Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение переноса аксонального груза в первичных корковых культивируемых нейронах коры головного мозга мыши

745 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64999

⸱

24 февраля 2023 г.

 , 
1Laboratory of Neuroscience, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 2Advanced Prevention and Research Laboratory for Dementia, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем протоколе описана вся процедура анализа на аксональный транспорт. В частности, здесь показан расчет скорости переноса без учета паузы, а также метод визуализации с помощью программного обеспечения открытого доступа "KYMOMAKER".

Аннотация

Нейронные клетки — это высокополяризованные клетки, которые стереотипно содержат несколько дендритов и аксон. Длина аксона обуславливает необходимость эффективной двунаправленной транспортировки моторными белками. В различных сообщениях высказывается предположение, что дефекты аксонального транспорта связаны с нейродегенеративными заболеваниями. Кроме того, механизм координации нескольких моторных белков был привлекательной темой. Поскольку аксон имеет однонаправленные микротрубочки, легче определить, какие моторные белки участвуют в движении. Таким образом, понимание механизмов, лежащих в основе транспортировки аксонального груза, имеет решающее значение для раскрытия молекулярного механизма нейродегенеративных заболеваний и регуляции моторных белков. Здесь мы представляем весь процесс анализа аксонального транспорта, включая культивирование первичных нейронов коры головного мозга мыши, трансфекцию плазмид, кодирующих белки-грузы, а также анализ направления и скорости без эффекта пауз. Кроме того, представлено программное обеспечение с открытым доступом "KYMOMAKER", которое позволяет создавать кимограф для выделения транспортных трасс в соответствии с их направлением и облегчает визуализацию аксонального транспорта.

Введение

Члены семейства кинезинов и цитоплазматический динеин являются моторными белками, которые перемещаются по микротрубочкам в клетках для транспортировки своего груза1. Большинство кинезинов движутся к плюсовому концу, в то время как динеин движется к минусовому концу микротрубочки. Функции и механизмы грузового транспорта в нейронном аксоне были широко исследованы. Из-за своей длины аксоны нуждаются в стабильном транспорте на большие расстояния для поддержания здоровья нейронов. Сообщалось о дефектах транспорта митохондрий, аутофагосом и везикул, содержащих предшественник белка амилоид-β (APP) в качестве причин нейродегенеративных заболеваний 2,3. Многочисленные исследования in vitro выявили механизмы, лежащие в основе скоординированного транспорта моторных белков, а различные исследования с использованием очищенных моторных белков и микротрубочек выявили, как моторные молекулы движутся вдоль микротрубочек 4,5. Как правило, в одном грузе задействовано несколько двигателей6. Тем не менее, существуют некоторые модели того, как противоположные моторы определяют направление грузового транспорта. Один из них — это «модель ассоциации/диссоциации»; При этом при транспортировке в одном направлении с грузом связаны только однонаправленные двигатели. Во второй, «координационной модели», оба мотора прикреплены к одному грузу, и активируется только одна сторона мотора. В третьей «модели перетягивания каната» соотношение сил между кинезинами и динеинами определяет направление транспорта 7,8,9. Кроме того, в нескольких отчетах было высказано предположение, что баланс и количество активированных моторных белков влияют на скорость транспортировки груза in vitro 8,10.

Остается без ответа вопрос о том, как регулируется активность кинезинов или динеинов в живых клетках. Предыдущие отчеты показали ацетилирование микротрубочек в аксонах, а нейротрофические факторы усиливают аксональный транспорт11,12. Кроме того, различные типы грузовых и грузовых адаптеров выполняют функцию активаторов мотора соответствующими способами13,14. Многие из них связаны с мембраной транспортных везикул, и их функции регулируются такими сигналами, как посттрансляционные модификации15. Таким образом, наблюдение за направлением и скоростью переноса в живых клетках дает ценную информацию о молекулярной регуляции транспорта груза в экспериментах in vitro. Наблюдение за аксональным транспортом позволяет различать кинезиновый и динеиновый транспорт. Поскольку аксоны содержат плюсовые односторонние микротрубочки16, груз транспортируется антероградно (т.е. сома к окончанию аксона) кинезинами и ретроградно (т.е. окончание аксона к соме) динеинами.

В настоящем исследовании описан метод наблюдения и анализа аксонального транспорта в первичных культивируемых нейронах. В качестве примера описана процедура наблюдения за аксональным транспортом мембранных белков – APP, кальсинтенина-1/alcadein α (Alcα) и везикул кальсинтенина-3/alcadein β (Alcβ). Известно, что антероградный транспорт APP-содержащих везикул происходит значительно быстрее, чем у Alcα-содержащих везикул, хотя и те, и другие транспортируются кинезином-1 17,18,19. В предыдущих отчетах для измерения скорости использовалось несколько методов. Наиболее вариативным этапом является обработка пауз во время транспортировки. В живых клетках транспорт иногда затрудняется препятствиями вдоль микротрубочек; Тем не менее, двигатели могут обходить область с паузой или без паузы20. Пауза может повлиять на расчет скорости за более длительное время наблюдения, что может привести к более медленной оценке скорости. Здесь описывается метод, использующий движение в течение сегментированного (200 мс) периода для исключения эффекта физической паузы моторов. Наконец, была представлена программа с открытым доступом (только для Windows) под названием "KYMOMAKER"21. Кимографы широко используются для визуализации везикулярного транспорта и полезны для визуализации направления транспортировки каждого груза без необходимости просмотра фильма. Программное обеспечение генерирует кимографы из покадровых фильмов, применяя одномерный алгоритм Watershed несколько раз во время вращения изображений. Это позволяет полученному кимографу эффективно и легко отображать мелкие структуры. Кроме того, KYMOMAKER автоматически обнаруживает и выделяет следы в соответствии с их направлением и позволяет создавать простые для понимания диаграммы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты были одобрены Комитетом по исследованиям на животных Университета Хоккайдо в соответствии с рекомендациями ARRIVE. В настоящем исследовании использовались самки мышей C57BL/6J (беременные, 15,5 дней).

1. Препарирование первичных корковых культурных нейронов коры головного мозга мыши

  1. Добавьте 0,1 мг/мл поли-L-лизина в 0,1 М Трис (трис(гидроксиметил)аминометан)-HCl (pH 8,5) в 8-луночную (No1,0) камеру со стеклянным дном (см. Таблицу материалов). Инкубируйте камеру в инкубаторе при температуре 37 °C не менее 1 часа.
  2. Промойте камеру стерилизованной водой не менее трех раз и высушите на воздухе в вытяжке для культуры тканей.
  3. Принесите в жертву беременных мышей на 15,5 день из-за вывиха шейки матки или в соответствии с утвержденными в учреждении правилами.
  4. Зажмите маточный рог, в котором находятся эмбрионы, изолируйте все маточные рога с помощью ножниц и погрузите их в холодный фосфатно-солевой буфер (PBS) на льду.
  5. При холодном PBS изолируйте эмбрионы с помощью острого пинцета и удалите все амниотические оболочки эмбрионов.
  6. Еще раз промойте эмбрионы свежим холодным PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время каждого этапа изоляции вымывайте как можно больше крови и следите за тем, чтобы не повредить сосуды или эмбрионы.
  7. Поместите эмбрион на стерилизованную марлю в холодную чашку Петри под световой микроскопией.
  8. Изолируйте мозг. Разрежьте голову, кожу и череп эмбриона с помощью кончика изогнутого острого пинцета. Снимите кожу и череп, чтобы обнажить верхнюю и боковые стороны мозга.
  9. Вычерпнуть весь мозг с помощью изогнутой части пинцета и погрузить его в чашку Петри, содержащую ледяной 1x сбалансированный раствор соли Хэнкса (HBSS; 10 mM HEPES [pH 7,6], 5,3 мМ KCl, 0,44 мМ KH2PO4, 140 мМ NaCl, 4,2 мМ NaHCO3, 0,34 мМ Na2HPO4, 39 мМ D-глюкоза, и 0,5 мкг/мл гентамицина; см. Таблицу материалов).
  10. Повторяйте шаги 1.7-1.9 до тех пор, пока не будет получено необходимое количество мозгов.
    Примечание: Как правило, можно получить от 5 x 106 до 2 x 107 клеток на мозг.
  11. Отделите кору22 от мозга с помощью пинцета в холодном состоянии 1x HBSS и оторвите мозговые оболочки от коры.
  12. Перенесите кору головного мозга в новую чашку Петри, содержащую холодный 1x HBSS. Разрежьте кору головного мозга пополам или на три части с помощью хирургических лезвий.
  13. Перенесите кору головного мозга в центрифужную пробирку объемом 15 мл с помощью наконечников объемом 1000 мкл и удалите излишки 1x HBSS.
  14. Добавьте 100 единиц папаина и 200 мкг дезоксирибонуклеазы I (ДНКазы I), разведенных 5 мл разбавленного раствора папаина (5 мг/мл D-глюкозы, 0,2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 0,2 мг/мл L-цистеина в 1x PBS; см. Таблицу материалов) на эмбрион, и инкубируйте на водяной бане при температуре 37 °C в течение 15 минут. Переворачивайте трубку каждые 5 минут во время инкубации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется предварительная инкубация папаина в растворе разбавленного папаина. Выдерживать 5 минут на водяной бане при температуре 37 °C, затем добавить DNase I.
  15. Выбросьте раствор. Добавьте 2 мл 20% термоинактивированной лошадиной сыворотки (см. Таблицу материалов) в 1x HBSS. Инкубировать в течение 1 минуты.
  16. Выбросьте раствор. Промойте салфетку 4 мл 1x HBSS дважды.
  17. Выбросьте раствор. Добавьте 0,5 мл на каждый эмбрион плоской среды (нейробазальная среда, содержащая 2% добавки В-27, 4 мМ глутамакса, 5% термоинактивированную лошадиную сыворотку и 1x пенициллин-стрептомицин; см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этапах 1.14-1.17 центрифугирование не требуется, так как отрезанные кусочки коры головного мозга опускаются на дно пробирки без него. Не используйте аспиратор и не всасывайте кусочки.
  18. Очень осторожно подрезайте наконечником объемом 1 000 мкл или пипеткой объемом 10 мл от 5 до 10 раз.
  19. Очень осторожно восстановите суспендию с помощью наконечника объемом 1 000 мкл 10 раз.
  20. Центрифуга при 250 × г при комнатной температуре (20-25 °C) в течение 3 мин.
  21. Удалите надосадочную жидкость и очень осторожно суспендируйте по 0,5 мл на каждый эмбрион гальванической среды, используя наконечник объемом 1 000 мкл 10 раз.
  22. Поместите клеточный фильтр 40 μм на центрифужную пробирку объемом 50 мл, затем отфильтруйте клеточную суспензию под действием силы тяжести. Соберите отфильтрованную клеточную суспензию в пробирку.
  23. Пересчитайте ячейки и пластины в камеры со скоростью от 2 × 104 до 5 × 104 ячейки/см2 с соответствующим объемом гальванической среды. Пример плотности показан на дополнительном рисунке 1.
  24. В день in vitro (Div.) 2 замените половину среды питательной средой (нейробазальная среда, содержащая 2% добавки B-27, 4 мМ глутамакса и 1x пенициллин-стрептомицин) и добавьте 5 мкМ 5-фтор-2-дезоксиуридина (см. Таблицу материалов).
  25. После Div. 4 заменяйте половину среды питательной средой каждые 2 или 3 дня.

2. Трансфекция плазмид в первичный культивируемый нейрон методом фосфата кальция

ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные объемы относятся к лунке 0,8см2 в 8-луночной камере со стеклянным дном (см. Таблицу материалов).

  1. Приготовьте 50 мкл раствора DNA/CaCl2 путем смешивания 200 нг с 2 мкг плазмиды (APP-EGFP в pCAGGS, Alcα-EGFP в pcDNA3.118 или Alcβ-EGFP в pcDNA3.1; см. дополнительную таблицу 1), кодирующей флуоресцентно меченный белок, 6,2 мкл 2 M CaCl2 и стерилизованную воду.
  2. Аликвота 50 мкл 2x HEPES-буферного физиологического раствора (HBS) в новые центрифужные пробирки.
  3. Добавьте 6,2 мкл раствора DNA/CaCl2 в 2x раствор HBS. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки 10 раз.
  4. Повторяйте шаг 2.3 до тех пор, пока не будет перенесен весь раствор DNA/CaCl2 .
  5. Выдерживать при комнатной температуре в течение 15 минут.
  6. Соберите питательную среду в камере со стеклянным дном и замените ее свежей питательной средой без антибиотиков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните собранную среду в инкубаторе для клеточных культур до шага 2.10.
  7. Добавьте 50 мкл смеси ДНК/CaCl2/HBS в каждую лунку по каплям в нейроны. Выращивание за 1 ч.
  8. Во время инкубации подкисленную среду приготовьте, поместив чашку Петри, содержащую DMEM (модифицированную среду Eagle's от Dulbecco)/среду F-12 Ham's, в инкубатор с 10%CO2 при температуре 37 °C.
  9. После инкубации в течение 1 ч после трансфекции промойте первичные нейроны препаратом F-12 от DMEM/Ham (подкисленная среда) 3 раза.
  10. Замените среду смесью наполовину собранной среды и наполовину свежей питательной среды. Культивируют до наблюдения с помощью микроскопии при 37 °C и 5%CO2.

3. Наблюдение за аксональным транспортом

  1. Предварительно инкубируйте камеру, оснащенную микроскопией TIRF (общая внутренняя отражательная способность) (см. Таблицу материалов) при температуре 37 °C.
  2. Если контроллер CO2 оснащен, питательная среда может быть использована в качестве среды для наблюдения при концентрацииCO2 менее 5%. Если она не оборудована, замените среду на среду, стабильную к pH, такую как Leibovitz L-15 (см. Таблицу материалов), поставляемую с 4 мМ глутамаксом и 2% добавкой B-27.
  3. Найдите трансфицированную клетку, затем определите аксон. Увеличивайте угол падения лазера до полного отражения лазера. Затем уменьшайте угол до тех пор, пока не будут визуализированы все везикулы в аксоне (псевдо-TIRF). Получение изображений с выдержкой 200 мс в течение 150 кадров (30 с).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте для захвата всех везикул аксонов использовалась подсветка pseud-TIRF. Могут использоваться и другие микроскопы, оснащенные высокоскоростными системами захвата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз записывайте направление аксона в имя файла. Площадь исходного сегмента аксона или площади терминального аксона не учитывалась при наблюдении.

4. Обработка изображений

  1. Откройте полученные изображения с помощью программы MetaMorph (см. Таблицу материалов).
  2. Откройте Панель инструментов > Измерить > Калибровать расстояние. Включите функцию «Применить ко всем открытым изображениям» и введите фактическое расстояние до пикселя.
  3. Откройте Панель инструментов > Отобразить > Повернуть. Установите флажок "все плоскости". Поверните так, чтобы аксон был горизонтальным, а направление к окончанию аксона было правым.
  4. Откройте Панель инструментов > Регионы > Создать регионы. Установите размер региона для обрезки и нажмите на кнопку Создать. Поместите рамку, которая появится на изображении, в область аксона для анализа. Сохраните сгенерированную последовательность изображений в виде файла стека.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите области, которые не содержат несфокусированных аксонов или мусора.
  5. Откройте панель инструментов > меню «Отображение > графики». Выберите Калибровочная линейка, чтобы поставить штамп на масштабной линейке. Выберите «Данные/время», чтобы добавить метку времени к изображениям. Включите функцию "все плоскости". Переместите объекты в соответствующее место и нажмите на штамп.
  6. Откройте панель инструментов > Сложить > Создать фильм. Введите подходящую частоту кадров и выберите AVI. Сохраните его как новый файл.

5. Построение кимографа и обнаружение следов с помощью KYMOMAKER

  1. Загрузите KYMOMAKER (см. Таблицу материалов) и откройте «Kymoanalysis.exe» в папке KYMOMAKER.
  2. Откройте "kymoAnalysis.exe", чтобы отобразить основные окна (Рисунок 1A). Выберите «Файл» > «Загрузить » и откройте созданный видеоролик AVI. Появится окно "Предварительный просмотр" (Рисунок 1B).
  3. На вкладке «Создать кимограф » > разделе обрезки введите номера пикселей для обрезки. Обрезка немедленно отражается в окне «Предварительный просмотр», чтобы обеспечить легкую настройку (Рисунок 1C). Убедитесь, что вся масштабная линейка и временная метка были удалены.
  4. Нажмите на кнопку «Создать », чтобы сгенерировать кимограф (Рисунок 1C). KYMOMAKER определяет самый яркий пиксель в каждой оси Y в окне «Предварительный просмотр». Сохраните кимограф с помощью файла > сохраните > обычный кимограф.
  5. Чтобы обнаружить следы низкой интенсивности на кимографе, нажмите на «Вращающийся кимограф». Отрегулируйте число в разделе "Вращающийся кимограф" и просмотрите результат, нажав на вращающийся кимограф (рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: "Вращение (градус)" - это интервал градуса для алгоритма21 Вращательного водораздела. Например, 10° означает, что алгоритм Водораздела выполняется каждые 10° 36 раз, а затем результаты объединяются в окне "Вращающийся водораздел".
  6. Чтобы обнаружить антероградные и ретроградные следы на кимографе, во вкладке Обнаружение > разделе Цель выберите оригинал , если Ротационный кимограф не был сгенерирован. Убедитесь, что при выборе параметра «Поворот» созданный вращательный водораздел используется для обнаружения трасс. Выберите «Водораздел » в «Методе обнаружения». Нажмите на кнопку «Обнаружить », чтобы автоматически обнаружить трассировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаруженные трассы отрисовываются в окне "Рабочие". Включение «Маскировки» рисует следы на оригинальном кимографе.
  7. Определите антероградные и ретроградные следы, введя число в раздел Обнаружение > фильтрация > скорости (рис. 1E, F). Обнаруживайте антероградные следы путем ввода от 0,4 до 7,0 мкм/с. Обнаружение ретроградных следов путем ввода скорости от −0,4 до −7,0 мкм/с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установка для наименьшей скорости зависит от определения неподвижного состояния везикул. Смотрите шаг 6.7.
  8. Сохраните файлы.

6. Определение скорости

  1. Откройте программу MetaMorph.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плагин "ручного отслеживания" в ImageJ также может рассчитывать скорости таким же образом.
  2. Откройте файл, созданный на шаге 4.4. Убедитесь, что калибровка адаптирована к изображениям.
  3. Откройте Панель инструментов > Приложения > Отслеживать баллы. Нажмите на кнопку «Добавить дорожку». Найдите движущуюся везикулу, которая была перенесена в антероградном или ретроградном направлении. Затем отслеживайте везикулу, щелкая до тех пор, пока транспортировка не прекратится. Нажмите «Готово».
  4. Повторяйте шаг 6.3 до тех пор, пока не будут отслежены все везикулы.
  5. Нажмите на кнопку «Открыть журнал », чтобы открыть файл CSV. Затем нажмите на файл журнала , чтобы отобразить данные в файле CSV.
  6. Сохраните файл CSV.
  7. Чтобы рассчитать сегментированную скорость, на которую пауза не влияет, удалите вычисленные скорости 0,37 мкм/с или ниже в столбце "velocity".
    Везикулы могут перемещаться очень коротко за счет аномальной диффузии, и они не обрабатываются моторными белками23. Чтобы избежать исключения этих движений из расчета скоростей с приводом от двигателя, наименьшая скорость (1 пиксель/200 мс) в этом протоколе удаляется из расчета.
  8. Рассчитайте сегментированную среднюю скорость каждые пять кадров (всего 1 с). Отбросьте последнюю часть скорости, если осталось менее пяти кадров.
  9. Объедините все средние скорости из одного условия. Создание гистограмм для визуализации распределения скоростей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Первичные культивируемые нейроны из коры головного мозга E15.5 были культивированы в чашке со стеклянным дном, как описано. Например, APP-EGFP, Alcα-EGFP или Alcβ-EGFP экспрессировались в первичных корковых нейронах. Известно, что APP и Alcα переносятся в аксоне кинезином-1 2,17. APP связывается с кинезином-1 через адаптерный белок JIP1 (JNK-интерактивный белок 1), в то время как Alcα напрямую связывается через свои двойные W-кислотные мотивы. A...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описан метод анализа аксонального транспорта, который включает в себя расчет сегментированной скорости и генерацию кимографов. Критически важным этапом на этапе трансфекции является поддержание здоровья культивируемых нейронов. Метод трансфекции, описанный Цзяном и Чэнем29 , был использован с незначительными изменениями. Щадящее смешивание раствора DNA/CaCl2 и 2x HBS повысило эффективность трансфекции за счет уменьшения размера осадков. Чтобы осадки не ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана KAKENHI (22K15270, грант для молодых ученых) и Фондом наук о жизни Акиямы для YS. Мы хотели бы выразить нашу благодарность доктору Масатаке Киндзё и доктору Акире Китамуре, Лаборатория молекулярной клеточной динамики, факультет передовых наук о жизни Университета Хоккайдо, за предоставленный критический вклад и экспертные знания, которые в значительной степени помогли исследованию. Наблюдение с помощью микроскопии TIRF проводилось с помощью прибора, установленного в Лаборатории молекулярной динамики клеток факультета передовых наук о жизни Университета Хоккайдо. Инструмент зарегистрирован в системе Open Facility под управлением Global Facility Center, Creative Research Institute, Hokkaido University (AP-100138). Мы благодарим доктора Сэйити Учиду (Seiichi Uchida), Лаборатория человеческого интерфейса, Департамент передовых информационных технологий, факультет информационных наук и электротехники, Университет Кюсю, Фукуока, Япония, за сборку с помощью приложения Kymomaker. Передовая лаборатория профилактики и исследований деменции, Высшая школа фармацевтических наук, Университет Хоккайдо, поддерживается Japan Medical Leaf co., Ltd.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5-Фтор-2-дезоксиуридинSigma-AldrichF0503
Apo TIRF 100x/1.49 OILNikon
B-27 Добавка (50x), без сывороткиThermo fischer scientific17504044
Бычий сывороточный альбуминWako013-25773
CalPhos Mammalian Transfection KitTakara631312
Сетчатый фильтр для ячеек  40 & микро; m НейлонFalcon352340
CoolSNAP HQФотометрия
дезоксирибонуклеаза ISigma-AldrichDN-25
D-глюкозаWako 041-00595
DMEM/Ham' s F-12Wako042-30555
Дюмон No 7 щипцыDumont No7
Хирургическое лезвие из перьев ПероNo11
Ручка хирургического лезвия Feather ПероNo 3
ГентамицинWako079-02973
Гентамицин сульфатWako075-04913
GlutaMAX SupplementThermo fischer scientific35050061
HEPESDOJINDO342-01375
Сыворотка для лошадей, термоинактивированнаяThermo fischer scientific26050088
KClWako163-03545
KH2PO4Wako169-04245
KYMOMAKERhttp://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html
L-15 Medium (Leibovitz)Sigma-AldrichL5520
MetaMorph версия 6.2r1 Метаморф
Na2HPO4Wako197-02865
NaClWako197-01667
NaHCO3Wako191-01305
Нейробазальный СреднийТермофишер научный21103049
Nikon ECLIPSE TE 2000-ENikon
Nunc Lab-Tek  8-луночное камерное покровное стеклоThermo Fischer Scientific155411
PapainWorthingtonLS003126
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Thermo Fisher Scientific15140122
поли-L-лизина гидробромидSigma-AldrichP2636-500MG
Тризма на основеMerckТ1194-10ПАКрастворили с водой до 0,1 М Трис-HCl (рН.8,5)

Ссылки

  1. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 682-696 (2009).
  2. Stokin, G. B., et al. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's diseases. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
  3. Guo, W., Stoklund Dittlau, K., vanden Bosch, L. Axonal transport defects and neurodegeneration: Molecular mechanisms and therapeutic implications. Seminars in Cell & Developmental Biology. 99, 133-150 (2020).
  4. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  5. Carter, N. J., Cross, R. A. Mechanics of the kinesin step. Nature. 435 (7040), 308-312 (2005).
  6. Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Current Biology. 14 (13), R525-R537 (2004).
  7. Hendricks, A. G., et al. Motor coordination via a tug-of-war mechanism drives bidirectional vesicle transport. Current Biology. 20 (8), 697-702 (2010).
  8. Rezaul, K., et al. Engineered tug-of-war between kinesin and dynein controls direction of microtubule based transport in vivo. Traffic. 17 (5), 475-486 (2016).
  9. Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Biophysical challenges to axonal transport: motor-cargo deficiencies and neurodegeneration. Annual Review of Biophysics. 43, 141-169 (2014).
  10. Monzon, G. A., et al. Stable tug-of-war between kinesin-1 and cytoplasmic dynein upon different ATP and roadblock concentrations. Journal of Cell Science. 133 (22), 226248(2020).
  11. Guo, W., et al. HDAC6 inhibition reverses axonal transport defects in motor neurons derived from FUS-ALS patients. Nature Communications. 8 (1), 861(2017).
  12. Tosolini, A. P., et al. BDNF-dependent modulation of axonal transport is selectively impaired in ALS. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 121(2022).
  13. Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 765-777 (2009).
  14. Fu, M. M., Holzbaur, E. L. F. Integrated regulation of motor-driven organelle transport by scaffolding proteins. Trends in Cell Biology. 24 (10), 564-574 (2014).
  15. Kumari, D., Ray, K. Phosphoregulation of kinesins involved in long-range intracellular transport. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 873164(2022).
  16. Wai Yau, K., et al. Cellular/molecular dendrites in vitro and in vivo contain microtubules of opposite polarity and axon formation correlates with uniform plus-end-out microtubule orientation. The Journal of Neuroscience. 36 (4), 1071-1085 (2016).
  17. Araki, Y., et al. The novel cargo Alcadein induces vesicle association of kinesin-1 motor components and activates axonal transport. The EMBO Journal. 26 (6), 1475-1486 (2007).
  18. Sobu, Y., et al. Phosphorylation of multiple sites within an acidic region of Alcadein α is required for kinesin-1 association and Golgi exit of Alcadein α cargo. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3844-3856 (2017).
  19. Tsukamoto, M., et al. The cytoplasmic region of the amyloid β-protein precursor (APP) is necessary and sufficient for the enhanced fast velocity of APP transport by kinesin-1. FEBS Letters. 592 (16), 2716-2724 (2018).
  20. Ferro, L. S., Can, S., Turner, M. A., Elshenawy, M. M., Yildiz, A. Kinesin and dynein use distinct mechanisms to bypass obstacles. eLife. 8, e48629(2019).
  21. Chiba, K., Shimada, Y., Kinjo, M., Suzuki, T., Uchida, S. Simple and direct assembly of kymographs from movies using KYMOMAKER. Traffic. 15 (1), 1-11 (2014).
  22. Xu, S. -Y., Wu, Y. -M., Ji, Z., Gao, X. -Y., Pan, S. -Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 803930(2012).
  23. Han, D., et al. Deciphering anomalous heterogeneous intracellular transport with neural networks. eLife. 9, e52224(2020).
  24. Araki, Y., et al. Novel cadherin-related membrane proteins, Alcadeins, enhance the X11-like protein-mediated stabilization of amyloid beta-protein precursor metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 278 (49), 49448-49458 (2003).
  25. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nature Protocols. 1 (2), 695-700 (2006).
  26. Tosolini, A. P., Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Expanding the toolkit for in vivo imaging of axonal transport. Journal of Visualized Experiments. (178), e63471(2021).
  27. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  28. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  29. Basu, H., Ding, L., Pekkurnaz, G., Cronin, M., Kymolyzer Schwarz, T. L. a semi-autonomous kymography tool to analyze intracellular motility. Current Protocols in Cell Biology. 87 (1), 107(2020).
  30. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319 (5866), 1086-1089 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.