$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Благодаря значительному повышению чувствительности, скорости и универсальности, современная масс-спектрометрия (МС) предоставляет исследователям более широкие возможности для определения характеристик протеома. С улучшением технологий исследователи требуют более строгого уровня в своих результатах. Таким образом, не менее важное значение для рабочего процесса протеомики имеют инновационные стратегии пробоподготовки, разработанные для выделения, разделения и обработки сложных протеомных смесей перед РС. Химическое разнообразие протеомных систем исключает универсальный подход к подготовке образцов. Однако, как видно из этой коллекции методов, доступно несколько протоколов для максимального повышения качества и достоверности данных MS. Цель этой коллекции — предоставить исследователям простые в реализации инструменты и приемы, предназначенные для улучшения ожидаемых результатов протеомных и метаболомных рабочих процессов.
Капиллярные колонки ВЭЖХ и УЭЖХ практически повсеместно используются в комплексных рабочих процессах протеомики. В то время как самостоятельно упаковывающиеся капиллярные колонки являются недорогой альтернативой коммерческим колонкам, те, кто пытался упаковать свои собственные колонки, могут быть знакомы с непостоянными нормами упаковки и переменным качеством колонок. Ковальчук и его коллеги из Российской академии наук демонстрируют свой подход FlashPack для обеспечения эффективной и последовательной упаковки капиллярных колонок UPLC1. Комбинация точно контролируемых переменных снижает образование вагранки на входе в капилляр и позволяет быстро заполнять колонну с помощью набивочной бомбы низкого давления.
Иммунопептидомика — это новая дисциплина протеомики, имеющая клиническое применение в онкологии и иммунной терапии. Надежный анализ МС требует выделения МНС класса I/II, или пептидных лигандов человеческого лейкоцитарного антигена (HLA). Чтобы улучшить воспроизводимость этого протокола изоляции, Сируа и его коллеги из Монреальского университета демонстрируют маломасштабный процесс аффинного захвата на основе гранул, а также ожидаемые результаты РС восстановленного иммунопептидома2.
Чтобы еще больше повысить точность данных протеомики и облегчить высокопроизводительную обработку большого количества образцов, исследователи все чаще обращаются к роботизированным платформам для автоматизации этапов обработки образцов. Доступна недорогая роботизированная платформа, хотя она требует от пользователя программирования желаемых шагов манипуляции, что может стать препятствием для использования этого устройства. Хан и др. из Университета Колорадо в медицинском кампусе Аншутц разработали простой пакет кодирования с открытым исходным кодом и демонстрируют основные шаги, связанные с перевариванием белка на роботизированной платформе Opentrons OT-23.
Поверхностно-активные вещества, такие как SDS, обычно используются для облегчения клеточной экстракции и солюбилизации протеома перед РС. Однако удаление паспорта безопасности может быть неполным или привести к потере образца. Никерсон и его коллеги из Университета Далхаузи демонстрируют одноразовый картридж для автоматизации процесса осаждения белка4. Комбинация соли и органического растворителя имеет решающее значение для максимального извлечения белка и может быть выполнена за минимальное время при высоких урожаях.
Метаболомика идет по стопам протеомного анализа, с растущей базой данных референсных спектров МС, используемой для идентификации неизвестных метаболитов в целевых и нецелевых рабочих процессах. Подобно протеомному анализу, спектральная идентификация подвержена ложноположительным совпадениям, и поэтому статистическая отчетность о частоте ложных открытий (FDR) имеет важное значение для фильтрации результатов с низкой достоверностью. Ли и его коллеги из Цзинаньского университета в партнерстве с компанией Chi-Biotech Co. создали веб-рабочий процесс на основе своей программы XY-Meta и создали целевую базу данныхметаболитов. Они демонстрируют шаги по созданию целевой базы данных и фильтрации метаболомных результатов на основе желаемого FDR.
Наконец, протокол выделения протеома одиночных клеток продемонстрирован Петельски и его коллегами из Северо-Восточного университета6. Протокол Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) позволяет исследователям количественно оценивать от сотен до тысяч белков в одном эксперименте, используя изобарический носитель для уменьшения потерь образца. Ключом к протоколу является быстрый этап термического циклирования для лизиса клеток, а также эффективное триптическое переваривание с использованием большего, чем обычно, количества фермента и изобарическое мечение метками TMT.
Несмотря на многолетний опыт работы в области протеомики, эта зрелая область просто эволюционировала для решения более сложных проблем. Способность обрабатывать большее количество образцов или меньшее количество материала с большей согласованностью и достоверностью выводимых данных продолжает стимулировать технологические инновации. Обмен идеями, связанными с химическими манипуляциями, инструментальными и информационными подходами, имеет важное значение для развития этой области. «Проблема» одного исследователя, возможно, уже была решена с помощью простого «совета или хитрости» для ее преодоления. Поэтому то, что существует так много уникальных стратегий для анализа протеома, является положительным знаком. Что касается тех проблем, которые остаются, вполне вероятно, что кто-то уже работает над возможным решением.