Методическая статья

Клеточно-специфический парный опрос эпигенома яичников мыши и транскриптома

DOI:

10.3791/64765

⸱

24 февраля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Aging and Metabolism Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Genes & Human Disease Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Oklahoma City Veterans Affairs Medical Center, 4Nutrition College, Federal University of Pelotas

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе метод трансляционной очистки аффинности рибосом (TRAP) и метод выделения ядер, меченных в определенных типах клеток (INTACT), были оптимизированы для парного опроса клеточно-специфического транскриптома яичников и эпигенома с использованием мышиной модели NuTRAP, скрещенной с линией мыши Cyp17a1-Cre.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка эпигеномных и транскриптомных изменений, специфичных для клеточного типа, является ключом к пониманию старения яичников. С этой целью была проведена оптимизация метода трансляционной очистки аффинности рибосом (TRAP) и метода выделения ядер, меченных в определенные типы клеток (INTACT) для последующего парного опроса клеточно-специфического транскриптома яичников и эпигенома с использованием новой трансгенной мышиной модели NuTRAP. Экспрессия аллеля NuTRAP находится под контролем флоксированной кассеты STOP и может быть нацелена на определенные типы клеток яичников с использованием промотор-специфических линий Cre. Поскольку недавние исследования показали, что стромальные клетки яичников управляют фенотипами преждевременного старения, система экспрессии NuTRAP была нацелена на стромальные клетки с использованием драйвера Cyp17a1-Cre. Индукция конструкции NuTRAP была специфична для стромальных фибробластов яичников, и достаточное количество ДНК и РНК для исследований секвенирования было получено из одного яичника. Представленная здесь модель и методы NuTRAP могут быть использованы для изучения любого типа клеток яичников с доступной линией Cre.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Яичники являются основными игроками в соматическом старении1, с отчетливым вкладом определенных клеточных популяций. Клеточная гетерогенность яичника затрудняет интерпретацию молекулярных результатов анализов объемных и цельных яичников. Понимание роли специфических клеточных популяций в старении яичников является ключом к выявлению молекулярных факторов, ответственных за снижение фертильности и здоровья у пожилых женщин. Традиционно мультиомическая оценка конкретных типов клеток яичников достигалась с помощью таких методов, как лазерная микродиссекция2, одноклеточные подходы3 или сортировка клеток4. Однако микродиссекция может быть дорогостоящей и сложной в выполнении, а сортировка клеток может изменить клеточные фенотипические профили5.

Новый подход к оценке эпигеномных и транскриптомных профилей, специфичных для типа клеток яичников, использует модель мыши с ядерным мечением и трансляцией очистки аффинности рибосом (NuTRAP). Модель NuTRAP позволяет выделять нуклеиновые кислоты, специфичные для клеточного типа, без необходимости сортировки клеток, используя методы аффинной очистки: трансляцию очистки аффинности рибосом (TRAP) и выделение ядер, меченных в определенных типах клеток (INTACT)6. Экспрессия аллеля NuTRAP находится под контролем флоксированной кассеты STOP и может быть нацелена на определенные типы клеток яичников с использованием промотор-специфических линий Cre. При скрещивании мыши NuTRAP с клеточно-специфической линией Cre удаление кассеты STOP вызывает eGFP-мечение рибосомного комплекса и биотин/mCherry-мечение ядра Cre-зависимым образом6. Затем методы TRAP и INTACT могут быть использованы для выделения мРНК и ядерной ДНК из интересующего типа клеток и перехода к транскриптомному и эпигеномному анализу.

Модель NuTRAP использовалась в различных тканях, таких как жировая ткань6, мозговая ткань 7,8,9 и сетчатка10, для выявления специфических для клеточного типа эпигеномных и транскриптомных изменений, которые не могут быть обнаружены в гомогенате цельных тканей. Преимущества подхода NuTRAP по сравнению с традиционными методами сортировки клеток включают следующее: 1) предотвращение активационных артефактов ex vivo 8, 2) минимизация потребности в специализированном оборудовании (например, сортировщиках клеток) и 3) увеличение пропускной способности и снижение стоимости анализов, специфичных для типа клеток. Кроме того, способность выделять специфическую для клеточного типа ДНК и РНК от одной мыши позволяет проводить парные анализы, которые увеличивают статистическую мощность. Поскольку недавние исследования показали, что стромальные клетки яичников приводят к преждевременному старению фенотипов 11,12,13, мы нацелили систему экспрессии NuTRAP на стромальные и тека-клетки с помощью драйвера Cyp17a1-Cre. Здесь мы демонстрируем, что индукция конструкции NuTRAP специфична для стромальных и тека-клеток яичников, а достаточное количество ДНК и РНК для исследований секвенирования получено из одного яичника. Представленная здесь модель и методы NuTRAP могут быть использованы для изучения любого типа клеток яичников с любой доступной линией Cre.

Для генерации клеточного тип-специфической линии мышей NuTRAP яичников аллель ядерной маркировки и трансляции очистки аффинности рибосом (NuTRAP) имеет флоксированный кодон STOP, который контролирует экспрессию BirA, пептида распознавания биотинлигазы (BLRP), меченного mCherry/mRANGAP1, и eGFP/L10a. При скрещивании с клеточно-специфической линией Cre экспрессия кассеты NuTRAP мечет ядерный белок mRANGAP1 биотином/mCherry и рибосомный белок L10a с eGFP Cre-зависимым образом. Это позволяет выделять ядра и мРНК из определенных типов клеток без необходимости сортировки клеток. NuTRAP flox/flox может быть сопряжен со специфическим для клеточного типа Cre, относящимся к типам клеток яичников, чтобы оценить это.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Фонде медицинских исследований Оклахомы (OMRF). Родительские мыши были приобретены в лаборатории Джексона (Бар-Харбор, штат Мэн) и разведены и размещены в условиях SPF в барьерной среде HEPA в цикле свет/темнота 14 часов / 10 часов (свет включается в 6:00 утра) в OMRF.

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой демонстрации мы используем самца Cyp17iCre+/- (Штамм # 028547, Лаборатория Джексона) в паре с самкой NuTRAP (Штамм # 029899, Лаборатория Джексона). Желаемое потомство Cyp17-NuTRAP (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) будет экспрессировать аллель NuTRAP под контролем промотора Cyp17a1 в стромальных клетках яичников. Для подготовки этой рукописи мы использовали 4-месячных самок мышей Cyp17-NuTRAP (n = 4). ДНК была извлечена из образцов ушного перфоратора мыши для генотипирования для подтверждения наследования трансгенов Cyp17iCre и NuTRAP и для ПЦР-обнаружения 1) дженерика Cre, 2) Cyp17iCre и 3) NuTRAP, флоксированных с использованием праймеров, перечисленных в таблице материалов, как описано ранее 7,8.

1. Расслоение яичников мыши

  1. Выполните эвтаназию мышей в соответствии с рекомендациями по уходу за животными и одобрением учреждения с последующим забором яичников.
  2. Препарируйте яичники, чтобы удалить любую жировую ткань или части яйцеводов, которые могут быть прикреплены к ткани яичника, прежде чем помещать яичники в трубки с буфером. Немедленно приступайте к технике TRAP или INTACT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не был оптимизирован для использования с замороженными тканями. Использование одного яичника от одной и той же мыши для каждого метода рекомендуется для будущего статистического анализа.

2. Выделение ядер из определенных типов клеток яичников

  1. Подготовка буфера
    1. Буфер ядерной очистки (NPB): Чтобы приготовить 100 мл NPB, смешайте 2 мл 1 М HEPES (конечная концентрация: 20 мМ HEPES), 0,8 мл 5 M NaCl (40 мМ NaCl), 4,5 мл 2 M KCl (90 мМ KCl), 0,4 мл 0,5 М ЭДТА (2 мМ ЭДТА), 0,1 мл 0,5 М EGTA (0,5 мМ EGTA), и 92,2 мл воды, не содержащей нуклеаз. Добавка с 1x ингибитором протеазы в день выделения ядер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: NPB может быть приготовлен без ингибитора протеазы заранее и действует до 3 недель при 4 ° C.
    2. Буфер для лизиса ядер (полный): Дополните буфер для лизиса ядер 1x ингибитором протеазы в день выделения ядер.
  2. Создание суспензии ядер
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны постоянно находиться на льду, если не указано иное.
    1. Соберите один яичник у мыши Cyp17-NuTRAP (или другого соответствующего Cre-NuTRAP) в 500 мкл буфера для лизиса ядер (полный). Разрежьте завязь на восемь частей внутри буфера с помощью самооткрывающихся микроножниц.
    2. Используйте широкопроходные наконечники пипеток, чтобы перенести измельченный яичник и 500 мкл лизисного буфера в стеклянный гомогенизатор Dounce на льду. Гомогенизируйте завязь 10x-20x рыхлым пестиком А. Добавьте 400 мкл лизисного буфера в гомогенизатор Dounce, промывая пестик А.
    3. Гомогенизируйте завязь тугим пестиком B 10x-20x. Добавьте 1000 мкл буфера для лизиса, промывного пестика B. Перелейте гомогенат (1,9 мл) в пробирку с круглым дном объемом 2 мл.
    4. Центрифугу в дозе 200 x g в течение 1,5 мин при 4 °C для удаления недиссоциированных тканей и кровеносных сосудов14. Надосадочная жидкость содержит ядра; Откажитесь от гранул недиссоциированной ткани.
    5. После предварительного смачивания клеточного ситечка 30 мкм с 100 мкл лизисного буфера и фильтруйте надосадочную жидкость через клеточный фильтр в коническую трубку объемом 15 мл. Затем переложите смесь, содержащую ядра, в пробирку с круглым дном объемом 2 мл.
    6. Центрифугируют образец при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C и удаляют надосадочную жидкость. Гранула содержит ядра.
    7. Ресуспендируют ядерную таблетку в 250 мкл ледяного лизисного буфера путем кратковременного вихряния с умеренной или высокой скоростью. Доведите объем до 1,75 мл, добавив 1,5 мл буфера для лизиса. Аккуратно перемешайте и положите ядерную суспензию на лед на 5 минут.
    8. Гранулируют ядра центрифугированием при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая ядерную таблетку. Ресуспендируйте гранулу в 200 мкл ледяного буфера для хранения и кратковременно встряхните, чтобы полностью ресуспендировать ядерную таблетку.
    9. Зарезервируйте 10% ресуспендированной гранулы (20 мкл) в качестве образца входных ядер для последующего анализа.
    10. Возьмите ресуспендированную гранулу ядер и доведите объем до 2,0 мл с помощью ледяного NPB. Приступайте к выделению меченых ядер с использованием метода очистки на основе INTACT аффинности.
  3. Выделение ядер, меченных в определенных типах клеток (INTACT)
    1. Встряхните шарики стрептавидина во флаконе в течение 30 с на средней скорости, чтобы убедиться, что они полностью ресуспендированы. Добавьте 30 мкл ресуспендированных шариков для каждого образца в пробирку с круглым дном объемом 2 мл (шарики для 10 образцов можно промыть в одной пробирке), добавьте 1 мл NPB и хорошо ресуспендируйте пипеткой.
    2. Поместите трубку на магнитную стойку на 1 минуту, чтобы отделить шарики. Выбросьте надосадочную жидкость и снимите трубку с магнита. Ресуспендировать промытые магнитные шарики в 1 мл NPB.
    3. Повторите этап стирки в общей сложности три стирки. После окончательной промывки ресуспендируйте шарики в исходном объеме NPB (30 мкл на образец).
    4. Добавьте 30 мкл промытых шариков в ядерную суспензию объемом 2 мл на этапе 2.2.10. Хорошо ресуспендируйте смесь шариков и ядер, пипетируя и осторожно переворачивая трубку.
    5. Поместите трубки на вращающийся миксер в холодильную камеру или холодильник на 30 минут на низкой скорости. Инкубируйте входные образцы без шариков в тех же условиях.
    6. Поместите трубки с ядерной суспензией и шариками на магнит и отделите биотинилированные ядра, связанные с шариками стрептавидина (положительная фракция), от отрицательной фракции ядер. Дайте шарикам разойтись на магните в течение 3 минут.
    7. Удалите надосадочную жидкость, передайте отрицательную фракцию в свежую пробирку объемом 2,0 мл и оставьте на льду. Для каждой пробирки с положительной фракцией извлеките пробирку из магнита и ресуспендируйте содержимое в 1 мл NPB.
    8. Поместите трубку на магнит на 1 минуту и выбросьте надосадочную жидкость. Извлеките трубку из магнита и ресуспендируйте промытую смесь шариков и ядер в 1 мл NPB.
    9. Повторите шаг 2.3.8, чтобы получить в общей сложности три стирки. После завершения трех промывок ресуспендировать смесь шариков и ядер положительной фракции в 30 мкл NPB.
    10. Для каждой пробирки с отрицательной фракцией центрифугируют ядерную суспензию со стадии 2.3.7 при 500 x g в течение 7 мин при 4 °C. Тщательно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендировать гранулу ядер отрицательной фракции в 30 мкл NPB.
    11. Храните ядра из входа (этап 2.2.9), отрицательную фракцию (этап 2.3.10) и положительную фракцию (этап 2.3.9) в морозильной камере при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут готовы к выделению ядерной ДНК или РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ядра не следует замораживать для протоколов, требующих интактных ядер в качестве входных данных (т.е. анализ на транспозаз-доступный хроматин, иммунопреципитация хроматина).

3. Выделение мРНК из определенных типов клеток яичников

  1. Подготовка буферов
    1. Буферная основа TRAP: Приготовьте 100 мл буферной основы TRAP, объединив 78,8 мл воды, не содержащей РНКазы, 5 мл 1 М Tris-HCl (конечная концентрация: 50 мМ Tris [pH 7,5]), 5 мл 2 M KCl (100 мМ KCl), 1,2 мл 1 M MgCl2 (12 мМ MgCl2) и 10 мл 10% NP-40 (1% NP-40). Хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.
    2. Буферная основа с высоким содержанием соли: Приготовьте 100 мл буферной основы с высоким содержанием соли, объединив 68,8 мл воды, не содержащей РНКазы, 5 мл 1 М трис-HCl (конечная концентрация: 50 мМ Трис [рН 7,5]), 15 мл 2 М KCl (300 мМ KCl), 1,2 мл 1М MgCl 2 (12 мМ MgCl2) и 10 мл 10% NP-40 (1% NP-40). Хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.
    3. Буфер гомогенизации TRAP (полный): Приготовьте 1,5 мл на образец в день сбора ткани. Приготовьте 10 мл гомогенизационного буфера TRAP, объединив 10 мл буферной основы TRAP (из этапа 3.1.1) с 10 мкл 100 мг/мл циклогексимида (конечная концентрация: 100 мкг/мл циклогексимида), 10 мг гепарина натрия (1 мг/мл гепарина натрия), 20 мкл 0,5 М DTT (1 мМ DTT), 50 мкл 40 ЕД/мкл ингибитора РНКазы (ингибитор РНКазы 200 ЕД/мл), 200 мкл 0,1 М спермидина (2 мМ спермидина) и одна таблетка ингибитора протеазы без ЭДТА (1x).
    4. Буфер для промывки с низким содержанием соли (полный): сделайте 1,5 мл на образец в день сбора ткани. Чтобы приготовить 10 мл промывочного буфера с низким содержанием соли, смешайте 10 мл буферной основы TRAP (с этапа 3.1.1) с 10 мкл 100 мг/мл циклогексимида (100 мкг/мл циклогексимида) и 20 мкл 0,5 М DTT (1 мМ DTT).
    5. Буфер для промывки с высоким содержанием соли (полный): Сделайте 1,5 мл на образец на второй день выделения TRAP. Чтобы приготовить 10 мл буфера для промывки с высоким содержанием соли, смешайте 10 мл буферной основы с высоким содержанием соли (из шага 3.1.2) с 10 мкл 100 мг/мл циклогексимида и 20 мкл 0,5 М DTT.
  2. Выполнение трансляционной очистки сродства рибосом (TRAP)
    1. Соберите другой яичник у мыши Cyp17-NuTRAP (или другого соответствующего Cre-NuTRAP) и поместите его в пробирку объемом 1,5 мл без РНКазы, содержащую 100 мкл ледяного буфера гомогенизации TRAP (из шага 3.1.3). Разрежьте завязь на восемь частей внутри буфера с помощью самооткрывающихся микроножниц.
    2. Используйте широкопроходные наконечники для переноса яичника и 100 мкл гомогенизационного буфера в стеклянный гомогенизатор Dounce. Гомогенизируйте 10x-20x с помощью рыхлого пестика A. Добавьте 400 мкл буфера гомогенизации TRAP, промывного пестика A.
    3. Перелейте гомогенат в пробирку с круглым дном объемом 2 мл. Промойте гомогенизатор Dounce дополнительным 1 мл гомогенизационного буфера TRAP и перенесите промытый объем в пробирку с круглым дном объемом 2 мл.
    4. Центрифугируют гомогенат при 12 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Перенесите очищенную надосадочную жидкость в свежую пробирку с круглым дном объемом 2 мл. Выбросьте гранулы.
    5. Перелейте 100 мкл очищенного гомогената в свежую пробирку с круглым дном объемом 2 мл и оставьте в качестве ввода на льду.
    6. Инкубируют остаток очищенного гомогената (из этапа 3.2.4) с антителом против GFP (5 мкг/мл) в течение 1 ч при 4 °C, вращая конец за концом. Инкубируйте входной образец в тех же условиях.
    7. В течение последних 15 минут инкубации вымойте магнитные шарики белка G в буфере для промывки с низким содержанием соли, выполнив следующие действия (3.2.8-3.2.11).
    8. Встряхните флакон с магнитными шариками белка G в течение 30 с, чтобы полностью ресуспендировать. Перенесите 50 мкл магнитных шариков белка G для каждого образца (в одной пробирке можно промыть до 10 образцов) в пробирку с круглым дном объемом 2 мл.
    9. Добавьте 500 мкл промывочного буфера с низким содержанием соли к шарикам и аккуратно перемешайте пипеткой. Поместите трубку в магнитную подставку на 1 минуту, чтобы собрать шарики на боковой стороне трубки. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
    10. Извлеките пробирку из магнитной подставки и добавьте в пробирку 1 мл буфера для промывки с низким содержанием соли. Пипеткой аккуратно перемешать. Поместите трубку в магнитную подставку на 1 минуту, чтобы собрать шарики на боковой стороне трубки. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.
    11. Повторите шаг 3.2.10, чтобы получить в общей сложности три стирки. После окончательной промывки извлеките трубку из магнитной стойки и снова суспендируйте шарики в начальном объеме буфера для промывки с низким содержанием соли (50 мкл на образец).
    12. Перенесите ресуспендированные промытые шарики (50 мкл) в смесь образца антигена и антитела и инкубируйте при 4 ° C в течение ночи, вращая в смесителе. Инкубируйте входные образцы, вращаясь от конца к концу при 4 ° C в течение ночи, чтобы поддерживать эквивалентные условия.
    13. После ночной инкубации извлеките пробирки из ротатора и отделите магнитные шарики с мишенью рибосомами/РНК (положительная фракция) от надосадочной жидкости (отрицательной фракции) с помощью магнитного стенда в течение 2,5-3 мин. Аспирируйте отрицательную фракцию, поместите ее в свежую пробирку с круглым дном объемом 2 мл и отложите на лед во время обработки положительной фракции.
    14. Добавьте 500 мкл буфера для промывки с высоким содержанием соли (из шага 3.1.5) в пробирку с положительной фракцией и аккуратно перемешайте пипеткой. Поместите трубку на магнитную подставку, поддерживаемую на льду в течение 1 минуты, чтобы отделить шарики. Выбросьте надосадочную жидкость и снимите трубку с магнита.
    15. Повторите шаг 3.2.14 для трех стирок. После окончательной промывки ресуспендируют шарики в 350 мкл буфера для лизиса РНК с добавлением 3,5 мкл 2-меркаптоэтанола (BME). Инкубируйте пробирки при комнатной температуре, перемешивая в течение 10 минут при 900 об/мин в цифровом шейкере.
    16. Отделите шарики от раствора, который теперь содержит целевые рибосомы / РНК, с помощью магнитной подставки в течение 1 минуты при комнатной температуре. Соберите элюированную положительную фракцию (надосадочную жидкость) в свежую пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 350 мкл 100% этанола. Переверните, чтобы перемешать. Приступаем к выделению РНК.
    17. Дополнительно: Чтобы выделить РНК из входного образца (этап 3.2.5) и отрицательной фракции (этап 3.2.13), перенесите 100 мкл входной и отрицательной фракций в свежие пробирки объемом 1,5 мл. Добавьте 350 мкл буфера для лизиса РНК с добавлением 3,5 мкл BME к каждому образцу. Переверните, чтобы перемешать. Добавьте 250 мкл 100% этанола в каждую пробирку и перемешайте. Приступаем к выделению РНК.
  3. Выделение РНК
    1. Перенос 700 мкл положительной фракции и, необязательно, входной и/или отрицательной фракции в спиновую колонку РНК. Следуйте инструкциям производителя, чтобы выделить РНК из спиновой колонки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схема протоколов TRAP и INTACT показана на рисунке 1. Здесь специфичность мышиной модели Cyp17-NuTRAP к стромальным/тека-клеткам яичников демонстрируется иммунофлуоресцентной визуализацией и РНК-секвенированием из РНК, изолированной TRAP. Сначала была выполнена иммунофлуоресцентная визуализация сигнала eGFP в яичнике и локализация сигнала eGFP в тека и стромальных клетках. Вкратце, срезы размером 5 мкм были депарафинизированы градиентом ксилола и этанола. Для лучшей передачи сигналов eGFP бе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышиная модельNuTRAP 6 представляет собой мощный подход к трансгенной маркировке для парного опроса транскриптома и эпигенома из определенных типов клеток, которые могут быть адаптированы к любому типу клеток с доступным драйвером Cre. Здесь мы демонстрируем специфичность мышиной модели Cyp17-NuTRAP в нацеливании на тека яичников и стромальные клетки. Модель Cyp17-NuTRAP может быть использована для дальнейшего выяснения эпигенетических механизмов, специфичных для тека и стромальных клеток, участву...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) и Presbyterian Health Foundation. Эта работа также была частично поддержана наградой MERIT I01BX003906 и наградой Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) ISIBX004797 из Соединенных Штатов (США). Департамент по делам ветеранов, Служба исследований и разработок биомедицинских лабораторий. Авторы также хотели бы поблагодарить Центр клинической геномики (OMRF) и Центр визуализации (OMRF) за помощь и использование инструментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,1 м спермидинSigma-Aldrich05292-1ML-F
1 M MgCl2Thermo ScientificAM9530G
10% NP-40Thermo Scientific85124
100 мг/мл циклогексимидSigma-AldrichC4859-1ML
2-меркаптоэтанолSigma-AldrichM3148
30 &микро; Ситечко для клеток M Miltenyi Biotec130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
anti-GFP антителоAbcamAb290For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP)
Buffer RLTQiagen79216RNA Lysis Buffer in protocol
cOmplete, mini, таблетка ингибитора протеазы без ЭДТАRoche11836170001для гомогенизации TRAP Буфер
Cyp17iCre модель мышиThe Jackson Laboratory28547B6; SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 магнитInvitrogen12321D
Генотипирование ПраймерыIDTCustomGeneric Cre - Jackson Laboratory протокол 22392, Праймеры: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
         Cyp17iCre - Протокол лаборатории Джексона 30847, Праймеры: 21218, 31704, 31705, 35663
         NuTRAP - протокол лаборатории Джексона 21509, праймеры: 21306, 24493, 32625, 32626
Коктейль ингибиторов протеазы Halt (100X)Thermo Scientific1861278для буфера NPB
M-280 Streptavidin Dynabeads Инвитроген11205Д2.8 &; m диаметр гранул
MixMateEppendorf5353000529
Набор для выделения ядер: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNuc101содержит буфер для лизиса ядер и буфер для хранения ядер
1 m HEPESGibco15630-080
5 M NaClThermo ScientificAM9760G
2M KClThermo ScientificAM9640G
0,5 М EDTAThermo ScientificAM9260G
0,5 М EGTAFisher Scientific50-255-956
NuTRAP модель мышиThe Jackson Laboratory29899B6; 129S6-GT(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT No-Weigh FormatThermo ScientificA39255
Protein G DynabeadsThermoFisher10004DFor TRAP
RNaseOUTInvitrogen10777019
гепарином натрияFisher ScientificBP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7,5Invitrogen15567-027
Вращатель трубок VWRFisher ScientificNC9854190

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
  3. Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239(2022).
  4. Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591(2008).
  5. Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
  6. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  7. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693(2020).
  8. Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
  9. Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570(2022).
  10. Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931(2022).
  11. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).
  12. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  13. Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
  14. Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973(2013).
  15. Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851(2020).
  16. Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
  17. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5(2020).
  18. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
  19. Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
  20. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049(2017).
  21. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  22. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  23. Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
  24. Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
  25. Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824(2018).
  26. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
  27. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66(2021).
  28. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77(2016).
  29. Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
  30. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  31. Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307(2020).
  32. Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72(2016).
  33. Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
  34. Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
  35. Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
  36. Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
  37. Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NuTRAPINTACT

Похожие статьи