Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Артериальный тромбоз, индуцированный хлоридом железа, и сбор образцов для анализа 3D-электронной микроскопии

3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64985

⸱

17 марта 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Laboratory of Cellular Imaging and Macromolecular Biophysics, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает, как использовать FeCl-3-опосредованное повреждение для индукции артериального тромбоза, а также как собирать и подготавливать образцы артериального повреждения на различных стадиях тромбоза для анализа электронной микроскопии.

Аннотация

Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных причин смертности и заболеваемости во всем мире. Аберрантный тромбоз является общей чертой системных состояний, таких как диабет и ожирение, а также хронических воспалительных заболеваний, таких как атеросклероз, рак и аутоиммунные заболевания. При повреждении сосудов обычно свертывающая система, тромбоциты и эндотелий действуют организованно, чтобы предотвратить кровотечение, образуя сгусток в месте повреждения. Аномалии в этом процессе приводят либо к чрезмерному кровотечению, либо к неконтролируемому тромбозу / недостаточной антитромботической активности, что приводит к окклюзии сосудов и ее последствиям. Модель повреждения сонной артерии, индуцированная FeCl3, является ценным инструментом для исследования того, как тромбоз инициируется и прогрессирует in vivo. Эта модель включает повреждение / денудацию эндотелия и последующее образование сгустка в поврежденном месте. Он обеспечивает высокочувствительный количественный анализ для мониторинга повреждения сосудов и образования сгустков в ответ на различные степени повреждения сосудов. После оптимизации этот стандартный метод может быть использован для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе тромбоза, а также ультраструктурных изменений тромбоцитов в растущем тромбе. Этот анализ также полезен для изучения эффективности антитромботических и антиагрегантных средств. В этой статье объясняется, как инициировать и контролировать FeCl-3-индуцированный артериальный тромбоз и как собирать образцы для анализа с помощью электронной микроскопии.

Введение

Тромбоз - это образование сгустка крови, который частично или полностью блокирует кровеносный сосуд, препятствуя естественному току крови. Это приводит к тяжелым и смертельным сердечно-сосудистым событиям, таким как ишемическая болезнь сердца и инсульты. Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной заболеваемости и смертности и являются причиной каждой четвертой смерти во всем мире 1,2,3. Хотя тромбоз проявляется как нарушение работы сосудистой системы, он может быть результатом основной микробной или вирусной инфекции, иммунного расстройства, злокачественных новообразований или метаболического состояния. Кровоток поддерживается сложным взаимодействием между различными компонентами сосудистой системы, включая эндотелиальные клетки, эритроциты/лейкоциты, тромбоциты и факторы свертываниякрови 4. При повреждении сосудов тромбоциты взаимодействуют с адгезивными белками на субэндотелиальном матриксе и высвобождают свое зернистое содержимое, которое набирает больше тромбоцитов5. Одновременно активируется каскад коагуляции, что приводит к образованию и отложению фибрина. В конечном итоге образуется сгусток, содержащий тромбоциты и эритроциты, попавшие в фибриновую сетку6. Хотя антиагреганты и антикоагулянты доступны для модуляции тромбоза, ложные кровотечения остаются серьезной проблемой при этих методах лечения, требуя точной настройки дозировок и комбинаций этих препаратов. Таким образом, по-прежнему существует острая необходимость в открытии новых антитромботическихпрепаратов7.

Тромбоз изучается с использованием нескольких методов нанесения сосудистого повреждения: механического (перевязка сосудов), термического (лазерная травма) и химического повреждения (применение FeCl3 / Rose Bengal). Характер тромбоза варьируется в зависимости от локализации (артериальная или венозная), метода или степени повреждения. Среди всех этих типов FeCl-3-индуцированное повреждение сосудов является наиболее широко используемым методом. Он использовался у мышей, крыс, кроликов, морских свинок и собак 8,9,10,11,12. Метод относительно прост, удобен в использовании, и если основные параметры стандартизированы, он чувствителен и воспроизводим в различных сосудистых системах (например, артериях [сонных и бедренных], венах [яремных] и артериолах [кремастерных и брыжеечных]) (Дополнительная таблица 1).

Эта модель также может быть использована для дальнейшего понимания механики и морфологии образования сгустков. Этот метод однозначно предлагает преимущество остановки тромбоза в различных точках скорости потока, чтобы изучить промежуточные стадии процесса, прежде чем он станет окклюзионным. Последние достижения в исследованиях тромбоза использовали эту модель, чтобы сосредоточить внимание на нефармакологических методах тромболизиса13 или неинвазивной доставки антитромботических и/или фибринолитических агентов14,15. Несколько групп показали, что, когда мембраны тромбоцитов покрыты этими терапевтическими средствами, лекарства могут быть активированы при термической стимуляции для воздействия на сгустки16. Описанные здесь методы могут быть полезны для таких исследований, как подтверждение их результатов на уровне отдельных тромбоцитов. В этой рукописи Протокол 1 описывает базовую процедуру повреждения сосудов, опосредованную FeCl3, в то время как Протокол 2 описывает метод сбора и фиксации образца сосудистого повреждения для дальнейшего анализа с помощью электронной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты, обсуждаемые здесь, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Кентукки.

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические инструменты перечислены на рисунке 1 и в таблице материалов. Использовали мышей C57BL/6J в возрасте 8-10 недель, самцов/самок или соответствующие генетически модифицированные (нокаутные или нокаутные) штаммы.

1. FeCl3-индуцированное повреждение сонной артерии

  1. Индукция анестезии мыши
    1. Взвесьте мышь.
    2. Обезболивают мышей, вводя 0,2 г/кг раствора трибромэтанола внутрибрюшинно (внутривенно). Перед введением убедитесь, что раствор анестетика имеет комнатную температуру (ЛТ). Этой дозы достаточно, чтобы успокоить мышь примерно на 1 ч.
    3. Проверьте рефлекс пальца ноги, ущипнув палец через 5 минут после инъекции, чтобы убедиться, что мышь успокоена. Если мышь не успокоена, она отдернет палец ноги. Если это произойдет, подождите 5 минут и проверьте еще раз.
    4. Если мышь все еще не полностью успокоена, введите 1/4 начальной дозы и подождите 5 минут.
    5. На протяжении всей процедуры периодически контролируйте плоскость анестетика мыши с помощью защемления пальца ноги. Кроме того, частота дыхания и температура тела также могут контролироваться для поддержания оптимальной анестезии.
  2. Обездвижить мышь
    1. Положите мышь на грелку (37 °C) в положении лежа на спине и с помощью клейкой ленты обездвижите конечности.
    2. Используйте хирургическую нить (0,1 мм), чтобы осторожно потянуть за верхние передние зубы мыши, чтобы расширить область шейки матки / шеи. Это важно для лучшей визуализации операционной области и стабильности допплеровского зонда. Размер нити не важен, так как она используется только для вытягивания передних зубов животного для удлинения шеи.
  3. Надрез
    1. Опрыскайте операционную область 70% этанолом или протрите спиртовой салфеткой.
    2. С помощью ватного тампона нанесите небольшое количество крема для удаления волос на операционную область. Подождите 1-2 минуты, а затем используйте влажное бумажное полотенце или салфетку, чтобы удалить крем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для чистой хирургической области.
    3. С помощью ножниц и щипцов (рис. 1В11,1В13) сделайте срединный разрез от нижней челюсти до надгрудинной выемки. Втяните кожу, чтобы получить лучшую визуализацию области (рис. 2A).
  4. Обнажение сонной артерии
    1. С помощью хирургических щипцов и микрорассекающих щипцов тупого рассекают накладывающуюся поверхностную фасцию и удаляют ее, чтобы обнажить левую сонную артерию (рис. 1B12,1B13). Убедитесь, что на этом этапе вы не используете ножницы, чтобы не повредить другие сосуды в этой области.
    2. Удалите лишнюю ткань, окружающую сонную артерию. Избегайте чрезмерного рассечения окружающих тканей, так как в этой области находится блуждающий нерв и позвоночная артерия.
    3. Отделите сонную артерию от окружающих тканей, рассекая ее хирургическими щипцами и щипцами для наложения швов (рис. 1B12,1B15,2C). Следите за тем, чтобы не растягивать и не тянуть артерию, чтобы избежать механического повреждения артерии или окружающей сосудистой сети.
    4. Поместите кусок пластика под артерию, чтобы отметить место травмы (рис. 2D). Используйте цветной прозрачный лист, чтобы его было легче видеть в операционном поле.
  5. Размещение датчика расхода
    1. Поместите допплеровский трансзвуковой проточный зонд в физиологический раствор (0,9% NaCl в dH2O) примерно на 10 минут перед операцией. Вставьте другой конец зонда в насадку расходомера, чтобы облегчить считывание расхода. Подключите расходомер к компьютеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В промежутках между операциями доплеровский трансзвуковой датчик потока должен находиться в физиологическом растворе. Следите за тем, чтобы зонд был влажным и чистым на протяжении всей процедуры.
    2. Поместите ультразвуковой допплеровский датчик трансзвукового потока вокруг артерии выше по течению от пластика (рис. 2D). Убедитесь, что область держателя сосуда зонда не слишком вытянута (рис. 1C, красная стрелка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости поддержите зонд марлевыми подушечками (рис. 1B1), чтобы достичь соответствующей высоты зонда, облегчая оптимальное положение считывания.
    3. Если к этому моменту хирургическая область сухая, добавьте несколько капель физиологического раствора, чтобы сохранить область влажной. Следите за показаниями датчика расхода. Оптимальные показания варьируются для каждого животного и могут составлять от 0,6 до 1,2 мл / мин. Если он менее стабилен или нестабилен, измените положение датчика потока, чтобы получить оптимальные показания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что шея мыши не слишком вытянута, а область операции чистая.
  6. Запишите базовый план потока
    1. После установки зонда следите за кровотоком в течение 2 минут, чтобы убедиться, что поток устойчив. Затем запишите поток в течение 2 минут (рис. 3B) в качестве базового уровня. Подробное описание расходомера см. в Subramaniam et al.17.
    2. Чтобы записать кровоток, запустите программное обеспечение WinDAQ. Нажмите на опцию «Файл», а затем нажмите « Запись». Создайте новую папку и файл и начните запись. Чтобы остановить запись, нажмите « Стоп» в разделе «Файл».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение WinDAQ находится в свободном доступе у издателя: https://www.dataq.com/products/windaq/.
  7. Травма
    1. Остановите запись потока. Следите за тем, чтобы не изменить положение зонда, чтобы показания оставались постоянными после травмы.
    2. Тщательно вытрите область салфеткой / бумажным полотенцем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Даже небольшой объем остаточной жидкости может изменить концентрацию раствора FeCl3, используемого для нанесения сосудистого повреждения. Это приводит к переменным результатам и влияет на воспроизводимость. Когда область полностью высохла, зонд не в состоянии измерить расход.
    3. В пластиковую лодку для взвешивания положите круглую фильтровальную бумагу (диаметр 1 мм, вырезанная ушным перфоратором диаметром 1 мм). Добавьте 1 мкл 6% раствора FeCl3 (приготовленного в dH2O) на фильтровальную бумагу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно добавьте раствор FeCl3 непосредственно перед использованием фильтровальной бумаги. Слишком раннее замачивание бумаги может привести к испарению раствора FeCl3 и изменению тяжести травмы.
    4. Используя тонкие щипцы, возьмите фильтровальную бумагу и положите ее на артерию выше по течению от зонда, на той части артерии, которая отмечена пластиком (рис. 2D, E). Этот пластик выступает в роли маркера и прокладки. Он отмечает поврежденный участок и предотвращает случайное разбавление FeCl3 , избегая контакта с окружающей влажной областью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что фильтровальная бумага прямая, не зажата и не сложена каким-либо иным образом. После размещения на артерии не меняйте положение фильтровальной бумаги; Это изменяет степень травмы.
    5. Поместив фильтровальную бумагу, запустите таймер и запишите кровоток. Через 3 минуты удалите бумагу и добавьте физиологический раствор в место повреждения, чтобы удалить FeCl3 и остановить процесс повреждения. Это также делает область влажной. На этом этапе кровоток должен вернуться к исходному уровню, как это было зафиксировано до травмы.
    6. Контролируйте и записывайте поток до тех пор, пока он не уменьшится до 10% от исходной записи или не достигнет нуля. Наблюдается устойчивое снижение, как только тромб начинает образовываться в месте повреждения (рис. 3C). Обратите внимание на любые значительные колебания потока в течение этого времени.
    7. Чтобы изучить стабильность тромба, фиксируйте быстрое увеличение кровотока после каждого значительного и последовательного снижения. Эти события классифицируются как эмболизация из-за нестабильного тромбоза (рис. 4D). После последовательного уменьшения потока оператор может увидеть повреждение артерии в конце эксперимента (рис. 2F, синяя стрелка/пунктирный овал).
    8. Время окклюзии сосудов определяется как полное прекращение кровотока не менее чем на 1 мин. Запишите время, в которое образуется окклюзионный тромб, о чем свидетельствует нулевое показание или значительное уменьшение потока.
    9. Завершите эксперимент на 30 минуте. Если тромб не образуется в течение 30 минут после мониторинга, то запишите поток, остановите запись и извлеките зонд.
    10. Очистите зонд 70% этанолом и щеткой, чтобы удалить остатки ткани/волос или мусора. Полностью высушите зонд, прежде чем помещать его в ящик для хранения. Полностью высушите зонд, прежде чем помещать его в ящик для длительного хранения.
    11. Усыпить мышь вывихом шейки матки. Поместите тушу в пакет для утилизации туши, помеченный названием лаборатории и датой.

2. Сбор и подготовка образцов для серийной блочной сканирующей электронной микроскопии (SBF-SEM) после повреждения, вызванного FeCl3

ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный протокол EM подходит для подготовки образцов для SBF-SEM. Этот метод визуализации предлагает беспрецедентную возможность изучения трехмерной структуры тромбоцитов в сгустке. С помощью этого метода образец визуализируется в виде серии последовательных блочных изображений SEM, генерируемых по мере прохождения образца. Ключевыми моментами для этой подготовки являются: 1) образец должен быть окрашен тяжелыми металлами с предварительным встраиванием; и 2) пластиковый закладной образец должен быть соответствующим образом обрезан для монтажа в СЭМ (см. Рисунок 6 для изображения обрезанных образцов). Окрашивание после встраивания в СЭМ невозможно. При сборе образца из повреждения сосуда, вызванного FeCl3, для ЭМ-анализа необходимо внести следующие изменения во время выполнения операции. Представленные модификации хирургического протокола FeCl3 также применимы к любой форме электронной микроскопии. Условия анестезии и этапы разреза и обнажения сонной артерии такие же, как и в Протоколе 1.

  1. Обнажив сонную артерию, отметьте место травмы, свободно опоясав область между двумя хирургическими нитями (размер: 0,1 мм) (рис. 5A, B).
  2. Поместите зонд под артерию, дистальнее нижней нити (рис. 5C).
  3. Вставьте пластиковую деталь под артерию между двумя нитями, чтобы отметить место повреждения FeCl3 (рис. 5C).
  4. Перед выполнением травмы проведите измерения потока, чтобы отметить базальный поток. Эти измерения используются для принятия решения о том, на каком этапе будет собираться образец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что фиксатор (3% параформальдегид / PFA + 0,1% глутаровый альдегид, оба изготовлены в 1x PBS) готов и находится в RT. В качестве альтернативы можно также использовать фиксацию с 2,5% глутарового альдегида на физиологическом фоне.
    ВНИМАНИЕ: И параформальдегид, и глутаровый альдегид очень токсичны и раздражают. При обращении с ними следует использовать перчатки, щиток для глаз и маски для защиты от воздействия. Все фиксирующие растворы токсичны, и этапы фиксации следует проводить в вытяжном шкафу.
  5. Выполните травму, поместив пропитанную FeCl 3 фильтровальную бумагу на артерию (используется 8% FeCl 3) на3 минуты (это время также может варьироваться). Через 3 минуты снимите фильтровальную бумагу и добавьте физиологический раствор в место повреждения, чтобы удалить избыток FeCl3. Этот шаг необходим для предотвращения различной степени повреждения и облегчения подсчета потока с помощью зонда (рис. 5D).
  6. Следите за показаниями расхода. Когда расход упадет ниже 50% от исходного значения, снимите зонд. Быстро высушите область и добавьте фиксатор в область, чтобы внешне зафиксировать область травмы.
  7. Быстро зажмите артерию рядом с областью травмы щипцами и срежьте вниз по течению от нижней нити и вверх по течению от верхней нити. При необходимости попросите другого человека помочь отрезать один конец. Положите ткань на пластиковую чашку для культивирования ткани в той же ориентации, в которой она была собрана, и добавьте несколько капель фиксатора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перерезание артерии вызывает немедленное обширное кровотечение, поэтому обязательно держите артерию, прежде чем перерезать ее в первый раз. В этом случае мышь обескровливается. Мышь усыпляют путем обескровливания и вывиха шейки матки.
  8. С помощью скальпеля очистите лишнюю ткань вокруг артерии. Не забывайте записывать ориентацию кровотока. Чтобы отметить это, отрежьте один конец горизонтально, а другой сужающийся/косой (рис. 5E).
  9. Держите образец в фиксаторе (3% PFA и 0,1% глутарового альдегида) в течение 1 ч при ЛТ. Затем храните образец в 1% PFA при 4 ° C до отправки его на влажном льду в лабораторию обработки образцов для ЭМ-анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы не должны быть заморожены. Проблемы, связанные с этим методом отбора проб, заключаются в следующем:
    1. Первоначальные показания могут быть неоптимальными или могут колебаться после травмы. Это может повлиять на степень травмы, выбранной для остановки для ЭМ-анализа. Чтобы решить эту проблему, обязательно запишите базовые показания в течение нескольких минут, попробовав различные положения размещения зонда, чтобы решить, какое положение является оптимальным.
    2. Время, необходимое для купирования травмы путем добавления внешнего фиксатора и фактического разрезания артериального участка для анализа, может добавить вариабельность степени тромбоза. Будьте быстры во время отбора проб после внешней фиксации.
  10. Получение образцов для обработки для ЭМ-анализа в 1% PFA на влажном льду. Промойте образцы в течение 3 минут на льду с 0,1 М какодилатным буфером, чтобы начать дальнейшую обработку.
  11. Зафиксируйте образцы на 1 ч на льду в 0,1 М какодилатном буфере + 2,5% глутарового альдегида + 2 мМCaCl2.
  12. Выбросьте фиксатор и промойте образцы холодным 0,1 М буфером какодилата натрия, содержащим 2 мМ CaCl2 (5 x 3 мин) (рис. 6А).
  13. Зафиксировать образцы раствором осмия (3% ферроцианид калия [K 4 C 6 N6Fe] + 0,3 М какодилатный буфер + 4 мМ CaCl 2, смешанный с равным объемом 4% водного тетраоксида осмия [OsO4; в ddH2 O]) в течение 1 ч на льду.
  14. Пока образцы фиксируются, сделайте свежий 1% раствор гидрата трихлорацетальдегида (TCH) в ddH2O. Инкубируйте раствор при 60 ° C в течение 1 ч, осторожно перемешивая.
  15. После фиксации промойте образцы ddH2O при RT в течение 5 x 3 мин.
  16. Инкубируют образцы в отфильтрованном 1% растворе TCH (изготовленном в ddH2O) в течение 20 мин при РТ.
  17. Промойте образцы ddH2O при RT (5 x 3 мин).
  18. Зафиксируйте образцы в 2% тетраоксиде осмия в ddH2O в течение 30 мин при ЛТ.
  19. Промойте образцы ddH2O при RT в течение 5 x 3 мин каждый.
  20. Поместите образцы в 1% уранилацетат (водный) и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 ° C.
  21. Промойте образцы ddH2O при RT в течение 5 x 3 мин каждый и обработайте их с помощью окрашивания аспартатом свинца по Уолтону.
  22. Монолитный Окрашивание свинцовым аспартатом Уолтона3:
    1. Сделайте 30 мМ раствора L-аспарагиновой кислоты в ddH2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аспарагиновая кислота растворяется быстрее, если рН повышен до 3,8. Этот стоковый раствор стабилен в течение 1-2 месяцев при хранении в холодильнике.
    2. Сделайте 20 мМ раствора нитрата свинца в 10 мл аспарагиновой кислоты и отрегулируйте рН до 5,5 с помощью 1 N KOH.
    3. Поместите образцы в раствор аспартата свинца при 60 ° C на 30 мин, после пяти промывок ddH2O при RT, каждая в течение 3 мин.
  23. Обезвоживайте образцы с помощью градуированной серии этанола. Используйте химическое обезвоживание по протоколуВальдивии 18.
    1. Промойте образцы в каждом из следующих растворов, чтобы постепенно обезвоживать образец (рис. 6B):
      25% этиловый спирт в течение 3 мин
      50% этиловый спирт в течение 3 мин
      75% этиловый спирт в течение 3 мин
      95% этиловый спирт в течение 3 мин
      100% этиловый спирт в течение 10 минут и повторите шаг дважды (всего три стирки).
  24. Промойте образцы в 100% оксиде пропилена (PO) в течение 10 минут и повторите этот шаг дважды (всего три стирки).
  25. Инкубируйте в 50%/50% PO/смоле с активатором DMP 30 в течение ночи при RT и встраивайте в 100% Araldite 502/embed 812/DDSA с активатором DMP30 в течение 48 часов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Данные обычно представляются как время до окклюзии или время, необходимое для формирования полностью окклюзионного тромба. Эти данные могут быть построены в виде кривой выживаемости Каплана-Мейера (рис. 4A)19, точечной диаграммы с полосами, показывающими конечный кровоток в момент прекращения кровотока или завершения эксперимента (рис. 4B), или в виде линейного графика (рис. 4C). Стабильность тромба можно изу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Местное применение FeCl3 в сосудистой сети для индукции тромбоза является широко используемым методом и играет важную роль в установлении ролей различных рецепторов тромбоцитов, сигнальных путей лиганда и их ингибиторов20,21,22,23. Механизм, посредством которого FeCl3 вызывает тромбоз, многогранен; Ранее эндотелиальная денудация считалась причиной тромбоза, однако в послед...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, связанных с данным исследованием.

Профили ORCID: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.

Благодарности

Авторы благодарят сотрудников Лаборатории Уайтхарта за внимательное прочтение этой рукописи. Работа была поддержана грантами от NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 и HL150818), а также премией Департамента по делам ветеранов за заслуги перед S.W.W., R01 HL 155519 B.S. и грантом очной программы NIBIB для R.D.L.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% Солевой раствор Fisher Scientific BP358-212NaCl используется для изготовления раствора 0,9% физиологического раствора 
1 мл шприца Бектон, Дикинсон и компания 
Этанол 190 проб KOPTECV1101 Используется для изготовления 70% раствора этанола для использования для подготовки мыши к хирургии 
2,2,2 ТрибромэтанолСигма Олдрич48402
25 ярдов черный плетеный шелковый шовный материал (5-0)DEKNATEL136082-1204
26G x 3/8 игла Бектон, Дикинсон и компания 305110
2-метил-2-бутанолсигма Олдрич240486
7,5 мл трансфер пипет, градуированный до 3 млGlobe Scientific Inc.135010
Салфетки для подготовки к алкоголю (70% изопропилового спирта)MedlineMDS090735
Araldite GY 502 Услуги электронной микроскопии 10900
Чашка для клеточных культур 35 мм x 10 мм;Корнинг Инкорпорейтед 
Компактные весы Наука Уорда 470314-390
Ножницы для препарирования, длина 12,5 смWorld Precision Instrument15922-G
DMP-30 активатор Услуги электронной микроскопии 13600
Доденилянтарный ангидрид / DDSAУслуги электронной микроскопии 13700
Мешки для собачьих какашек / мешок для утилизации туш животныхCrown Products PP-RB-200
Доплеровский датчик потокаTransonic Systems Inc.MA0.5PSB
ВСТРОЕННАЯ смола 812 Услуги электронной микроскопии 14900
Спирт этиловый, безводный 200 пр Услуги электронной микроскопии 15055
Щипцы для повязки глаз, 4 дюйма, полностью изогнутые, стандартные, наконечники шириной 0,8 ммIntegra Miltex18-784
Фильтровальная бумага VWR28310-106
Тонкие ножницы - острые-тупыеинструменты для тонкой науки 14028-10
Ушные пробойники с петлей для пальцев Инструменты для изобразительной науки 24212-01
Губки марлевые 2" x 2" – 12 слоев;Dukal Corporation2128
Глутаральдегид (10% раствор)Услуги электронной микроскопии 16120
Integra Miltex Хирургическое лезвие из углеродистой стали # 10Integra® Милтекс&рег;4110
Хлорид железа (III) SIGMA-ALDRICH157740-100G
Рукоятка ножа Miltex® Сверхтонкая нержавеющая сталь размера 3Integra Lifesciences 157510
L-аспарагиновая кислотаSigma  Рыбак  A93100
L-аспарагиновая кислотаFisher Scientific BP374-100
Нитрат свинца Fisher Scientific L-62
LEICA S8AP0 МикроскопLEICAБольше нетпродаже Нет в наличии у компании
LEICA S8AP0 Микроскоп Стенд LEICA10447255Больше нет в продаже у компании
Легкие салфетки VWR82003-822
Микро рассекающие щипцы; 1x2 зуба, полный изгиб; ширина наконечника 0,8 мм; длина 4 дюймароботизированный хирургический инструмент компанииRS-5157
Тетраоксид осмия 4% водный раствор Услуги электронной микроскопии 19150
Параформальдегид (16% раствор)Услуги электронной микроскопии 15710
Феррицианид калияSIGMA-ALDRICHP-8131
Оксид пропилена, реагент ACS Услуги электронной микроскопии 20401
Rainin Классическая пипетка PR-10Исследовательский
 Трансоник Системс Инк.T402B01481Модель: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", прозрачныйскотч 
Грелка для мелких животныхK& H Manufacturing Inc.Модель: HM10
Буфер какодилата натрия 0,2M, pH7,4Услуги электронной микроскопии 11623
Аппликаторы со стерильным хлопковым наконечником Пуританские медицинские изделия 25-806 1WC
Осветитель Steromaster Fisher Scientific 12-562-21Больше не выпускается от
компании Хирургический Дюмон #7 Щипцы Инструменты для изобразительной науки 11271-30
Тиокарбогидразид (ТЧ)SIGMA-ALDRICH88535
Универсальный наконечник пипетки с низким удержанием (0,1-10 &; L)VWR76323-394
на основе уранилацетата 22400
Veet Gel Крем для удаления волосReckitt Benckiser3116875
белым антистатическим шестиугольным весом Лодки, средний, 64 x 15 x 19 ммFisher Scientific S38975
WinDAQ/100 Программное обеспечение для WindowsDATAQ Instruments, Inc.Версия 3.38В свободном доступе для скачивания. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1ZEISS57615
309659430165 в расходомер Rainin 17008649305289Услуги электронной микроскопии

Ссылки

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  2. Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
  3. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  4. Palta, S., Saroa, R., Palta, A. Overview of the coagulation system. Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).
  5. Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
  6. Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
  7. Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
  8. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
  9. Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
  10. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
  11. Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
  12. Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981(2018).
  13. Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252(2022).
  14. Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260(2022).
  15. Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
  16. Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184(2022).
  17. Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
  18. Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
  19. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric-estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).
  20. Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
  21. Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
  22. Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
  23. Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
  24. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
  25. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
  26. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
  27. Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
  28. Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192(2021).
  29. Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890(2020).
  30. Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
  31. Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
  32. Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
  33. Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859(2022).
  34. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
  35. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479(2016).
  36. Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
  37. Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

III
Артериальный тромбоз, индуцированный хлоридом железа, и сбор образцов для анализа 3D-электронной микроскопии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.