Методическая статья

Выделение и очистка микрососудистых и макрососудистых эндотелиальных клеток из образцов, полученных из легких

DOI:

10.3791/64885

⸱

3 февраля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical, Oral and Biotechnological Sciences, “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 2Center on Advanced Studies and Technology (CAST), “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 3Department of Medicine and Aging Sciences, University “G. d’Annunzio” of Chieti-Pescara, 4U.O. di Chirurgia Toracica e dei Trapianti di Polmone, Fondazione IRCCS Ca’ Granda - Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, 5Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano, 6Department of Pharmaceutical Sciences, Università degli Studi di Milano, 7Unit of Cell and Molecular Biology in Cardiovascular Diseases, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на сложную задачу, выделение эндотелиальных клеток легких имеет важное значение для исследований воспаления легких. В настоящем протоколе описана процедура выделения макрососудистых и микрососудистых эндотелиальных клеток с высоким выходом и высокой чистотой.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наличие клеток, выделенных из здоровых и больных тканей и органов, представляет собой ключевой элемент для подходов персонализированной медицины. Хотя биобанки могут предоставить широкую коллекцию первичных и иммортализированных клеток для биомедицинских исследований, они не покрывают все экспериментальные потребности, особенно те, которые связаны с конкретными заболеваниями или генотипами. Эндотелиальные клетки сосудов (ЭК) являются ключевыми компонентами иммунной воспалительной реакции и, таким образом, играют центральную роль в патогенезе различных заболеваний. Примечательно, что ЭК из разных сайтов демонстрируют разные биохимические и функциональные свойства, что делает наличие определенных типов ЭК (т. е. макрососудистых, микрососудистых, артериальных и венозных) необходимым для разработки надежных экспериментов. Здесь подробно проиллюстрированы простые процедуры получения высокопродуктивных, практически чистых макрососудистых и микрососудистых эндотелиальных клеток человека из легочной артерии и паренхимы легких. Эта методология может быть легко воспроизведена с относительно низкими затратами любой лабораторией для достижения независимости от коммерческих источников и получения фенотипов/генотипов ЕС, которые еще недоступны.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндотелий сосудов выстилает внутреннюю поверхность кровеносных сосудов. Он играет ключевую роль в регуляции свертываемости крови, сосудистого тонуса и иммунно-воспалительных реакций 1,2,3,4. Хотя культура эндотелиальных клеток (ЭК), выделенных из образцов человека, имеет важное значение для исследовательских целей, следует отметить, что ЭК из разных кровеносных сосудов (артерий, вен, капилляров) выполняют определенные функции. Они не могут быть полностью воспроизведены эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC), которые легко доступны и широко используются в исследованиях патофизиологии эндотелия сосудов 5,6. Например, микрососудистые эндотелиальные клетки легких человека (HLMVEC) играют ключевую роль в воспалении легких, контролируя рекрутирование и накопление лейкоцитов 4,7. Таким образом, экспериментальная установка, направленная на воспроизведение воспаления легких с высокой точностью, должна включать HLMVEC. С другой стороны, дисфункция ЭК может наблюдаться при нескольких патологиях; таким образом, ЭК от пациента имеют основополагающее значение для построения надежной модели заболевания in vitro. Например, выделение фрагментов ЭК из легочной артерии (ГПАЭК), рассеченных из эксплантированных легких людей, страдающих муковисцидозом (МВ), позволило выявить механизмы эндотелиальной дисфункции при этом заболевании 8,9.

Таким образом, протоколы, направленные на оптимизацию выделения ЭК из различных источников/органов, в том числе в болезненных состояниях, необходимы для предоставления исследователям ценных исследовательских инструментов, особенно когда эти инструменты не являются коммерчески доступными. Ранее сообщалось о протоколах изоляции HLMVEC и HPAEC 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Во всех случаях ферментативное переваривание образцов легких приводило к смешанным клеточным популяциям, которые очищали с использованием специальных селективных сред и сортировки клеток на основе магнитных шариков или цитометрических данных. Дальнейшая оптимизация этих протоколов должна быть направлена на решение двух основных проблем при выделении ЕС: (1) загрязнение клеток и тканей, которое должно быть решено при как можно более раннем прохождении культивирования, чтобы свести к минимуму репликативное старение ЭК20; и (2) низкий выход первичных изолятов ЕС.

В этом исследовании описывается новый протокол для выделения высокопроизводительных и высокочистых HLMVEC и HPAEC. Эта процедура может быть легко применима и дает практически чистые макрососудистые и микрососудистые ЭК за несколько шагов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было одобрено, и протокол соответствовал рекомендациям комитета по этике исследований на людях Университета Кьети-Пескара (#237_2018bis). На рисунке 1 показано выделение эндотелиальных клеток из сегментов (длиной 1-3 см) легочной паренхимы или легочной артерии у идентифицированных людей (с письменного согласия), перенесших торакальную операцию по различным причинам, таким как пневмоторакс или лобэктомия. В последнем случае хирурги также собрали сегмент легочной артерии. Примечательно, что хирурги были точно проинструктированы собирать образцы без рака. Представленный протокол был оптимизирован для получения максимально возможного выхода и чистоты.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Восстановление коллагеназы
    1. Растворите порошок коллагеназы в фосфатно-буферном физиологическом растворе без CaCl 2 и MgCl 2 (PBS-, см. Таблицу материалов) в концентрации2 мг / мл и отфильтруйте раствор с помощью порового фильтра 0,22 мкм.
    2. Приготовьте аликвоты объемом 5 мл и храните их при температуре -20 °C. Перед использованием разморозьте и разогрейте аликвоты до 37 °C.
  2. Покрытие пластин
    1. Для покрытия пластины пипеткой вводят 1,5% раствор желатина или 50 мкг/мл фибронектина (см. Таблицу материалов) в культуральную пластину (500 мкл достаточно, чтобы покрыть поверхность каждой лунки 6-луночной пластины) и инкубируют в течение 1 ч при 37 °C.
    2. После инкубации удалите излишки желатина и промойте лунки PBS−-. Аспирируйте PBS−− и дайте пластине высохнуть в стерильном колпаке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для восстановления желатина растворите порошок в воде до получения 1,5% раствора, затем автоклавируйте его и храните при температуре 4 ° C. Желатин при 1,5% не является жидким при 4 ° C; Поэтому перед нанесением покрытия на плиту его необходимо прогреть. В качестве альтернативы, для покрытия пластины можно использовать любой коммерческий раствор желатина, подходящий для клеточных культур.

2. Пробоподготовка

  1. Паренхима легких
    1. Вымойте собранные образцы, погрузив их в пробирку объемом 50 мл, содержащую PBS-.
    2. Переложите образцы в стерильную чашку Петри и вручную измельчите образец хирургическими ножницами (оптимальный размер: >2 см) на мелкие фрагменты размером около 3-4 мм каждый.
  2. Сегмент(ы) артерии
    1. Вымойте собранные образцы, погрузив их в пробирку объемом 50 мл, содержащую PBS-.
    2. Перенесите его в стерильную чашку Петри, не измельчая, так как фрагментация увеличит площадь поверхности поперечного сечения сегмента артерии, тем самым увеличивая возможность выделения не-EC.

3. Ферментативное пищеварение

  1. Дважды промойте нарезанную кубиками паренхиму легких или сегмент (сегменты) легочной артерии с помощью PBS-. Этот шаг удалит большую часть остаточной крови.
  2. Поместите образцы в пробирки объемом 15 мл и инкубируйте с 5 мл коллагеназы типа 2 (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 37 ° C и 5% CO2. Во время этой инкубации деградация внеклеточного матрикса высвобождает отдельные клетки и клеточные агрегаты.

4. Восстановление переваренных клеток

  1. Поместите стерильное ситечко из стали/металла (т. е. ситечко для чая с размером ячеек ~ 1 мм) в верхнюю часть пробирки для сбора объемом 50 мл.
  2. Вылейте все содержимое из пробирки объемом 15 мл на ситечко, аккуратно помассируйте переваренную ткань шпателем и промойте образец PBS-− до тех пор, пока пробирка для сбора не будет заполнена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг устранит крупные фрагменты тканей в миллиметровом масштабе, обеспечивая большую эффективность последующих этапов фильтрации.

5. Удаление без EC путем фильтрации

  1. Отфильтруйте отток, собранный на шаге 4.2, с помощью клеточного сетчатого фильтра с размером ячеек 70 мкм и соберите отток в свежую пробирку объемом 50 мл.
  2. Затем используйте клеточный фильтр с размером ячеек 40 мкм и соберите отток в свежую пробирку объемом 50 мл. Пометьте эту трубку как «трубка 1».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти фильтрации на шагах 5.1 и 5.2 удаляют крупные клеточные агрегаты, которые часто состоят из смешанных клеточных популяций.

6. Седиментация клеточных кластеров и засев клеток

  1. Центрифугируют образцы при 30 x g в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы осаждать кластеры клеток.
  2. Осторожно извлеките надосадочную жидкость с помощью стерильной пипетки (не наливайте) и поместите ее в свежую пробирку объемом 50 мл («пробирка 2»).
  3. Суспендируйте гранулы в «пробирке 1» и заполните пробирку до 50 мл PBS-−. Заполните «пробирку 2» до 50 мл PBS−.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, обе трубки обрабатываются одинаково.
  4. Центрифугируют образцы при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Суспендируйте гранулы с 2 мл питательной среды (см. Таблицу материалов) и засейте суспензию в две отдельные лунки предварительно покрытой 6-луночной пластины (шаг 1.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, кормите клетки питательной средой каждые 2 дня до тех пор, пока они не достигнут слияния (примерно 1 неделя, в зависимости от размера выборки), чтобы получить разумное количество клеток для сортировки.

7. Расширение ячеек

  1. Промойте клетки 2 мл PBS с CaCl 2 и MgCl2 (PBS++, см. Таблицу материалов), чтобы удалить остаточные клетки крови (использование PBS++ важно для предотвращения отслоения клеток).
  2. Удалите PBS++ и добавьте свежую питательную среду.
  3. Повторяйте шаги 7.1 и 7.2 до тех пор, пока ячейки не достигнут слияния (примерно 1 неделя, в зависимости от размера выборки).

8. Сортировка ячеек

  1. Отделите клетки, используя 500 мкл трипсина-ЭДТА (0,05%, см. Таблицу материалов), центрифугу и ресуспендируйте гранулу 190 мкл PBS-.
  2. Добавьте 10 мкл флуоресцентного конъюгированного антитела CD31-FITC против человека (разведение 1:20, см. Таблицу материалов) и инкубируйте клеточную суспензию при 4 ° C в течение 30 мин.
  3. Промойте клетки, используя 10 мл PBS-, центрифугу при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре и ресуспендируйте гранулу в 300 мкл PBS-.
  4. Изолируйте и собирайте CD31-положительные (CD31+) клетки с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) с помощью сопла 100 мкм и собирайте их в пробирку.
    1. В соответствии со стратегией стробирования сначала определите морфологию клеток, используя параметры площади бокового рассеяния, SSC-A и FSC-A. Затем выберите отдельные ячейки, используя точечную диаграмму FSC-Area/FSC-Height или SSC-Area/SSC-Height, определите положительные ячейки в отмеченном образце по сравнению с неокрашенным контрольным образцом и направьте флуоресцентные ячейки в сборную пробирку21.
  5. Центрифугируют клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и суспендируют гранулу в 2 мл питательной среды для посева в предварительно покрытые лунки 6-луночной пластины.

9. Расширение постсортировки

  1. Через два дня после сортировки клеток замените кондиционированную среду свежей питательной средой.
  2. Повторяйте шаги 7.1 и 7.2 каждые 2 дня для расширения клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изоляция HLMEC
Основной проблемой при выделении HLMVEC является наличие загрязняющих клеток, поскольку микроскопические капилляры не могут быть легко отделены от стромальной ткани. Таким образом, достижение максимально возможной чистоты на самых ранних стадиях процесса выделения имеет решающее значение для уменьшения проходов культуры и, следовательно, старения клеток. Аналогичным образом, оптимальный протокол изоляции должен обеспечивать максимально возможный выход чистых HLMVEC. Для достижения этих ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многочисленные роли, которые играют сосудистые эндотелиальные клетки в патофизиологии человека, делают эти клетки незаменимым инструментом для патогенетических и фармакологических исследований in vitro . Поскольку ЭК из разных сосудистых участков/органов проявляют специфические особенности и функции, наличие здоровых и больных ЭК из интересующего органа было бы идеальным для исследовательских целей. Например, HLMVEC необходимы для исследований воспаления легких; Таким образом, методология выделения этих клеток с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что исследование проводилось без каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана средствами Министерства университетов и исследований Италии (за исключением 60% 2021 и 2022 гг.) для R. P. и грантами Итальянского фонда муковисцидоза (FFC # 23/2014) и Министерства здравоохранения Италии (L548/93) для M. R.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% трипсин-ЭДТА 1XGIBCO25300-054Используется для отделения клеток от культуральных планшетов
Anti CD31 Anti, клон WM59DakoM0823Используется для окрашивания CD-31 в иммуноцитохимии. Используемое разведение: 1:50
Anti vWF AntibodyThermo Fisher ScientificMA5-14029Используется для окрашивания фактора фон Виллебранда в иммуноцитохимии. Рабочее разбавление: 1:100
Автоклавируемые хирургические ножницыЛюбыеИспользуются для измельчения образцов
Клеточные фильтры 40 & микро; mCorning431750Используется во время второй фильтрации
Ячейка фильтра 70 & микро; mCorning431751Использование во время первой фильтрации
коллагеназы,УортингтонаLS004177коллагеназы 2 типа, используемых для ферментативного переваривания. Рабочая концентрация: 2 мг/мл
Конъюгированное анти-CD31 антителоBD Biosciences555445Используется для сортировки клеток (разведение 1:20)
Dulbecco′ s Фосфатно-солевой буфер (PBS) с  CaCl2 и MgCl2Sigma-AldrichD8662Используется для промывки клеток перед сменой среды
Dulbecco′ s Фосфатно-солевой буфер (PBS) без CaCl2 и MgCl2Sigma-AldrichD8537Используется для промывания хирургических образцов и клеток перед трипсинизацией
Среда роста эндотелиальных клеток MVPromoCellC-22020Среда роста HLMVEC
ФибронектинSigma-AldrichF0895Фибронектин из плазмы человека, используемый для покрытия пластин. Рабочая концентрация: 50 & микро; г/мл
Желатин из свиной кожи, тип АSigma-AldrichG2500Используется для покрытия пластин
Тип А ЖелатинSigma-Aldrichg-2500Желатин из свиной кожи используется для покрытия пластин. Рабочая концентрация: 1,5%
2 типа

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
  2. Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
  3. Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
  4. Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
  5. Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183(2007).
  6. Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032(2012).
  7. Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
  8. Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
  9. Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
  10. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
  11. Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61(2016).
  12. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  13. Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
  14. Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
  15. Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23(2013).
  16. Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313(2020).
  17. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458(2019).
  18. Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253(2021).
  19. Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
  20. Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501(2017).
  21. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).
  22. Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310(2020).
  23. Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
  24. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
  25. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи