Методическая статья

Изучение Х-хромосомных аберраций в клетках яичников с использованием флуоресцентной гибридизации in situ

DOI:

10.3791/64734

⸱

7 апреля 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Radboudumc, 2Department of Pediatrics, Radboudumc, Amalia Children’s Hospital, 3Department of Reproductive Medicine, Nij Geertgen Center for Fertility

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье представлены два метода, основанные на флуоресцентной гибридизации in situ , для определения содержания Х-хромосомы клеток яичников в нетрансплантированной и пересаженной ткани коры яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Миллионы людей во всем мире сталкиваются с проблемами, связанными с рождаемостью. Снижение фертильности или даже бесплодие может быть вызвано множеством различных причин, включая генетические нарушения, из которых хромосомные аномалии являются наиболее распространенными. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) является хорошо известным и часто используемым методом обнаружения хромосомных аберраций у людей. FISH в основном используется для анализа хромосомных аномалий в сперматозоидах самцов с числовыми или структурными хромосомными аберрациями. Кроме того, этот метод также часто применяется у женщин для обнаружения аберраций Х-хромосомы, которые, как известно, вызывают дисгенезию яичников. Однако информация о содержании Х-хромосомы клеток яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями в лимфоцитах и/или буккальных клетках по-прежнему отсутствует.

Целью данного исследования является продвижение фундаментальных исследований аберраций Х-хромосомной кислоты у женщин, путем представления двух методов, основанных на FISH, для идентификации содержания Х-хромосом в клетках яичников. Во-первых, описан способ определения содержания Х-хромосомы изолированных клеток яичников (ооцитов, гранулезных клеток и стромальных клеток) в нетрансплантированной ткани коры яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями. Второй метод направлен на оценку влияния хромосомных аберраций на фолликулогенез путем определения Х-хромосомного содержания клеток яичников новообразованных вторичных и антральных фолликулов в ткани яичника от самок с Х-хромосомными аберрациями после длительной трансплантации в мышей с ослабленным иммунитетом. Оба метода могут быть полезны в будущих исследованиях, чтобы получить представление о репродуктивном потенциале женщин с аберрациями Х-хромосомы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бесплодие - это проблема мужской или женской репродуктивной системы, затрагивающая примерно 186 миллионов человек репродуктивного возраставо всем мире 1. Не менее чем у 35% бесплодных пар бесплодие вызвано расстройством женской репродуктивнойсистемы2. Существует множество факторов, которые могут вызвать женское бесплодие, такие как генетические факторы, аномалии половых путей, эндокринная дисфункция, воспалительные заболевания и ятрогенное лечение3.

Генетические аномалии присутствуют примерно у 10% бесплодных женщин 4,5. Из всех генетических аномалий аберрации Х-хромосомы являются наиболее частой причиной дисгенезии яичников2. В нескольких исследованиях сообщалось, что аберрации Х-хромосомы у женщин с синдромом Тернера (ТС) или синдромом тройной Х-хромомы связаны с преждевременной недостаточностью яичников из-за ускоренной потери половых клеток или нарушения оогенеза 6,7,8.

Аберрации Х-хромосомы можно разделить на: 1) числовые аберрации, при которых число Х-хромосом разное, но Х-хромосомы не повреждены; и 2) структурные аберрации, при которых Х-хромосома приобрела или потеряла генетический материал 3,9. Числовые аберрации Х-хромосомы встречаются чаще, чем структурные аномалии, и часто вызваны спонтанными ошибками при деленииклеток 3,9. Когда такая ошибка возникает во время мейоза, это может привести к анеуплоидным гаметам и, в конечном итоге, к потомству с хромосомными аберрациями во всех клетках. Когда хромосомные дефекты возникают в соматических клетках в результате ошибок, возникающих при митозе на ранних стадиях онтогенеза, это может привести к мозаицизму. У этих людей присутствуют как клетки с нормальным содержанием Х-хромосомы, так и клетки с аберрациями Х-хромосомы.

В 1980-х годах был разработан цитогенетический метод, называемый флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH), для визуализации и определения местоположения специфических последовательностей нуклеиновых кислот на метафазных и межфазных хромосомах10,11. Этот метод использует флуоресцентные меченные ДНК-зонды для связывания с определенной последовательностью в хромосоме, которую затем можно визуализировать с помощью флуоресцентного микроскопа.

В настоящее время FISH широко используется в качестве клинического диагностического инструмента и считается золотым стандартом в выявлении хромосомных аберраций10. В области репродуктивной медицины анализ спермы FISH был использован для получения представления о содержании Х-хромосом сперматозоидов у мужчин с числовыми или структурными хромосомными аберрациями в соматических клетках12,13,14. Эти исследования показали, что мужчины с хромосомными аберрациями с большей вероятностью имели более высокую частоту анеуплоидных сперматозоидов, присутствующих в сперме, по сравнению с мужчинами с нормальными кариотипами12,13,14.

В отличие от сперматозоидов, очень мало известно о содержании Х-хромосомы клеток яичников (включая ооциты, гранулезные/тека-клетки и стромальные клетки) у людей с хромосомной аберрацией, а также о возможных последствиях анеуплоидии этих клеток на их репродуктивный потенциал. Важной причиной скудности информации о кариотипе клеток яичников по сравнению со сперматозоидами является тот факт, что женщинам приходится проходить инвазивную процедуру, такую как пункция фолликулов или операция по получению ооцитов или ткани коры яичников. Поэтому женские гаметы трудно получить в исследовательских целях.

В настоящее время в Нидерландах проводится обсервационное интервенционное исследование для изучения эффективности криоконсервации ткани яичников у молодых женщин с TS15. Один фрагмент ткани коры яичников пациентки был доступен для идентификации Х-хромосомного содержимого клеток яичников16,17. В рамках исследования был разработан новый метод, основанный на FISH диссоциированной ткани коры яичников, чтобы определить, присутствуют ли хромосомные аберрации в клетках яичников у женщин, несущих хромосомную аберрацию в неяичниковых соматических клетках, таких как лимфоциты или буккальные клетки. Кроме того, было определено влияние анеуплоидии в клетках яичников на фолликулогенез. С этой целью был модифицирован установленный протокол FISH, который позволяет анализировать гистологические срезы ткани коры яичников после искусственно индуцированного фолликулогенеза во время длительной ксенотрансплантации у мышей с ослабленным иммунитетом. В этом исследовании мы представляем два метода, основанных на FISH, для определения содержания Х-хромосомы в клетках яичников в нетрансплантированной и пересаженной ткани коры яичников у женщин с аберрациями Х-хромосомы, с целью улучшения фундаментальной науки по этой теме.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол исследования TurnerFertility был одобрен Центральным комитетом по исследованиям с участием людей (NL57738.000.16). В этом исследовании была получена ткань коры яичников 93 женщин с ТС. Материалы, требующие мер предосторожности, перечислены в таблице 1.

Таблица 1: Меры предосторожности.

МатериалОпасность
Уксусная кислотаСильные ожоги кожи и раздражение дыхательной системы
КоллагеназаРаздражает глаза, дыхательную систему и кожу
ДАПИРаздражает глаза, дыхательную систему и кожу
ДНКаза IРаздражает глаза, дыхательную систему и кожу
ЭтанолЛегковоспламеняющийся
ФормальдегидТоксичен после вдыхания, проглатывания и контакта с кожей
Формамид
(в флуоресцентных зондах)		Может навредить будущему ребенку
ЛиберазаРаздражает глаза, дыхательную систему и кожу
МетанолЛегко воспламеняется, токсичен при вдыхании, проглатывании и контакте с кожей
Нонидет П40Раздражает кожу или глаза
ПепсинРаздражает глаза, дыхательную систему и кожу
Протеиназа КЗатрудненное дыхание после вдоха
КсилолЛегко воспламеняется, токсичен после вдыхания и контакта с кожей. Избегать попадания в глаза.

Таблица 1: Материалы, требующие техники безопасности.

1. FISH на изолированных отдельных клетках коры яичников

  1. Диссоциация ткани коры яичников с получением отдельных клеток
    1. Разрежьте криоконсервированную/размороженную ткань коры яичника на небольшие кусочки размером примерно 1 мм x 1 мм x 1 мм с помощью скальпеля.
    2. Ферментативно расщепляют фрагменты ткани в 4 мл предварительно подогретой (37 °C) среды L15, содержащей 0,1 мг/мл смеси ферментов диссоциации тканей, 10 мкг/мл ДНКазы I и 1 мг/мл коллагеназы I из C. histolyticum в течение максимум 75 мин при 37 °C. Пипеткой перемешивайте смесь для пищеварения каждые 15 минут.
    3. Остановите ферментативное пищеварение, добавив 4 мл холодного L15 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Промойте диссоциированную ткань один раз 8 мл холодной среды L15 центрифугированием при 500 x g и ресуспендируйте в 500 мкл среды L15 без вихря, чтобы избежать повреждения клеток.
    4. Перенесите клеточную суспензию, содержащую в основном отдельные стромальные клетки и небольшие фолликулы (ооциты, окруженные одним слоем гранулезных клеток), в пластиковую чашку Петри и исследуйте клеточную суспензию под стереомикроскопом (100-кратное увеличение).
    5. Возьмите мелкие фолликулы (<50 мкм) вручную с помощью пластиковой пипетки 75 мкм и перенесите фолликулы в каплю среды L15 с добавлением 10% FBS при 4 ° C, чтобы предотвратить агрегацию фолликулов. Выполняйте забор фолликулов в течение максимум 30 минут. Чтобы улучшить распространение фолликулярных клеток перед анализом FISH, перенесите очищенные фолликулы в раствор 0,06% трипсина, 1 мг / мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 1 мг / мл глюкозы и инкубируйте в течение 20 минут при 37 ° C.
    6. Получают стромальные клетки яичников из суспензии клеток коры головного мозга с помощью пластиковой пипетки размером 75 мкм, уделяя особое внимание тому, чтобы избежать загрязнения мелкими фолликулами.
  2. РЫБНЫЙ анализ отдельных клеток яичников
    1. Перенесите обработанные фолликулы яичников (рекомендуемое n = 5-20) с трипсином/ЭДТА/глюкозой или стромальными клетками (n > 1000) в капли по 5 мкл 0,15 мМ KCl/15 мкл фосфатного буферного физиологического раствора Дульбекко (DPBS) на предметное стекло и инкубируйте в течение 20 мин при 37 ° C.
    2. Высушите и предварительно зафиксируйте предметные стекла в 300 мкл 0,05 мМ KCl/7,5% уксусной кислоты/22,5% метанола в течение 2 мин при комнатной температуре (RT). Накройте предметные стекла метанолом/уксусной кислотой (3:1) на 2 минуты при RT для окончательной фиксации.
    3. Сделайте 20-кратный стандартный цитрат натрия (SSC), добавив 876 г хлорида натрия и 441 г дигидрата три-цитрата натрия в 5 л дистиллированной воды. Затем добавьте 100 мл 20x SSC к 900 мл деминерализованной (деми) воды, чтобы получить 2x SSC. Промойте образец в 2x SSC при 73 ° C, покройте его 100 мкл 2% протеиназы K и запечатайте покровным стеклом. Инкубируйте предметные стекла в течение 10 мин при 37 °C на станции гибридизации.
    4. Снимите покровное стекло и промойте предметные стекла в течение 5 мин в DPBS при RT. Зафиксируйте образец на 5 мин 1% формальдегидом при RT. На этом этапе материал еще не полностью прикреплен к предметным стеклам, поэтому его не следует размещать на трясущейся платформе.
    5. Промывают предметные стекла в течение 5 мин в DPBS при RT с последующей дегидратацией в последующих 70%, 80%, 90% и 100% этаноле в течение 2 мин каждый. Высушите обезвоженный образец на воздухе и гибридизируйте его с флуоресцентно меченными зондами.
    6. Выберите центромерно-специфический зонд для хромосомы X и другой хромосомно-специфический центромерный зонд в качестве контроля для определения содержания X-хромосомы в клетках яичников. В этом случае используются центромер-специфические зонды для хромосомы X (CEP X [DXZ1]), непосредственно меченной флуорохромом SpectrumGreen и хромосомой 18 (CEP 18 [D18Z1]), непосредственно меченной флуорохромом SpectrumOrange.
    7. Добавьте 1 мкл CEP X, 1 мкл CEP 18 и 18 мкл гибридизационного буфера к образцу и запечатайте покровным стеклом, которое приклеивается к предметным стеклам, чтобы предотвратить испарение зонда во время гибридизации. Перенесите предметные стекла на станцию гибридизации для денатурации при 73 °C в течение 3 мин с последующей гибридизацией во время ночной инкубации при 37 °C.
    8. Удалите покровное стекло и оставшийся клей со предметного стекла после гибридизации. Промойте предметные стекла в 0,4x SSC/0,3% Tween-20 при 72 °C в течение 2 мин с последующей инкубацией в течение 1 мин в 2x SSC/0,1% Tween-20 при RT.
    9. Обезвоживают предметные стекла последующими 2-минутными инкубациями в 70%, 80%, 90% и 100% этаноле и сушат на воздухе в темноте. Накройте предметные стекла монтажной средой, содержащей 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Хранить при -20 °C не менее 10 минут перед анализом флуоресцентной микроскопией.
  3. Отображение
    1. Изучите сигнал (сигналы) Х-хромосомы с помощью флуоресцентного микроскопа, подключенного к программному обеспечению для обработки изображений.
      1. Во-первых, выберите флуорохром DAPI.
        1. Чтобы получить изображение, выберите «Новая ячейка» > «Захват > реальном времени » с 630-кратным увеличением. Появится новое окно с порогом. Установите синюю полосу порогового значения на 0, чтобы свести к минимуму фон, и красную полосу на максимум (255), чтобы сделать сигналы ярче. Нажмите « Принять».
        2. Появится новое окно с улучшением с предложением темнее/ярче (12), радиуса (3) и глубины (1). Используйте предложенные значения или скорректируйте их, если вас это не устраивает.
      2. Во-вторых, выберите флуорохром SpectrumOrange и нажмите «Захват».
        1. Установите синюю полосу порогового значения на 0, чтобы свести к минимуму фон, и красную полосу на максимум (255), чтобы сделать сигналы ярче. Нажмите « Принять».
        2. Появится окно с улучшением с предложением темнее/ярче (-11), радиуса (2,7) и глубины (0,6). Используйте предложенные значения или скорректируйте их, если вас это не устраивает.
      3. Наконец, выберите флуорохром SpectrumGreen и нажмите «Захват».
        1. Установите синюю полосу порогового значения на 0, чтобы свести к минимуму фон, и красную полосу на максимум (255), чтобы сделать сигналы ярче. Нажмите « Принять».
        2. Появится окно с улучшением с предложением темнее/ярче (0), радиуса (3) и глубины (0). Используйте предложенные значения или скорректируйте их, если они вас не устраивают. Сохраните изображение во вновь созданном файле.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Соматические клетки оценивались только тогда, когда были видны два сигнала контрольной хромосомы 18. В большинстве ооцитов для каждой хромосомы может быть обнаружен только один сигнал.
    2. Храните предметные стекла в темноте при температуре 4 °C после анализа, чтобы предотвратить потерю сигнала.

2. FISH на парафиновых срезах пересаженной ткани коры яичника

ПРИМЕЧАНИЕ: Один фрагмент криоконсервированной/размороженной ткани коры яичников 18 самок с TS был ксенотрансплантат мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) в течение 5 месяцев. Процедура ксенотрансплантации была описана ранее и проводилась в Католическом университете Лувена (Брюссель, Бельгия) в соответствии с местными рекомендациями Комитета по исследованиям животных в отношении благополучия животных (ссылка 2014/UCL/MD/007)18,19.

  1. Выделение участков ксенотрансплантированной ткани коры яичника, содержащих фолликулы
    1. Зафиксируйте ксенотрансплантированную ткань коры яичника в 4% формальдегиде и вставьте ткань в парафин. Обрежьте блоки скальпелем, чтобы удалить лишний парафин, и разрежьте парафиновый блок до толщины 4 мкм на микротоме вращения.
    2. Выберите каждый седьмой участок парафиновой ленты для окрашивания гематоксилином и эозином (HE), чтобы определить, какие участки содержат фолликулы. Поместите срезы на водяную баню при температуре 40-45 °C и установите их на предметные стекла иммуногистохимического микроскопа.
  2. Депарафинизация и ОФ-окрашивание
    1. Поставьте горки на плиту на 10 минут при температуре 60 °C, а затем погрузите горки в 100% ксилол на 5 минут. Не обязательно размещать горки непосредственно на плите. Гидратируют срезы в течение 15 с в 100% этаноле, а затем 2 х 15 с в 96% этаноле. Промойте предметные стекла в водопроводной воде в течение 2 минут.
    2. Окрашивайте предметные стекла в гематоксилине в течение 10 минут, а затем ненадолго промойте предметные стекла в водопроводной воде. Ненадолго погрузите предметные стекла в раствор гидрокарбоната (100 г сульфата магния и 10 г гидрокарбоната натрия в 5 л дистиллированной воды). Промойте предметные стекла в водопроводной воде в течение 5 минут.
    3. Запятнайте предметные стекла эозином в течение 4 минут и трижды обезвоживайте предметные стекла 100% этанолом, а затем ксилолем. Нанесите пятна HE на предметные стекла и оцените срезы HE под световым микроскопом, чтобы выбрать срезы с фолликулами (100-кратное увеличение).
  3. Предварительная обработка и гибридизация парафиновых срезов для ДНК FISH
    1. Выделите новые участки, которые лежали до или после участка, содержащего фолликулы из парафиновой ленты. Смонтируйте одну секцию на предметное стекло. Высушите парафиновые участки не менее 45 минут на плите при температуре 56 °C. Не обязательно размещать горки непосредственно на плите.
    2. Депарафинизируйте срезы в ксилоле в течение 10 мин. Погрузите предметные стекла в 99,5% этанол и промойте их в течение 5 минут в водопроводной воде. Предварительно обработайте предметные стекла целевым поисковым раствором (низкий pH) в течение 10 мин при 96 °C. После остывания промойте предметные стекла в дистиллированной воде.
    3. Обработать предметные стекла в течение 5 мин 0,01 М соляной кислотой с последующим расщеплением пепсина (200 ЕД/мл) в течение 15 мин при 37 °C. Промойте предметные стекла еще раз в 0,01 М соляной кислоте, а затем в PBS.
    4. Зафиксируйте предметные стекла в 1% формальдегиде/PBS в течение 5 мин. Ненадолго промойте предметные стекла в PBS, а затем снова в деми-воде. Обезвоживайте предметные стекла в 99,5% этанола и дайте им высохнуть на воздухе.
    5. Выберите центромерно-специфический зонд для хромосомы X и другой хромосомно-специфический центромерный зонд в качестве контроля для определения содержания X-хромосомы в клетках гранулезы. Здесь хромосома 18 используется в качестве контроля.
    6. Нанесите 5 мкл зонда CEP 18 (D18Z1), непосредственно меченного флуорохромом SpectrumGreen, и зонда CEP X (DXZ1), непосредственно меченного флуорохромом SpectrumRed, на предварительно обработанные предметные стекла. Нанесите покровное стекло и заклейте область фотоклеем. Поместите предметные стекла в гибридизатор для денатурации при 80 °C на 10 мин и гибридизации на ночь при 37 °C.
    7. На следующий день промойте предметные стекла в течение 5 мин в 2x SSC при 42 °C, затем 2 мин и 1 мин ополаскивайте в 0,3% Nonidet P40 при 73 °C. Обновите 2x SSC и снова промойте предметные стекла в течение 5 минут при комнатной температуре. Накройте кювету так, чтобы срезы держались в темноте.
    8. Ненадолго промойте предметные стекла в дистиллированной воде. Обезвоживайте предметные стекла в 99,5% этанола и дайте им снова высохнуть на воздухе. Наконец, установите слайды с помощью раствора, содержащего DAPI и монтажную среду.
  4. Отображение
    1. Проанализируйте результаты под флуоресцентным микроскопом при 630-кратном увеличении. Откройте программное обеспечение для обработки изображений на компьютере. Выберите FISH в качестве профиля.
    2. Проверьте, установлено ли излучение DAPI на 431 нм и возбуждение на 359 нм, красное излучение Техаса на 613 нм и возбуждение на 595 нм, излучение FITC на 519 нм и возбуждение на 495 нм.
    3. Чтобы получить образ, выберите « Прямой эфир» > «Захват одного образа». Оптимизируйте качество изображения, отрегулировав экспозицию и усиление, перемещая ползунки экспозиции и усиления в меню «Изображение » слева (например, экспозиция: 212 мс и усиление: 7,9). Требуемая экспозиция и усиление могут варьироваться в зависимости от изображения; Наблюдайте за изменениями во время этого процесса, чтобы получить оптимизированное изображение. Сохраните изображение во вновь созданном файле.
    4. Храните предметные стекла в темноте при температуре 4 °C после анализа, чтобы предотвратить потерю сигнала.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FISH на изолированных клетках яичников перед прививкой
Криоконсервированная ткань коры яичников у женщин с 45,X/46,XX (пациентка А) или 45,X/46,XX/47,XXX (пациентка Б) TS была использована для иллюстрации результатов с использованием этого протокола. У пациента А 50% лимфоцитов имели кариотип 45,Х и 50% - 46,ХХ. У пациента В 38% лимфоцитов были 45,X, 28% - 46,XX, а 34% - 47,XXX. Центромер-специфические зонды для хромосомы X (зеленый) и хромосомы 18 в качестве контрольной (красный) использовали для опр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ FISH является хорошо известным методом обнаружения Х-хромосомных аберраций в лимфоцитах или буккальных клетках как мужчин, так и женщин10. В нескольких исследованиях была описана FISH на гаметах мужчин с Х-хромосомными аберрациями, но подробная информация, полученная FISH на клетках яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями, все еще отсутствует14. В этой статье представлены новые методы, основанные на FISH, для определения наличия анеуплоидии в клетках яичников ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность Марьо ван Бракелю, Доминику Смитсу, Гийому ван де Занде, Патрисии ван Клиф и Милану Интезару за их опыт и техническую помощь. Источники финансирования: Merck Serono (A16-1395), Goodlife и Ferring.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислотаBiosolve BV0001070602BS
Центрифуга 1200Hettich Universal4140
Коллагеназа ISigma131470
CoverslipVWR0631-0146
DAPIVectorH-1200
DNase iRoche10104159001
Дульбекко s Фосфатно-солевой буфер LonzaBE17-513Q
EDTAMerck108421
Eosin-YSigma1159350100
ЭтанолEMSURE1009832500
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Life technology10100147
Флуоресцентный микроскоп для секций DM4 BLeica Microsystems 
Флуоресцентный микроскоп прицел A1Zeiss AXIO
Флуоресцентные меченые зонды для диссоциированных клетокAbbott DiagnosticsCEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
Флуоресцентные меченые зонды для срезов тканейAbbott DiagnosticsCEP X (DXZ1 05J08-023
CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
ФормальдегидSigma252549
глюкозаMerck108337
клей (Fixogum)Leica MicrosystemsLK071A
ГематоксилинSigma1159380025
гибридизационный буферAbott Diagnostics32-804826/06J67-001
Станция гибридизации DakoS2451
Соляная кислотаMerck1003171000
Программное обеспечение для обработки изображений отдельных клеток коры яичников (Cytovision 7.7)Leica Biosystems
Программное обеспечение для обработки изображений на парафинных срезах Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Иммуногитохимический микроскоп предметные стеклаDakoK802021-2
L15Lonza12-700Q
Liberase DHRoche05 401 151 001
Световой микроскопZeiss West Germany
Сульфат магнияMerckA335586
МетанолHoneywell14262-1L
Монтажная средаVectashield, VectorH-1000
Nonidet P40Sigma7385-1L
ПарафинPoth Hile2712.20.10
PepsinSigmaP7000-25G
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Gibco11530546
пластик пипеткаCooperSurgical7-72-4075/1
Хлорид калия Merck1049361000
Proteinase KQiagen19131
Ротационный микротом HM 355SThermo sceintific
ScalpelDahlhausen11.000.00.515
Слайд для FISH на диссоциированных клеткахThermo scientificJ1810AM1JZ
Бикарбонат натрияSigma55761-500G
Стандартный цитрат натрия (ССК)Fisher Scientific, Invitrogen10515203
Stereomicroscope IX 70Olympus
Target Retrieval Solution    DakoGV80511-2
ТрипсинSigmaT4799
Tween-20ThermoFisher85113
КсилолBOOM760518191000

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
  2. Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
  3. Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65(2021).
  4. Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
  5. Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675(2011).
  6. Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
  7. Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
  8. Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
  9. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  10. Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
  11. Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3(2014).
  12. Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
  13. Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
  14. Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
  15. Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855(2019).
  16. Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
  17. Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
  18. Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
  19. Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
  20. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
  21. Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
  22. Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in situ FISH

Похожие статьи