Настоящий протокол описывает методы оценки белков репарации повреждений ДНК в органоидах рака яичников пациента. Сюда включены комплексные методы нанесения покрытия и окрашивания, а также подробные и объективные процедуры количественной оценки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация белков репарации повреждений ДНК в органоидах рака яичников пациента с помощью иммунофлюоресцентных анализов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Иммунофлуоресценция является одним из наиболее широко используемых методов визуализации антигенов-мишеней с высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет точно идентифицировать и локализовать белки, гликаны и малые молекулы. Хотя этот метод хорошо зарекомендовал себя в двумерной (2D) культуре клеток, меньше известно о его использовании в трехмерных (3D) моделях клеток. Органоиды рака яичников представляют собой 3D-модели опухолей, которые повторяют клональную гетерогенность опухолевых клеток, микроокружение опухоли и взаимодействия между клетками и клеточным матриксом. Таким образом, они превосходят клеточные линии по оценке лекарственной чувствительности и функциональных биомаркеров. Таким образом, способность использовать иммунофлуоресценцию на органоидах первичного рака яичников чрезвычайно полезна для понимания биологии этого рака. В настоящем исследовании описывается метод иммунофлуоресценции для обнаружения белков репарации повреждений ДНК в высокодифференцированных серозных органоидах рака яичников (PDO). После воздействия ионизирующего излучения на ЗОП проводят иммунофлуоресценцию на интактных органоидах для оценки ядерных белков как очагов. Изображения собираются с помощью визуализации z-stack на конфокальной микроскопии и анализируются с помощью программного обеспечения для автоматического подсчета очагов. Описанные методы позволяют анализировать временную и специальную рекрутацию белков репарации повреждений ДНК и колокализацию этих белков с маркерами клеточного цикла.
Введение
Рак яичников является основной причиной смерти от гинекологических злокачественных новообразований. Большинство пациентов лечатся препаратами, повреждающими ДНК, такими как карбоплатин, а пациентам с гомологичными опухолями, дефицитными рекомбинационной репарацией (HRR), можно назначать ингибиторы поли (АДФ-рибозы) полимеразы (PARP) 1,2. Однако у большинства пациентов развивается резистентность к этим методам лечения, и они умирают в течение 5 лет после постановки диагноза. Нарушение регуляции ответа на повреждение ДНК (DDR) было связано с развитием рака яичников и резистентностью как к химиотерапии, так и к и....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Опухолевая ткань и асцит были получены после получения согласия пациента в рамках биорепозитория гинекологической онкологии, который был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) Вашингтонского университета в Сент-Луисе. Пациенты были включены, если у них была поздняя стадия серозного рака яичников высокой степени злокачественности (HGSOC). Все процедуры проводились при комнатной температуре на стенде, если не указано иное. Все реагенты готовили при комнатной температуре (если не указано иное) и хранили при температуре 4 °C.
1. Генерация органоидов
- Сгенерируйте органоиды в соответствии с ранее опублик....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Представленный протокол позволяет успешно окрашивать, визуализировать и количественно оценивать белки восстановления повреждений ядерной ДНК в органоидах. Этот метод использовался для окрашивания и оценки PDO как до, так и после облучения. PDO подвергались воздействию радиации 10 Гр и оценивались по следующим биомаркерам: ɣ-H2AX (рис. 1), маркер повреждения ДНК; RAD51 (рис. 2), маркер HRR; 53BP1 — маркер NHEJ; RPA, маркер репликационного стресса (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Реакция на повреждение ДНК играет неотъемлемую роль как в развитии рака яичников, так и в резистентности к химиотерапии. Поэтому необходимо глубокое понимание механизмов репарации ДНК. Здесь представлена методология изучения белков репарации повреждений ДНК в 3D-интактных органоидах. Разрабатывается воспроизводимый, надежный протокол с использованием отличительных антител для оценки повреждения ДНК, гомологичной рекомбинации, негомологичного соединения концов и репликационного стресса. Важно отметить, что эти методы пров.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Мы благодарны Павлу Лобачевскому, доктору философии, за руководство в создании этого протокола. Мы также хотели бы поблагодарить Медицинскую школу Вашингтонского университета на кафедре акушерства и гинекологии Сент-Луиса и отделение гинекологической онкологии, Стипендиальную программу декана Вашингтонского университета, Фонд группы гинекологической онкологии и Программу развития репродуктологов за поддержку этого проекта.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1x фосфатно-солевой буфер с кальцием и магнием (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x фосфатный буферизованный солевой раствор без кальция и магния (PBS) | Fisher Scientific | ||
| Антитело к Ant-53BP1 | BD Biosciences | 612522 | разбавлен до 1:500 в окрашивающем буфере |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | разведенный до 1:200 в окрашивающем буфере |
| Anti-Geminin Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | разведенный до 1:400 в окрашивающем буфере |
| Anti-RAD51 Anti-RAD51 Anti-bsp; | Abcam | ab133534 | разведенный до 1:1000 в окрашивающем буфере |
| Anti-yH2AX Anti-yH2AX Anti-yH2AX Anti-bsp; | Миллипор-Сигма | 05-636 | разведенный до 1:500 в окрашивающем буфере |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) антитело | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | разведенный до 1:200 в окрашивающем буфере |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | Центрифуга BP1605 100 | |
| ; Центрифуга Sorvall St 16R Thermo | Scientific | ||
| Конфокальный микроскоп, конфокальная система Leica SP5 DMI4000 | Leica | ||
| Конические трубки, 15 мл | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Автоматизированный счетчик клеток (машина для подсчета клеток) | Термо Научный | ||
| Камера для подсчета клеток графини Горки | Thermo Scientific | C10228 | |
| Чехол Слип | LA Цвета | Подойдет любой прозрачный лак для ногтей | |
| Cultrex RGF Экстракт базальной мембраны, тип 2 | НИР D Systems | 3533-010-02 | Возможно, можно было бы использовать Matrigel или другую матрицу BME |
| DAPI | Термо Научный | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes реагент, разбавленный в 1x PBS |
| Глицин | Fisher Scientific | ||
| JCountPro | JCountPro | Для доступа к программному обеспечению, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Микроцентрифужные пробирки | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Лак для ногтей | StatLab | SL102450 | |
| парафомральдегид (PFA), 2% | Электронная микроскопия Наук | 157-4 | Разбавить до 4% PFA в PBS++ для получения 2% PFA |
| Пермеабилизационный буфер | произведенный в лаборатории | , 0,2% X-100 Triton в PBS++ | |
| Наконечники для пипеток | Rainin | 17014382 | |
| Pipette | Rainin | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Буфер для окрашивания | Сделано в лаборатории | 0,5% BSA, 0,15% глицина, 0,1% X-100 Triton в PBS++ | |
| Система камерных горок Nunc Lab-Tek II компании Thermo Scientific | Термо Научный | 12-565-8 | |
| Тритон Х-100 | Сигма-Альдерих | ||
| Раствор трипанового синего, 0,4% | Thermo Scientific | ||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | рекомбинантный фермент |
| животного происхождения X-RAD 320 | Прецизионное рентгеновское облучение | Х-РАД320 |
Ссылки
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
