном жировом пакете яичников, который граничит кранио-вентрально с почкой и дорсо-латерально с дорсальной брюшной стенкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каудальное и боковое давление на яичник может направить яичник ближе к брюшной стенке и от петель кишечника. Яичник анатомически расположен у дорсальной брюшной стенки, только вентрально и латерально к эпаксиальным мышцам и каудально к почке. - Отрегулируйте усиление сигнала с помощью ползунка в нижней части экрана управления, чтобы улучшить контрастность изображения.
- Чтобы улучшить визуализацию почки, надавите пальцем на контралатеральную часть живота. Изменяйте давление и угол от прямо параллельного позвоночнику до ~20° вентрального.
- Как только интересующий вас орган окажется в поле зрения, соберите видео, нажав « Сохранить клип » или « Начать запись», а затем «Остановить запись », когда закончите, чтобы сохранить изображения с заданным количеством кадров.
- Сохраняйте отдельные кадры из живого изображения или записи с помощью кнопки «Сохранить кадр».
- Чтобы визуализировать матку, потяните зонд каудально до тех пор, пока яичник не окажется в самом краниальном аспекте поля зрения. Варьируйте давление зонда и угол наклона до тех пор, пока матка не окажется в поле зрения.
- Повторите сбор видео и кадров для каждого интересующего органа.
- Найдите матку, идущую продольно вдоль дорсальной брюшной стенки, с боковой мускулатурой ног (рис. 4B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер матки и диаметр просвета могут варьироваться в зависимости от фазы течки и состояния заболевания. - Следите за перистальтическим движением ткани, чтобы дифференцировать петли кишечника от неподвижных рогов матки.
6. Соберите изображения с вентрального подхода
- Поместите мышь в спинное лежачее положение и убедитесь, что смазка глаз достаточна, а морда надежно находится в носовом конусе (рис. 2A).
- Нанесите небольшое количество (~ 0,5-1 мл) предварительно подогретого ультразвукового геля на вентральную часть живота и нанесите зонд на среднюю линию черепа лобка, чтобы определить местонахождение мочевого пузыря в качестве гипоэхогенного ориентира (рис. 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если мочевой пузырь слишком большой и скрывает визуализацию матки, можно слегка надавить на нижнюю часть живота для сцеживания мочи. - Потяните зонд сбоку к мочевому пузырю, чтобы найти рога матки. Приложите легкое цифровое давление с одной или обеих сторон мыши, чтобы вывести рога в поле зрения. Держите зонд перпендикулярно мыши и сканируйте обе стороны живота, чтобы получить поперечные виды (поперечные сечения) обоих рогов. Поверните зонд, чтобы захватить сагиттальные виды.
- После УЗИ протрите мышь бумажным полотенцем от геля и верните ее в клетку для восстановления. Мыши полностью просыпаются через 2-5 минут. Как только он полностью проснулся и начал передвигаться, верните мышь в комнату для животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Под клетку можно поместить грелку на слабом огне, чтобы согреть клетку для восстановления. - В экспериментальной или гуманной конечной точке усыпьте мышь. В идеале усыпить мышь в домашней клетке, чтобы уменьшить стресс; Как вариант, поместите мышь в чистую камеру. Подавайте CO2 под давлением со скоростью вытеснения 10-30% от объема камеры в минуту. Примерно через 5 минут отсутствия видимого дыхания подтвердите смерть от вывиха шейки матки. Приступайте к вскрытию брюшной полости для удаления опухоли.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Трансгенные мыши Pax8-Cre-Arid1a-Pten с двойной делецией (iPAD) поддерживались на смешанном генетическом фоне (129S, BALB/C, C57BL/6), как описано ранее14. Всех мышей кормили доксициклином в течение 2 недель, чтобы индуцировать Cre рекомбиназу. В предыдущей работе нашей группы доксициклин дозировали черезжелудочный зонд 14; Тем не менее, в этом текущем исследовании метод индукции корма доксициклином работал эффективно и снижал стресс зонда для мышей. Важно...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе исследуется полезность ультразвука для оценки морфологических изменений матки при прогрессировании аденокарциномы в матке у мышей. В этом исследовании, проследив за индукцией рака эндометрия у мышей в продольном направлении, анатомические детали, обнаруженные с помощью ультразвука, оказались индикаторами грубой и гистологической патологии. Это открывает двери для использования лонгитюдных исследований с меньшим количеством мышей, контролируемых ультразвуком в несколько временных точек, чтобы следить за п...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Благодарности
Мы благодарны за финансирование со стороны программы SPORE рака яичников NCI P50CA228991, программы постдокторской подготовки 5T32OD011089 и Фонда Ричарда В. Телинде Университета Джона Хопкинса. Проект также частично финансировался за счет субсидий на текущие расходы частным высшим учебным заведениям от Корпорации содействия и взаимопомощи частным школам Японии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>реагенты и оборудование для ухода за животными | |||
| рацион грызунов (2018, 625 доксициклин) | Envigio | TD.01306 | мышиный корм |
| <сильно>реагенты и оборудование для ультразвуковой визуализации> | |||
| 10 мл инъекционный 0,9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | изотонической жидкости |
| с пластиковой подложкой | Дайггер | EF8313 | Абсорбирующие прокладки |
| Индукционные камеры для анестезии | Гарвардский аппарат | 75-2029 | Индукционная камера |
| Набор анестетик-абсорбера с абсорберной канистрой, держателем, трубкой и адаптерами | CWE, Inc | 13-20000 | Носовой конус и трубка |
| Aquasonic Clear Гель для ультразвука (0,25 литра) | Parker Laboratoies | 08-03 | Гель для ультразвука |
| BD Plastipak 3 мл Шприц | BD Biosciences | 309657 | Шприц |
| F/Air Scavenger Канистра с древесным углем | OMNICON | 80120 | Система очистки для анестезии |
| Изофлуран, USP | Vet One | 502017 | Средство для анестезии |
| M1050 Передвижной наркозный аппарат | без дыханияScivena Scientific | M1050 | Обезболивающий испаритель |
| MX550S, датчик 25-55 МГц, 15 мм, Linear | VisualSonics | MX550S | Ультразвуковой датчик (зонд) |
| Nair Hair Aloe & Лосьон для эпиляции с ланолином - 9,0 унций | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Триммер серии 7000 | Philips Северная Америка | MG7750 | Машинки для стрижки |
| PrecisionGlide 25 G 1" Игла | BD Biosciences | 305125 | игла |
| Puralube Офтальмологическая мазь | Dechra | 17033-211-38 | Смазывающие глазные капли |
| Vevo 3100 Imaging Система | VisualSonics | Vevo 3100 | Ультразвуковой аппарат |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Программное обеспечение для ультразвукового анализа |
| Виниловая грелка с чехлом, 12 x 15 | Sunbeam | 731-500-000R | Грелка |
| Wd Elements 2 ТБ Базовое хранилище | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Хранение данных |
| <сильно>реагенты и оборудование, используемые для иммуногистохимии | |||
| 10% w/v формалин | Fischer Scientific | SF98-4 | тканевый фиксирующий буфер |
| без животного происхождения и разбавитель, R.T.U. | Вектор Лабораториз, Инк. | SP5035 | Блокатор антител |
| заряженный Super Frost Plus Стеклянные слайды | VWR | 4831-703 | Тканевые монтажные слайды |
| Цитратный буфер | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Смола для герметизации |
| стекла Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Модифицированный гематоксилин | MilliporeSigma | HHS32-1L | с противопятным покрытием |
| (двухкамерный) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Печь для плавления паррафина |
| ImmPACT DAB Substrate, пероксидазы (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Подложка для разработки сигналов |
| ImmPRESS HRP Набор для обнаружения полимера IgG против кролика у козы, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Вторичное антитело к ИГХ |
| Oster 5712 Цифровая пароварка для пищевых продуктов | Oster | 5712 | Овощная пароварка для эпитопа Retrival |
| кролик mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Первичное антитело к ИГХ (1:1,000) |
| кролик mAB анти-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Первичное антитело к ИГХ (1:100) |
| Заменитель водопроводной воды Scotts | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Кассета | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Буфер для восстановления эпитопа (ARID1a) |
Ссылки
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5(2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125(2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238(2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106(2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038(2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717(2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144(2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
