Методическая статья

Изучение метилирования аргинина белка: подходы и методы

DOI:

10.3791/64821

⸱

20 января 2023 г.

1Pharmacology and Toxicology and Structural Genomics Consortium, University of Toronto

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ОБСУЖДАЕМЫЕ СТАТЬИ:

Хатчинсон, А., Сеитова, А. Производство рекомбинантных белков PRMT с использованием векторной системы экспрессии бакуловируса. Журнал визуализированных экспериментов. (173), doi: 10.3791/62510 (2021).

Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. Протеомный подход на основе масс-спектрометрии для глобального анализа R-метилирования белка с высокой степенью достоверности. Журнал визуализированных экспериментов. (182), doi: 10.3791/62409 (2022).

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Исследование метилома аргинина с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Журнал визуализированных экспериментов. (178), doi: 10.3791/63245 (2021).

Шевчик, М. М., Ву, В., Барсайт-Лавджой, Д. Количественные методы изучения активности белка аргининметилтрансферазы 1-9 в клетках. Журнал визуализированных экспериментов. (174), doi: 10.3791/62418 (2021).

Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Анализ близкого лигирования позволяет обнаруживать, локализовать и количественно оценивать метилирование белка аргинина в фиксированной ткани. Журнал визуализированных экспериментов. (185), doi: 10.3791/64294 (2022).

Редакционная статья

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метилирование белка аргинина является посттрансляционной модификацией, которая участвует в регуляции широкого спектра биологических процессов 1,2,3. Девять членов семейства белковых аргининметилтрансфераз (PRMTs) могут метилировать аргинины монометиловым и диметил-симметричным или асимметричным образом. Понимание функциональных последствий и каталогизация метилированных субстратов PRMT значительно продвинули понимание ферментов PRMT и облегчили их связь с заболеванием2. Кроме того, разработка мощных и селективных ингибиторов позволила использовать химико-биологические подходы к изучению PRMT и ускорила клиническую разработку агентов-мишеней PRMT3. По мере развития области PRMT новые методы и их применение позволят еще больше пролить свет на регуляцию и биологию этих ферментов.

В этом сборнике методов статья о рекомбинантном производстве белков PRMT содержит подробный отчет о системе экспрессии на основе бакуловируса4. С использованием бактериальной экспрессии может быть получено несколько PRMT; однако более крупные или сложные зависимые PRMT, такие как PRMT7 или PRMT5, требуют системы экспрессии клеток насекомых. Этот метод уже принес пользу многочисленным исследованиям in vitro по определению субстратов PRMT.

Изучение субстратов PRMT в клеточной среде требует сложных подходов к обнаружению. В двух статьях этого сборника представлены различные методологии, основанные на обогащении антителами метилированных аргининов с последующим количественно-масс-спектрометрическим количественном определением или независимым от антител количественным определением с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Было разработано несколько антител, распознающих различные состояния метилирования, которые были использованы в исследованиях, идентифицирующих субстраты PRMT5. Метод масс-спектрометрии позволяет количественно оценить метилирование аргинина в клетках с помощью метаболического мечения, последующих сложных методов разделения и обогащения на основе антител6. Некоторые члены семейства PRMT предпочитают метилировать аргинины, которые обнаруживаются в повторяющихся мотивах RGG, находящихся в внутренне неупорядоченных областях белков7. Метод, основанный на ЯМР-спектроскопии, позволяет определить степень метилирования и положение всех производных аргинина (моно- и ди, симметричных и асимметричных), где они могут быть надежно количественно определены в сложных биологических образцах8.

Наконец, для идентификации метилированных остатков аргинина в конкретных белках в двух статьях представлены подходы, основанные на вестерн-блоттинге и анализе бесконтактного лигирования (PLA). Оба этих метода используют обнаружение на основе антител, но различаются по методу обнаружения и предоставляемой информации. Метод вестерн-блоттинга является количественным и оказался ценным для определения характеристик химических зондов9. PLA предоставляет информацию о пространственном расположении метилированного аргинина, поскольку он использует антитело-мишень белка и генерическое антитело для моно- или ди-метиларгинина, тем самым обходя необходимость получения специфических антител и может быть использован на фиксированных тканях.

В совокупности эти разнообразные методологии позволят надежно обнаружить метилированные аргинины в различных клеточных системах и заболеваниях, а также еще больше углубят фундаментальные знания о биологической функции ферментов PRMT.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.B.L. поддерживается Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC). Консорциум структурной геномики — это зарегистрированная благотворительная организация (No 1097737), которая получает средства от Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Bristol Myers Squibb, Genentech, Genome Canada через Институт геномики Онтарио [OGI-196], совместное предприятие EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 [грант EUbOPEN 875510], Janssen, Merck KGaA (также известная как EMD в Канаде и США), Pfizer и Takeda.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Wu, Q., Schapira, M., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D. Protein arginine methylation: from enigmatic functions to therapeutic targeting. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (7), 509-530 (2021).
  4. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant PRMT proteins using the baculovirus expression vector system. Journal of Visualized Experiments. (173), e62510(2021).
  5. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Scientific Reports. 3, 1311(2013).
  6. Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein R-methylation analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e62409(2022).
  7. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  8. Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the arginine methylome by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63245(2021).
  9. Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative methods to study protein arginine methyltransferase 1-9 activity in cells. Journal of Visualized Experiments. (174), e62418(2021).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. Journal of Visualized Experiments. (185), e64294(2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Recombinant PRMT ProteinsBaculovirus Expression VectorMass SpectrometryProteomics ApproachProtein R methylation AnalysisArginine MethylomeNuclear Magnetic Resonance SpectroscopyProtein Arginine Methyltransferase ActivityProximity Ligation AssayProtein DetectionTissue Quantification

Похожие статьи