Методическая статья

Измерение диаметра сосудов сетчатки по изображениям флуоресцентной ангиографии мышей

DOI:

10.3791/64964

⸱

19 мая 2023 г.

 ,  , 
1Department of Physiology, Biomedical Center, Faculty of Medicine, University of Iceland, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сосудистая сеть сетчатки мыши особенно интересна для понимания механизмов формирования сосудистого рисунка. Этот протокол автоматически измеряет диаметр сосудов сетчатки мыши по изображениям глазного дна флуоресцентной ангиографии на фиксированном расстоянии от диска зрительного нерва.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важно изучить развитие сосудистой сети сетчатки при ретинопатиях, при которых аномальный рост сосудов может в конечном итоге привести к потере зрения. Мутации в гене фактора транскрипции, ассоциированного с микрофтальмией (Mitf), свидетельствуют о гипопигментации, микрофтальмии, дегенерации сетчатки и, в некоторых случаях, слепоте. Визуализация сетчатки мышей in vivo неинвазивными методами жизненно важна для исследования глаз. Однако, учитывая его небольшой размер, визуализация глазного дна мыши затруднена и может потребовать специализированных инструментов, обслуживания и обучения. В этом исследовании мы разработали уникальное программное обеспечение, позволяющее анализировать диаметр сосудов сетчатки у мышей с помощью автоматизированной программы, написанной в MATLAB. Фотографии глазного дна были получены с помощью коммерческой системы фундус-камер после внутрибрюшинного введения раствора флуоресцеиновой соли. Изображения были изменены для повышения контрастности, а программа MATLAB позволила автоматически извлекать средний диаметр сосуда на заданном расстоянии от диска зрительного нерва. Сосудистые изменения были изучены у мышей дикого типа и мышей с различными мутациями в гене Mitf путем анализа диаметра сосудов сетчатки. Разработанная здесь специально разработанная программа MATLAB практична, проста в использовании и позволяет исследователям удобно и надежно анализировать средний диаметр и средний общий диаметр, а также количество сосудов сосудистой сети сетчатки мыши.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возможно, наиболее исследованным сосудистым руслом в организме является сосудистая сеть сетчатки. Благодаря постоянно совершенствующейся технической сложности, сосудистая сеть сетчатки легко фотографируется у живых пациентов и используется во многих областях исследований1. Кроме того, сосудистая сеть сетчатки мыши в процессе разработки оказалась очень эффективной модельной системой для исследований фундаментальной биологии роста сосудов. Основной целью сосудистой сети сетчатки является обеспечение внутренней части сетчатки метаболической поддержкой через ламинарную капиллярную сеть, которая пронизывает нервную ткань2. Тем не менее, состояние сетчатки и, следовательно, любая дисфункция или атрофия могут оказывать существенное влияние как на бифуркации сосудистой сети сетчатки, так и на диаметр артерий, демонстрируя взаимодействие между клетками сетчатки и сосудистой сетью. Известно, что многочисленные заболевания глаз, включая ретинопатию недоношенных (РН), диабетическую ретинопатию (ДР), возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), глаукому и неоваскуляризацию роговицы, могут приводить к аномальному глазному ангиогенезу5. В случае сосудистой сети сетчатки на мышиных моделях дегенерации сетчатки часто наблюдаются изменения, сравнимые с теми, которые наблюдаются при сосудистых заболеваниях человека 6,7. Семейство супергена Myc, состоящее из фундаментальных транскрипционных факторов спираль-петля-спираль-молния, включает ген микрофтальмий-ассоциированного фактора транскрипции (Mitf), экспрессирующегося в пигментном эпителии сетчатки (RPE)8,9,10.

Было продемонстрировано, что многочисленные органы, включая глаза, ухо, иммунную систему, центральную нервную систему, почки, кости и кожу, регулируются Mitf 9,11,12,13. Мы обнаружили, что структура и функция RPE нарушаются у мышей, несущих различные мутации в гене Mintf, что приводит к некоторым случаям дегенерации сетчатки и, в конечном итоге, к потере зрения. Недавно было показано, что количество сосудов и диаметр сосудов существенно различаются между мутантными Mitf и мышами дикого типа14. Исследователи и врачи теперь могут точно количественно определять сосудистую сеть сетчатки in vivo благодаря разработкам в области визуализации сетчатки. С 1800-х годов исследователи и врачи воспользовались преимуществами визуализации сосудистой сети сетчатки, и флуоресцентная ангиография (ФА) показала как кровоток в сетчатке, так и деградацию гемато-ретинального барьера.

В этой статье показано, как анализировать диаметр сосудов сетчатки по изображениям FA мыши с помощью пользовательского кода, написанного в программном обеспечении MATLAB.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты были одобрены Исландским управлением по контролю за продуктами питания и ветеринарией (лицензия MAST No 2108002). Все исследования на животных проводились в соответствии с Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. В этом исследовании использовались самцы и самки мышей C57BL/6J и Mitfmi-vga9/+ . В качестве контроля использовали мышей C57BL/6J (n = 7). Дикие типы были коммерчески получены (см. Таблицу материалов), но все мутантные мыши (n = 7) были выведены и выращены в животноводческих помещениях в Биомедицинском центре Университета Исландии. В настоящем исследовании использовались 3-месячные животные; Однако протокол распространяется даже на животных в возрасте 1 месяца и старше.

1. Подготовка к эксперименту

  1. Приготовьте смесь для анестезии. Возьмите одну ампулу 2 мл стокового раствора кетамина (25 мг/мл) и 250 мкл стокового раствора ксилазина (2%) для приготовления рабочего раствора смеси кетамина/ксилазина (25 мг/мл кетамина и 20 мг/мл ксилазина) (см. Таблицу материалов).
  2. Обезболивайте мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина/ксилазина с объемом жидкости, который в четыре раза превышает массу тела мыши; Например, мышь весом 20 г требуется 35 мкл рабочего раствора ксилазин/кетамин для получения рабочей дозы смеси ксилазина (4 мг/кг массы тела) и кетамина (40 мг/кг массы тела).
  3. Расширяйте зрачки глазными каплями с 10% фенилэфрина гидрохлоридом и 1% тропикамидом сразу после анестезии.
  4. Подождите, пока животное полностью обезболится и его зрачки широко расширятся.
  5. Приготовьте раствор флуоресцеиновой соли. Добавьте 9 мл фосфатно-солевого буфера (PBS; 1x) к 1 мл раствора флуоресцеина (100 мг/мл исходной концентрации) (см. Таблицу материалов). Конечная концентрация рабочего раствора составляет 10 мг/мл.

2. Визуализация сосудистой сети сетчатки in vivo с помощью системы визуализации сетчатки грызунов

  1. Вводите рабочий раствор флуоресцеина внутрибрюшинно (5 мкл/г массы тела) животному, находящемуся под наркозом.
  2. Нанесите каплю 2% геля метилцеллюлозы на поверхность роговицы, а затем поместите животное на позиционную сцену системы визуализации (см. Таблицу материалов).
  3. Расположите объектив камеры для визуализации сетчатки так, чтобы он касался роговицы мыши прямо и осторожно. Чтобы расположить корешок зрительного нерва в центре поля зрения, слегка отрегулируйте выравнивание.
  4. Переключитесь на зеленый флуоресцентный канал на камере глазного дна.
  5. Сосредоточьтесь на сосудах сетчатки для получения изображений.
  6. Чтобы найти идеальную временную точку, сделайте несколько фотографий через 1, 3, 5 и 10 минут (но не дольше 10 минут) после инъекции флуоресцеина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение ФА должно быть завершено в течение 10 минут, так как по истечении этого времени флуоресцеин может стать слишком диффузным, и сосуды станут неразличимыми.
  7. По завершении визуализации, пока мышь еще находится под наркозом, усыпьте ее путем вывиха шейки матки.

3. Анализ диаметра сосуда сетчатки

  1. Откройте программу MATLAB (см. Таблицу материалов).
  2. Загрузите и сохраните код "fundusDiameter.m" (см. Файл дополнительного кодирования 1, Файл дополнительного кодирования 2 и Файл дополнительного кодирования 3).
  3. Откройте папку, в которой был сохранен код. Перетащите код и поместите его в текущую папку в MATLAB.
  4. Перетащите изображение FFA (изображение флуоресцентной ангиографии глазного дна) или изображения, которые вы хотите проанализировать, в текущую папку в MATLAB.
  5. Нажмите инструмент «Выполнить » на панели инструментов MATLAB.
  6. Появится всплывающее окно. Введите имя файла интересующего изображения в поле Введите имя файла и нажмите OK.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не изменяйте и не модифицируйте остальные параметры.
  7. Выберите центр диска зрительного нерва, а затем выберите край диска зрительного нерва. Теперь программное обеспечение вычисляет интенсивность пикселей на изображениях глазного дна мыши в круге с радиусом, который в два раза больше радиуса оптического диска, по часовой стрелке от центра оптического диска (рис. 1).
  8. Затем убедитесь, что программное обеспечение отображает средний диаметр сосуда (в пикселях) каждого сосуда на глазном дне в зависимости от номера сосуда (рисунок 2).
  9. После этого убедитесь, что программное обеспечение передает данные измерений для каждого судна в документ Excel, где вычисляются среднее, медиана и стандартное отклонение этих значений (Таблица 1 и Таблица 2).
  10. Переместите значения из таблицы результатов в программу для работы с электронными таблицами, выбрав все значения в таблице. Вставьте значения в таблицу.
  11. Построение графиков и выполнение статистического анализа с использованием данных, вставленных в выбранную программу для работы с электронными таблицами (см. Таблицу материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показан процесс, используемый для анализа сосудистой сети сетчатки, который наносится на изображения СЖК мышей от всех протестированных мышей. Радиус, который в два раза больше радиуса диска зрительного нерва, используется для измерения интенсивности пикселей в круговом направлении по часовой стрелке от центра диска зрительного нерва. Он помечает пиксели начальной или конечной точкой, когда встречает точки выше и ниже заданного пользователем порога соответственно. Это повторяетс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящей статье впервые представлен метод анализа диаметра сосудов сетчатки и сосудистой сети сетчатки по изображениям ФА мыши. Поскольку для получения изображений сосудистой сети сетчатки использовалась только визуализация глазного дна, метод имеет несколько недостатков, один из которых заключается в том, что можно сделать вывод об изменениях только в поверхностных слоях сосудистой сети сетчатки у мышей, обследованных в этом исследовании; Какие-либо различия в более глубоких слоях пока неизвестны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Postdoctoral Fellowship от Исландского исследовательского фонда (217796-052) (A.G.L.) и Мемориального фонда Хельги Йонсдоттир и Сигурлиди Кристьянссон (A.G.L и T.E.). Авторы благодарят профессора Эйрикура Стейнгримссона за предоставление мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1% Тропикамид (Мидриацил)Alcon Inc LaboratoriesМидриатический агент
2% MethocelOmniVision Eye CareГидроксипроприл метилцеллюлоза гель
C57BL/6JJackson Laboratory000664мыши дикого типа
Excel для Microsoft 365Microsoft IncПакет программного обеспечения
Флуоресцеин натриевая сольSigma-Aldrich28803-100GФлуоресцентная ангиография
Matlab 8.0The MathWorks, Inc.Программный комплекс
Micron IV Камера глазного дна для грызуновPhoenix-Micron40-2200Фотография глазного дна
Фенилэфрин 10% сBausch & LombMydriatic agent
Phosphate Buffered Salt - 100 таблетокGibco18912-014
Dilution Sigmaplot 13Jandel Scientific SoftwareПакет
программного обеспечения S-кетамин, 25 мг/мл PfizerInc.PAA104470Анестезия IP

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 89-107 (2017).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Ma, Y., et al. Quantitative analysis of retinal vessel attenuation in eyes with retinitis pigmentosa. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 4306-4314 (2012).
  4. Eysteinsson, T., Hardarson, S. H., Bragason, D., Stefansson, E. Retinal vessel oxygen saturation and vessel diameter in retinitis pigmentosa. Acta Ophthalmologica. 92 (5), 449-453 (2014).
  5. Al-Latayfeh, M., Silva, P. S., Sun, J. K., Aiello, L. P. Antiangiogenic therapy for ischemic retinopathies. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (6), 006411(2012).
  6. Wang, S., Villegas-Perez, M. P., Vidal-Sanz, M., Lund, R. D. Progressive optic axon dystrophy and vacuslar changes in rd mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (2), 537-545 (2000).
  7. Liu, H., et al. Photoreceptor cells influence retinal vascular degeneration in mouse models of retinal degeneration and diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4272-4281 (2016).
  8. Steingrimsson, E., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Melanocytes and the microphthalmia transcription factor network. Annual Review of Genetics. 38, 365-411 (2004).
  9. Arnheiter, H. The discovery of the microphthalmia locus and its gene. Mitf. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (6), 729-735 (2010).
  10. Garcia-Llorca, A., Aspelund, S. G., Ogmundsdottir, M. H., Steingrimsson, E., Eysteinsson, T. The microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene and its role in regulating eye function. Scientific Reports. 9 (1), 15386(2019).
  11. Bharti, K., Liu, W., Csermely, T., Bertuzzi, S., Arnheiter, H. Alternative promoter use in eye development: the complex role and regulation of the transcription factor MITF. Development. 135 (6), 1169-1178 (2008).
  12. Lu, S. Y., Li, M., Lin, Y. L. Mitf induction by RANKL is critical for osteoclastogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1763-1771 (2010).
  13. Pillaiyar, T., Manickam, M., Jung, S. H. Recent development of signaling pathways inhibitors of melanogenesis. Cellular Signalling. 40, 99-115 (2017).
  14. Danielsson, S. B., Garcia-Llorca, A., Reynisson, H., Eysteinsson, T. Mouse microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) mutations affect the structure of the retinal vasculature. Acta Ophthalmologica. 100 (8), 911-918 (2022).
  15. Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annual Review of Vision Science. 7, 129-153 (2021).
  16. Wei, W., et al. Automated vessel diameter quantification and vessel tracing for OCT angiography. Journal of Biophotonics. 13 (12), e202000248(2020).
  17. Salas, M., et al. Compact akinetic swept source optical coherence tomography angiography at 1060 nm supporting a wide field of view and adaptive optics imaging modes of the posterior eye. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1871-1892 (2018).
  18. Albanna, W., et al. Non-invasive evaluation of neurovascular coupling in the murine retina by dynamic retinal vessel analysis. PLoS One. 13 (10), e0204689(2018).
  19. Moult, E. M., et al. Evaluating anesthetic protocols for functional blood flow imaging in the rat eye. Journal of Biomedical Optics. 22 (1), 16005(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MATLAB

Похожие статьи