Здесь мы описываем метод обнаружения в режиме реального времени продукции апопластических активных форм кислорода (АФК) в тканях риса в иммунном ответе, вызванном патогенным молекулярным паттерном. Этот метод прост, стандартизирован и дает высоковоспроизводимые результаты в контролируемых условиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение продукции активных форм кислорода в иммунном ответе риса в режиме реального времени с помощью хемилюминесцентного анализа
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Активные формы кислорода (АФК) играют жизненно важную роль в различных биологических процессах, включая обнаружение абиотических и биотических стрессов. При заражении патогеном или контакте с химическими веществами, связанными с патогенами (патоген-ассоциированные молекулярные паттерны [PAMP]), в растениях быстро индуцируется множество иммунных реакций, включая взрыв АФК, что называется иммунитетом, вызванным PAMP (PTI). Всплеск АФК является отличительной реакцией PTI, которая катализируется группой локализованных в плазматической мембране НАДФН-оксидаз - белков семейства RBOH. Подавляющее большинство АФК содержит перекись водорода (H2O2), которая может быть легко и стабильно обнаружена методом хемилюминесценции на основе люминола. Хемилюминесценция представляет собой реакцию, продуцирующую фотоны, в которой люминол или его производное (например, L-012) подвергается окислительно-восстановительной реакции с АФК под действием катализатора. В этой статье описывается оптимизированный метод хемилюминесценции на основе L-012 для обнаружения продукции апопласта АФК в режиме реального времени при выявлении PAMP в тканях риса. Метод прост, устойчив, стандартизирован и легко воспроизводим в строго контролируемых условиях.
Введение
Активные формы кислорода (АФК) включают ряд химически активных производных кислорода, включая супероксидные анионные радикалы (O2-) и его производные, гидроксильные радикалы (OH-), перекись водорода и продукты синглетного кислорода или окислительно-восстановительных реакций, которые постоянно образуются в пластидах и хлоропластах, митохондриях, пероксисомах и других субклеточных участках 1 . АФК играют важную роль во многих биологических процессах и необходимы для всех растений 2,3,4. Широкий спект....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол применим к различным тканям растений. Рисовая оболочка и листовые диски использовались в этом протоколе для обнаружения АФК при выявлении PAMP. Поскольку различия возникают главным образом из-за метода отбора проб, ниже описываются только общие процедуры, при этом при необходимости упоминаются конкретные шаги.
1. Растительная культура
- Стерилизуйте очищенные от шелухи семена риса 70% этанолом в течение 1 мин, затем 40% гипохлоритом натрия (NaClO) в течение 1 ч. Затем промойте семена 5 раз стерильной водой, чтобы удалить остатки хлора.
- Положите семена асептически на среду 1/2 мс (2,37 ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы берем рисовый материал в качестве примера для определения АФК, полученных при обработке flg22. Генерация АФК после выявления является преходящей. В рисе увеличение продукции АФК было впервые обнаружено через 1-2 мин, достигло пика через 10-12 мин и вернулось к исходному уровню через ~ 30-35 мин (рис. 3). По сравнению с контрольным тестом, в котором PAMP отсутствовал в растворе для стимуляции, что приводило к отсутствию очевидной индукции АФК, специфический всплеск АФК индуцировался .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Цель этого исследования состояла в том, чтобы создать высокоэффективный метод количественной оценки ранней продукции АФК в ответ на ПАМП в тканях риса. Этот метод обеспечивает стандартизированную процедуру определения в режиме реального времени апопластных АФК, полученных из обработанных рисовых тканей. Этот способ прост в эксплуатации, недорог, понятен по составу и не зависит от коммерческих комплектов. Используя этот метод, исследователи могут изучать производство апопласта АФК в режиме реального времени, когда растени.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Шанхайского фонда естественных наук (номер гранта: 21ZR1429300 / BS1500016), Шанхайского университета Цзяотун (программа Agri-X, номер гранта: AF1500088/002), Шанхайского совместного инновационного центра сельскохозяйственных семян (номер гранта: ZXWH2150201/001) для Цзянбо Фана и Проекта сотрудничества в области медицины и инженерии Шанхайского университета Цзяотун (номер гранта: 21X010301734) для Кан Ли.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 96-луночный планшет для микротитрования | WHB WHB-96-01 | ||
| абсолютный этанол | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | программное обеспечение | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-амино-5-хлор-7-фенил-2,3-дигидропиридо [3,4-d] пиридазин-1,4-дион, CAS #:143556-24-5 |
| Микропланшетный ридер | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Аладдин | S101636 | |
| Пероксидаза из хрена (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Сахароза | Сангон Биотех | A502792 | |
| Трис | Сангон Биотех | A610195 |
Ссылки
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R. ROS are good. Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
