Быстрое развитие схем идентификации состояния клеток с помощью политрансфекции

Summary

Сложные генетические схемы требуют много времени для проектирования, тестирования и оптимизации. Чтобы облегчить этот процесс, клетки млекопитающих трансфицируются таким образом, чтобы можно было тестировать несколько стехиометрий компонентов схемы в одной лунке. В этом протоколе описаны этапы планирования экспериментов, трансфекции и анализа данных.

Abstract

Генетические схемы млекопитающих продемонстрировали потенциал для обнаружения и лечения широкого спектра болезненных состояний, но оптимизация уровней компонентов цепи остается сложной и трудоемкой. Чтобы ускорить этот процесс, наша лаборатория разработала политрансфекцию, высокопроизводительное расширение традиционной трансфекции млекопитающих. При политрансфекции каждая клетка в трансфицированной популяции по существу выполняет свой эксперимент, проверяя поведение схемы при разных числах копий ДНК и позволяя пользователям анализировать большое количество стехиометрий в реакции с одним горшком. До сих пор были продемонстрированы политрансфекции, которые оптимизируют соотношения трехкомпонентных цепей в одной яме ячеек; В принципе, тот же метод можно использовать для разработки еще более крупных схем. Результаты политрансфекции могут быть легко применены для поиска оптимальных соотношений ДНК и котрансфекта для переходных цепей или для выбора уровней экспрессии компонентов схемы для генерации стабильных клеточных линий.

Здесь мы демонстрируем использование политрансфекции для оптимизации трехкомпонентной схемы. Протокол начинается с принципов экспериментального дизайна и объясняет, как политрансфекция основывается на традиционных методах совместной трансфекции. Далее проводится политрансфекция клеток с последующей проточной цитометрией через несколько дней. Наконец, данные анализируются путем изучения срезов данных одноклеточной проточной цитометрии, которые соответствуют подмножествам клеток с определенными соотношениями компонентов. В лаборатории политрансфекция использовалась для оптимизации клеточных классификаторов, контроллеров обратной связи и прямой связи, бистабильных мотивов и многого другого. Этот простой, но мощный метод ускоряет циклы проектирования сложных генетических схем в клетках млекопитающих.

Introduction

Область синтетической биологии млекопитающих быстро прогрессировала: от разработки простых частей восприятия и ответа в культивируемых клеточных линиях до оптимизации сложных сетей генов для решения реальных проблем в диагностике и терапии¹. Эти сложные схемы способны воспринимать биологические входы от профилей микроРНК до цитокинов и низкомолекулярных лекарств, а также реализовывать схемы логической обработки, включая транзисторы, полосовые фильтры, тумблеры и осцилляторы. Они также показали многообещающие результаты на животных моделях таких заболеваний, как рак, артрит, диабет и многих других 1,2,3,4,5.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Таблицы 1 и 2 служат важными ссылками для этого протокола. В таблице 1 показано масштабирование реагентов для реакций, а в таблице 2 показана арифметика соотношения ДНК для примера политрансфекции, описанной в протоколе (верхняя половина), и для возможного последующего эксперимента (нижняя половина).

1. Подготовка клеток к трансфекции

1. Перед началом протокола убедитесь, что культура эмбриональных клеток почек человека (HEK293) сливается на 60-80%. Для этого за 2 дня до этого высевают 1 x 10⁶ клеток в чашку Петри для культуры ....

Results

На рисунке 1 мы сравниваем котрансфекцию с политрансфекцией. При совместной трансфекции все плазмиды доставляются в одну и ту же смесь для трансфекции, что приводит к высокой корреляции между количеством каждой плазмиды, получаемой любой отдельной клеткой (рис. 1A). В то время как количество общих плазмид, доставляемых в каждую клетку, значительно варьируется, флуоресценция двух репортерных белков в отдельных клетках по всей популяции хорошо коррелирует, что ука.......

Discussion

Методы быстрого прототипирования, такие как автоматизированное проектирование (САПР), макетирование и 3D-печать, произвели революцию в механических, электрических и гражданских инженерных дисциплинах. Возможность быстрого поиска среди множества возможных решений данной проблемы значительно ускоряет прогресс в области. Мы считаем, что политрансфекция является аналогичной технологией биологической инженерии, позволяющей быстро создавать прототипы генетических цепей. Кроме того, другие технологии быстрого прототипирования т.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 мл Corning Falcon конические пробирки	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-луночная чашка Петри	Любая компания по выбору		(Непирогенный, стерильный, РНКаза, ДНКаза, ДНК и пироген)
Бычий сывороточный альбумин	NEB	B9000S
Центрифуга	Любая компания по выбору		Способна подвергать 15 мл пробирок Falcon воздействию 300 rcf
Countess 3 Автоматизированный счетчик клеток	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Камера подсчета клеток Countess Слайды	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Некоммерческий пакет программного обеспечения		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Используйте подходящий фильтрующий материал для вашего типа ячейки
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Фетальная бычья сыворотка	Sigma Aldrich	F4135
HEK клетки	ATCC	CRL-1573	Используйте соответствующий тип клеток для ваших экспериментов. Клетки HEK имеют тенденцию к очень эффективной трансфекции.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Используйте соответствующий тип клеток для ваших экспериментов.
Усилитель липофектамина 3000 и P3000	ThermoFisher Scientific	L3000001	Используйте реагент, подходящий для вашего типа клеток; реагент для трансфекции и энхансера
LSRFortessa проточный цитометр	BD Biosciences	N/a
MEM Раствор заменимых аминокислот	Gibco	11140050
микроцентрифужные пробирки, 1,5 мл	Любая компания по выбору
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	восстановленная сыворотка среда
фосфат буферный физиологический раствор	ThermoFisher Scientific	70011044
Радужные калибровочные бусины	Spherotech	URCP-100-2H
Азид	натрия Sigma Aldrich	S2002
Трипсин	VWR	25-053-CI