Здесь представлен протокол инициирования, поддержания и анализа культур гемопоэтических стволовых клеток мыши с использованием экспансии на основе поливинилового спирта ex vivo , а также методы генетического манипулирования ими с помощью лентивирусной трансдукции и электропорации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ex Vivo Экспансия и генетические манипуляции с гемопоэтическими стволовыми клетками мыши в культурах на основе поливинилового спирта
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Самообновляющиеся мультипотентные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) являются важным типом клеток из-за их способности поддерживать кроветворение на протяжении всей жизни и восстанавливать всю систему крови после трансплантации. ГСК клинически используются в терапии трансплантации стволовых клеток, которая представляет собой лечебное лечение целого ряда заболеваний крови. Существует значительный интерес как к пониманию механизмов, регулирующих активность ГСК и кроветворение, так и к разработке новых методов лечения на основе ГСК. Тем не менее, стабильная культура и экспансия ГСК ex vivo были основным препятствием при изучении этих стволовых клеток в управляемой системе ex vivo . Недавно мы разработали культуральную систему на основе поливинилового спирта, которая может поддерживать долгосрочное и крупномасштабное распространение трансплантируемых ГСК мыши и методов их генетического редактирования. Этот протокол описывает методы культивирования и генетического манипулирования ГСК мыши с помощью электропорации и лентивирусной трансдукции. Ожидается, что этот протокол будет полезен широкому кругу экспериментальных гематологов, интересующихся биологией ГСК и кроветворением.
Введение
Кроветворная система поддерживает ряд важных процессов у млекопитающих, от снабжения кислородом до борьбы с патогенами, с помощью специализированных типов клеток крови и иммунных клеток. Непрерывная выработка крови (кроветворение) необходима для поддержания гомеостаза системы крови, который поддерживается гемопоэтическими стволовыми клетками и клетками-предшественниками (HSPC)1. Самой примитивной кроветворной клеткой является гемопоэтическая стволовая клетка (ГСК), обладающая уникальными способностями к самообновлению и многолинейной дифференцировке 2,3. Это редкая клеточная популяция, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры на животных, включая разведение и эвтаназию, должны выполняться в соответствии с институциональными и национальными рекомендациями. Эксперименты, подробно описанные ниже, были одобрены Министерством внутренних дел Великобритании. Список всех материалов, реагентов и оборудования, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .
1. Подготовка стоковых растворов
- Стоковый раствор ПВА
- Возьмите 50 мл качественной воды для культуры тканей в маленькую стеклянную бутылку (подходит для автоклавирования). Нагрейте воду почти до кипения в микроволновой печи.
- Взвесьте 5....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для очистки FACS ГСК мы ожидаем, что в костном мозге, обогащенном c-Kit, ~ 0,2% клеток составляют популяцию CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Lineage для молодых (8-12-недельных) мышей C57BL / 6 (рис. 1). Однако вполне вероятно, что трансгенные мыши или мыши разного возраста демонстрируют разные частоты ГСК. После 4 недель культивирования мы ожидаем, что фракция CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage-
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы надеемся, что этот протокол обеспечит полезный подход к изучению биологии ГСК, кроветворения и гематологии в целом. С момента первоначальной разработки метода культивирования на основе ПВА для FACS-очищенных ГСК8 этот метод был расширен. Например, было показано, что метод работает с c-Kit, обогащенным костным мозгом, и с отрицательно заряженными поверхностными пластинами14. Также была продемонстрирована его совместимость с трансдукцией и электропорацией.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов отсутствует конфликт интересов.
Благодарности
Мы благодарим Центр проточной цитометрии WIMM за доступ к проточной цитометрии и Центр скрининга вирусов WIMM за генерацию лентивирусного вектора. Эта работа финансировалась Фондом лейкемии Кей Кендалл и Советом по медицинским исследованиям Великобритании.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Гемоцитометр | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Первичная клетка 4D-нуклеофектор X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Пестик и ступка | Научные лабораторные принадлежности Limited | X18000 | |
| QuadroMACS сепаратор | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Материалы | |||
| 5 мл шприц | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μ m клеточный фильтр | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μ m клеточное сетчатое фильтр | Corning | 431751 | |
| салфетки Kimtech | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS колонка | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μ g | IDT | ||
| Фактор рекомбинантных стволовых клеток мышей без животного происхождения | Peprotech | AF-250-03 | |
| Животный рекомбинантный мышиный тромбопоэтин | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (клон: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (клон: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (клон: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Антимышиный CD127 биотин (клон: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Антимышиный CD150 PE/Cy7 (клон: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Антимышиный CD201 APC (клон: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Антимышиный CD34 FITC (клон: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Антимышиный CD4 APC/Cy7 (клон: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Антимышиный CD4 биотин (клон: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Антимышиный CD45R APC/Cy7 (клон: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Антимышиный CD45R биотин (клон: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Антимышиный CD48 BV421 (клон: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Антимышиный CD8 биотин (клон: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Антимышиный CD8a APC/Cy7 (клон: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Антимышиный Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (клон: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Антимышиный биотин Ly6G/Ly6C (клон: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Антимышиный Sca1 PE (клон: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Антимышиный Ter119 APC/Cy7 (клон: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Антимышиный биотин Ter119 (клон: TER-119) | Планшеты Biolegend | 116204 | |
| CellBIND, 24-луночные | Corning | 3337 | с отрицательной поверхностью заряженные |
| пластины CellBIND, 96-луночные | Corning | 3330 | отрицательная поверхность заряжена |
| на заказ синтетическая sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Индивидуальный заказ | |
| Фетальная бычья сыворотка | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Фибронектиновые пластины, 96-луночные | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Питательная смесь | Gibco | 11765054 | |
| инсулин-трансферрин-селен-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Фосфатный буферный раствор | Alfa Aesar | J61196. | |
| Поливиниловый спирт | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Стрептавидин APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Tü РКС решение | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
Ссылки
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
