Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Синтез гидрогелей внеклеточного матрикса децеллюляризованного хряща

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64797

⸱

21 июля 2023 г.

 ,  , 
1Department of Orthopedics Surgery, Tongde Hospital of Zhejiang Province

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе представлен новый метод синтеза гидрогелей децеллюляризованного хрящевого внеклеточного матрикса (DC-ECM). Гидрогели DC-ECM обладают отличной биосовместимостью и обеспечивают превосходное микроокружение для роста клеток. Поэтому они могут быть идеальными клеточными каркасами и системами биологической доставки.

Аннотация

Гидрогели децеллюляризованного хрящевого внеклеточного матрикса (DC-ECM) являются перспективными биоматериалами для тканевой инженерии и регенеративной медицины благодаря своей биосовместимости и способности имитировать естественные свойства тканей. Этот протокол направлен на получение гидрогелей DC-ECM, которые точно имитируют нативную ECM хрящевой ткани. Протокол включает в себя комбинацию физического и химического разрушения и ферментативного расщепления для удаления клеточного материала с сохранением структуры и состава ECM. DC-ECM сшивается с помощью химического агента с образованием стабильного и биологически активного гидрогеля. Гидрогель DC-ECM обладает отличной биологической активностью, пространственной структурой и функцией биологической индукции, а также низкой иммуногенностью. Эти характеристики полезны для стимулирования клеточной адгезии, пролиферации, дифференцировки и миграции, а также для создания превосходной микросреды для роста клеток. Этот протокол является ценным ресурсом для исследователей и клиницистов в области тканевой инженерии. Биомиметические гидрогели потенциально могут способствовать разработке эффективных стратегий тканевой инженерии для восстановления и регенерации хряща.

Введение

Инженерия хрящевой ткани является быстро развивающейся областью, направленной на регенерацию поврежденной или больной хрящевой ткани1. Одной из ключевых задач в этой области является разработка биомиметических каркасов, которые могут поддерживать рост и дифференцировку хондроцитов, клеток, ответственных за производство хряща. ВКМ хрящевой ткани играет важнейшую роль в регуляции поведения хондроцитов. DC-ECM является эффективным каркасом для применения в тканевой инженерии3.

Для получения DC-ECM из хрящевой ткани был разработан ряд методов, включая химический, ферментативный и физический методы. Однако эти методы часто приводят к получению гидрогелей ECM, которые недостаточно биомиметичны, что ограничивает их потенциал для использования в тканевой инженерии 4,5. Таким образом, возникает необходимость в более эффективном способе получения гидрогелей DC-ECM.

Разработка этого метода важна, потому что он может продвинуть вперед область тканевой инженерии, обеспечивая новый подход к созданию биомиметических каркасов, которые могут поддерживать регенерацию и восстановление тканей. Кроме того, эта технология может быть легко адаптирована для производства гидрогелей ECM из других тканей, тем самым расширяя возможности ее применения.

В более широкой литературе наблюдается растущий интерес к использованию DC-ECM в качестве каркаса для приложений тканевойинженерии 6. Многочисленные исследования продемонстрировали эффективность гидрогелей DC-ECM в стимулировании роста и дифференцировки клеток в различных тканях, включая хрящ 7,8. Поэтому разработка протокола получения гидрогелей DC-ECM, которые точно имитируют естественную ECM хрящевой ткани, является значительным вкладом в эту область.

Протокол, представленный в этой статье, удовлетворяет эту потребность, предоставляя новый метод получения гидрогелей DC-ECM, которые точно имитируют естественную ECM хрящевой ткани. Протокол включает в себя децеллюляризацию хрящевой ткани, выделение полученной ВКМ и создание гидрогеля путем сшивания ВКМ биосовместимым полимером. Полученный гидрогель показал многообещающие результаты в поддержке роста и дифференцировки хондроцитов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было одобрено Комитетом по этике больницы Тундэ провинции Чжэцзян.

1. Приготовление гидрогеля DC-ECM

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании хрящ был получен из коленных суставов 12-месячных миниатюрных свиней породы Бама, избегая скопления костной ткани.

  1. Возьмите собранный хрящ, заблокируйте и разрежьте скальпелем на3 части размером 1-2 мм.
  2. Поместите 20 г измельченного хряща в центрифужную пробирку объемом 50 мл и добавьте 20 мл гипотонического буфера Tris-HCl (10 мМ Tris-HCl, pH 8,0), чтобы полностью погрузить ткань. Поместите центрифужную пробирку в морозильную камеру с температурой −80 °C на 3 часа, а затем в духовку с температурой 37 °C на 3 часа. Повторите этап замораживания и нагрева шесть раз. На этом этапе гипотонический буфер Tris-HCl не нуждается в замене.
  3. Встряхните центрифужную пробирку в течение 30 секунд с помощью вихревого смесителя со скоростью 1 000 об/мин. Поместите сито из нержавеющей стали (размер пор: ~250 мкм) на новую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
  4. Медленно сцедите децеллюляризованный хрящ в сито из нержавеющей стали, трижды промойте ткань стерильным PBS и соберите хрящ.
  5. Добавьте 10 мл раствора трипсина (0,25% трипсина в PBS) и поместите пробирку в шейкер при температуре 37 °C на 24 часа. В течение этого периода заменяйте трипсин каждые 4 ч. Отфильтруйте суспензию с помощью сита из нержавеющей стали и сохраните ткань. Трипсин можно обрабатывать в течение ночи во время одного из процессов пищеварения, и это не повлияет на окончательное пищеварение.
  6. Трипсинизированную ткань промывают гипертоническим буфером (1,5 М NaCl, 50 мМ Tris-HCl, рН 7,6).
  7. Добавьте 10 мл раствора нуклеазы (50 ед/мл дезоксирибонуклеазы и 1 ед/мл рибонуклеазы в 10 мМ Tris-HCl, рН 7,5) и поместите пробирку в шейкер при температуре 37 °C на 4 ч.
  8. Удалить раствор нуклеазы, трижды промыть хрящ стерильным ПБС и добавить гипотонический раствор Tris-HCl. Поместите центрифужную пробирку на шейкер и промывайте в течение 20 ч при комнатной температуре (RT).
  9. Гипотонический раствор Tris-HCl удалить, трижды промыть хрящ стерильным PBS и добавить 1% раствор Triton X-100, чтобы погрузить ткань на 24 ч.
  10. Удалите раствор Triton X-100 и тщательно промойте децеллюляризованный хрящ дистиллированной водой в течение 3 дней, меняя дистиллированную воду каждые 12 ч.
  11. Замочите хрящ в растворе надуксусной кислоты (0,1% ПАА в 4% этаноле) на 4 ч. Удалите раствор надуксусной кислоты и трижды промойте хрящ стерильной дистиллированной водой.
  12. Поместите сито из нержавеющей стали (размер пор: ~250 мкм) на центрифужную пробирку объемом 50 мл. Медленно сцедите децеллюляризованный хрящ в сито из нержавеющей стали и соберите хрящ. Проверьте степень децеллюляризации и удержания матрикса хряща, оценив содержание ДНК, коллагена и гликозаминогликанов (ГАГ).
  13. Поместите децеллюляризованный хрящ в чашу для измельчения, добавьте жидкий азот и измельчите децеллюляризованный хрящ до образования порошка. Возьмите 2 г децеллюляризованного хрящевого порошка, добавьте 80 мл 0,5 М уксусной кислоты и 20 мг пепсина и переваривайте в течение 24 ч. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин; выбросьте осадок и соберите раствор надосадочной жидкости (раствор DC-ECM).
  14. Декантировать 1 мл раствора DC-ECM на лунку в 6-луночные планшеты. Поместите 6-луночные планшеты в лиофилизатор. Заморозьте решение DC-ECM. Как только температура в сублимационной сушилке упадет до −40 °C, включите вакуумный насос и поддерживайте степень вакуума на уровне 10 Па в течение 22 часов.
  15. Выньте лиофилизированный раствор DC-ECM, поместите его в центрифужные пробирки и храните при температуре −20 °C. Минимальный срок хранения сублимированного раствора DC-ECM превышает полгода.
  16. Добавьте 1 мл стерильной дистиллированной воды, чтобы растворить 20 мг лиофилизированного раствора DC-ECM в центрифужной пробирке. Встряхивайте в течение 1 мин с помощью вихревого миксера со скоростью 1 000 об/мин при RT. Добавьте 1 мг витамина B2 (0,1% по массе) в раствор DC-ECM, инкубируйте при 37 °C в течение 60 мин и облучайте ультрафиолетовым светом (370 нм, 3,5 мВт/см2) в течение 3 мин с образованием гидрогеля (гидрогель DC-ECM).

2. Обнаружение децеллюляризованного хряща

  1. Определение содержания ДНК децеллюляризованного хряща
    ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките ДНК с помощью набора крови и тканей DNEasy.
    1. Сначала возьмите 20 мг хряща DC-ECM в центрифужной пробирке. Добавьте 180 мкл буферного GTL и 20 мкл протеиназы K путем вихревых колебаний и инкубируйте хрящ при 56 °C в течение 4 ч до полного растворения.
    2. Встряхивайте центрифужную пробирку в течение 15 с с помощью вихревой мешалки со скоростью 1 000 об/мин при RT. Затем добавьте 200 мкл буфера GL и безводного этанола и тщательно перемешайте вихревой вибрацией. Центрифугируют образцы в течение 1 мин со скоростью 6 000 x g при 4 °C.
    3. Добавьте 500 мкл буфера GW1 в адсорбционную колонну и центрифугируйте образцы в течение 1 мин со скоростью 12 000 x g при 4 °C. Добавьте 500 мкл буфера GW2 в адсорбционную колонку и центрифугируйте при 20 000 x g при 4 °C в течение 1 минуты. Наконец, добавьте 50 мкл стерилизованной воды в адсорбционную колонку и центрифугируйте в течение 1 мин со скоростью 6 000 x g при 4 °C для сбора раствора ДНК. Определите содержание ДНК с помощью спектрофотометра.
  2. Определение содержания коллагена в децеллюляризованном хряще
    1. Чтобы определить содержание коллагена в децеллюляризованном хряще, используйте гидроксипролин в качестве аминокислотного маркера коллагена. Подкислить 5 мг децеллюляризованного хряща 5 мл 6 М соляной кислоты при 100 °С в течение 20 мин, а затем нейтрализовать 5 мл 6 М раствора гидроксида натрия.
    2. Рассчитайте содержание гидроксипролина, измерив абсорбцию образца при длине волны 570 нм с помощью спектрофотометра. Получить концентрационно-абсорбционную линейную регрессию с использованием стандартного образца гидроксипролина.
  3. Определение содержания ГАГ в децеллюляризованном хряще
    ПРИМЕЧАНИЕ: Содержание ГАГ в хряще DC-ECM определяли с помощью тканевого колориметрического набора для количественного детектирования ГАГ. Все перечисленные ниже реагенты имеются в наборе.
    1. Возьмите 200 мг хрящевого порошка DC-ECM и добавьте 500 мкл реагента А путем вихревых колебаний. Инкубируют образец при 4 °C в течение 16 ч, а затем центрифугируют при 14 000 x g в течение 10 мин.
    2. Возьмите 50 мл раствора пробы и добавьте 50 мкл раствора с высоким содержанием соли (реагент В) и 50 мкл раствора кислоты (реагент С) путем вихревых колебаний. Инкубируют образец в течение 10 мин.
    3. Добавьте 750 мкл раствора красителя (реагент D) путем вихревых колебаний и инкубируйте образец в течение 30 мин в темных условиях. Центрифугу образца при 14 000 x g в течение 10 мин, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
    4. Добавьте 1 мкл чистящего раствора (реагент Е) и хорошо перемешайте. Центрифугируют образец при 14 000 x g в течение 10 мин и выбрасывают надосадочную жидкость.
    5. Добавьте к образцу 1 мкл раствора диссоциации (реагент F) и хорошо перемешайте. Инкубируйте образец в течение 30 мин в темных условиях. Наконец, определите содержание ГАГ с помощью спектрофотометра на длине волны 600 нм.
  4. Анализ децеллюляризованного хряща с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) и просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ)
    1. Сравните децеллюляризованный хрящ и нормальную хрящевую ткань. Образец помещают в 2,5%-ный раствор глутарового альдегида, инкубируют при 4 °C в течение ночи, а затем трижды промывают PBS.
    2. Закрепляют пробу в 1% OsO4 в течение 1 ч, а затем трижды промывают PBS.
    3. Обезвоживают образец путем последовательного погружения в 50%, 70%, 90% и 100% этанол, а также 100% ацетон в течение 15 мин каждый. Образец помещают в смешанный раствор гексаметилдиссилазана и этанола (1:1) на 15 мин с последующим погружением в чистый гексаметилдисилазан на 15 мин.
    4. Поместите образец в сушилку HCP-2, а затем высушите с помощью жидкого азота. Затем полностью высохший образец покрыть тонким слоем золото-палладия с помощью напыления и получить изображение с помощью SEM. Нанесение покрытия методом напыления проводилось при мощности 120 Вт в течение 5 мин. Эксперимент проводился при следующих условиях: рабочее напряжение 15 кВ, степень вакуума ниже 5 х 10−5 Па.
    5. Для анализа ПЭМ помещают образец в смесь безводного ацетона и смолы (1:1) в течение 1 ч, а затем в смесь безводного ацетона и смолы (1:3) в течение 3 ч. Затем поместите образец в смолу на ночь.
      1. Поместите образец во вложенные капсулы со средним наполнением и нагревайте при 70 °C в течение 9 ч.
      2. После встраивания разрежьте образец на тонкие ломтики толщиной 70 нм с помощью ультратонкого микротома и поместите на медную сетку.
      3. Налейте пипетку 20 мкл раствора для окрашивания уранилацетата на медную сетку и окрашивайте в течение 15 мин при RT. Удалите раствор для окрашивания, осторожно дважды промыв сетку дистиллированной водой.
      4. Затем нанесите 20 мкл раствора для окрашивания цитрата свинца на медную сетку и окрашивайте в течение 15 минут при RT. Промойте сетку три раза дистиллированной водой.
      5. Поместите медную сетку на чистую чашку Петри, выстланную фильтровальной бумагой. После высыхания на воздухе сфотографируйте срезы с помощью ПЭМ. Зонд прикладывался с нисходящей силой 500 нН, сканировался с частотой 1 Гц и имел константу упругости (k-значение) 40 Нм-1. Радиус наконечника зонда был измерен равным 8 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы получить более совершенный гидрогель хряща DC-ECM, мы изучили и проанализировали предыдущую литературу и сравнили различные протоколы децеллюляризации с точки зрения коэффициента децеллюляризации, иммуногенности и механической функциональности9.

На этой основе мы получили гидрогель хряща DC-ECM и исследовали влияние радиально-ориентированного экстрактивного матрикса/биочернил экзосомы мезенхимальных стволовых клеток на лечение костно-хрящевых дефектов. Результаты ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Данный протокол обеспечивает системный подход к получению децеллюляризованных хрящевых внеклеточных матриксных гидрогелей, которые точно имитируют нативную ВКМ хрящевой ткани. Протокол включает в себя комбинацию физических, химических и ферментативных нарушений для удаления клеточного материала с сохранением структуры и состава ECM. Важнейшие этапы протокола включают в себя корректировку времени и методов децеллюляризации, а также обеспечение полной децеллюляризации.

По сравнению с другими сущ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была спонсирована Планом по медицине и технологиям здравоохранения провинции Чжэцзян (2019KY050), Научно-техническим планом традиционной китайской медицины провинции Чжэцзян (2019ZA026), Ключевым планом исследований и разработок в провинции Чжэцзян (грант No 2020C03043), Научно-техническим планом традиционной китайской медицины провинции Чжэцзян (2021ZQ021) и Фондом естественных наук провинции Чжэцзян Китая (LQ22H060007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 М Tris-HCl, pH7.6BeyotimeST776-100 мл
1 M Tris-HCl, pH8.0BeyotimeST780-500 мл-80
° C Морозильная камераEppendorfF440340034
дезоксирибонуклеазаАладдинD128600-80KU
DNEasy Blood & Набор для салфетокQiagenNo. 69506
GAG колориметрический набор для количественного обнаруженияShanghai HalingHL19236.2
HCP-2 сушилка HitachiN/A
Nanodrop8000Thermo FisherN/AСпектрофотометр
PBS (10x)Gibco70011044
RibonucleaseAladdinR341325-100 мг
Sigma500ZIESSN/AСканирующий электронный микроскоп
Spectra SThermo FisherN/AПросвечивающий электронный микроскоп
Сито из нержавеющей сталиSHXB-Z-1Shanghai Xinbu
Triton X-100BeyotimeP0096-500 мл
Trypsin Gibco15050065
Ультрафиолетовая лампаOmnicure 2000N/A
Витамин B2GibcoR4500-5G
Вихревой смесительShanghai Qiasen78HW-1 

Ссылки

  1. Vega, S. L., Kwon, M. Y., Burdick, J. A. Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering. European Cells & Materials. 33, 59-75 (2017).
  2. Yang, J., Zhang, Y. S., Yue, K., Khademhosseini, A. Cell-laden hydrogels for osteochondral and cartilage tissue engineering. Acta Biomaterialia. 57, 1-25 (2017).
  3. Bejleri, D., Davis, M. E. Decellularized extracellular matrix materials for cardiac repair and regeneration. Advanced Healthcare Materials. 8 (5), e1801217(2019).
  4. Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Y. K. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786(2022).
  5. Barbulescu, G. I., et al. Decellularized extracellular matrix scaffolds for cardiovascular tissue engineering: Current techniques and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (21), 13040(2022).
  6. Zhang, W., Du, A., Liu, S., Lv, M., Chen, S. Research progress in decellularized extracellular matrix-derived hydrogels. Regenerative Therapy. 18, 88-96 (2021).
  7. Zhu, W., et al. Cell-derived decellularized extracellular matrix scaffolds for articular cartilage repair. International Journal of Artificial Organs. 44 (4), 269-281 (2021).
  8. Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials for peripheral nerve repair and regeneration. Current Neuropharmacology. 19 (12), 2152-2163 (2021).
  9. Xia, C., et al. Decellularized cartilage as a prospective scaffold for cartilage repair. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 101, 588-595 (2019).
  10. Chen, P., et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).
  11. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  12. Yuan, X., et al. Stem cell delivery in tissue-specific hydrogel enabled meniscal repair in an orthotopic rat model. Biomaterials. 132, 59-71 (2017).
  13. Zheng, L., et al. Intensified stiffness and photodynamic provocation in a collagen-based composite hydrogel drive chondrogenesis. Advanced Science. 6 (16), 1900099(2019).
  14. Young, J. L., Holle, A. W., Spatz, J. P.Nanoscale and mechanical properties of the physiological cell-ECM microenvironment. Experimental Cell Research. 343 (1), 3-6 (2016).
  15. Abdolghafoorian, H., et al. Effect of heart valve decellularization on xenograft rejection. Experimental and Clinical Transplantation. 15 (3), 329-336 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Синтез гидрогелей внеклеточного матрикса децеллюляризованного хряща
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.