$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Сложный глаз мухи является важной биологической модельной системой для выяснения фундаментальных биологических механизмов. Некоторые из механизмов, которые были изучены с использованием этой системы, включают следующее: сложное зрение глаза с почти панорамным полем зрения1; биофизика, сборка белка и биогенез светочувствительного рецептора, сопряженного с G-белком 2,3,4; фосфолипазная Cβ-опосредованная система передачи сигнала 5,6; Активация и модуляция канала TRP в нативных тканях 5,6; сборка и функционирование мультибелкового сигнального комплекса 7,8; молекулярная структура, биохимия и функция инозитол-фосфолипидной рециркуляции 9,10; и сигнально-опосредованная субклеточная транслокация сигнальных белков11,12. Уникальная анатомическая структура и оптика сложного глаза мухи были тщательно изучены, что позволило выявить фундаментальные механизмы развития и зрительные возможности.
Данный сборник методов включает в себя работы ведущих ученых, которые разработали и усовершенствовали методы изучения некоторых из указанных механизмов в глазу мухи. Muñoz et al. описывают метод количественного анализа оптического расположения глаза мухи, который обеспечивает точное изображение сложного глаза и его пространственной организации13. Этот метод необходим для детального изучения нейронной обработки визуальной информации. Важно отметить, что было предпринято много попыток создать искусственные глаза, вдохновленные биологией, и они основывались на количественных исследованиях существующих сложных глаз. Вагнер и др. используют глубокий псевдозрачок, уникальное оптическое явление сложного глаза, и высокоамплификационную микроскопию с оптической нейтрализацией роговицы для локализации белков, меченных eGFP, в клетках фоторецепторов дрозофилы 14. Этот метод позволяет обнаружить структурные дефекты в рабдомерах, обусловленные дегенерацией фоторецепторов и клеточной локализацией и транспортировкой важных сигнальных белков. Гуторов и др. используют электрофизиологические измерения всего глаза или отдельных фоторецепторных клеток для измерения уровня фотопигментных состояний in vivo и их модуляции специфическими мутациями в сигнальныхбелках. Этот метод использует смещения заряда в визуальном пигментном состоянии (R), вызванном поглощением фотонов, что приводит к образованию второго пигментного состояния, стабильного в темноте (M). В дополнительном методе используется длительная деполяризация после выключения света (PDA), которая использует темные бистабильные свойства зрительного пигмента и различия в спектрах поглощения R и M состояний мухи. Поскольку ОАП зависит от преобразования большого количества фотопигмента, даже малейший дефект в биогенезе фотопигмента может привести к легко обнаруживаемому аномалии ОАП. Действительно, мутанты дрозофилы, демонстрирующие аномальный ОАП, привели к открытию новых сигнальных белков. Выдающимся примером этого является открытие нового белкового комплекса, состоящего из инактивации белка скаффолда, но без послепотенциального D (INAD), глазоспецифичной протеинкиназы C (eyePKC), фосфолипазы Cβ (PLCβ) и канала транзиторного рецепторного потенциала (TRP). Впервые Лю и др. представили метод очистки16-го канала TRP дрозофилы. В этом модифицированном методе аффинной очистки используется конкурентная стратегия, основанная на механизме сборки сигнального комплекса INAD. Эта стратегия обеспечивает очистку эндогенного канала TRP. Согласно этому методу, сначала фрагмент PLCβ, связанный с Ni-гранулами, помечается гистидином и используется для снижения эндогенного белкового комплекса INAD, полученного из гомогенатов головы дрозофилы. Затем фрагменты TRP, помеченные чрезмерно очищенной глутатион-S-трансферазой (GST), добавляются к Ni-гранулам, чтобы конкурировать с эндогенным каналом TRP, связанным с INAD. Наконец, для отделения помеченных фрагментов TRP-канала в надосадочной жидкости от эндогенного TRP-канала используется эксклюзионная хроматография. Panda et al. сообщают о чувствительном методе идентификации и количественного определения нескольких классов липидов в клетках фоторецепторов дрозофилы с использованием масс-спектрометрии17. Активация PLCβ имеет решающее значение для фототрансдукции, так как это приводит к гидролизу фосфатидилинозитола 4,5 бисфосфата (PI(4,5)P2) в поверхностной мембране. Такая реакция в конечном итоге приводит к активации канала TRP. Кроме того, активность PLCβ приводит к образованию многих видов липидов. Было высказано предположение, что некоторые из этих липидных форм могут принимать участие в активации TRP и играть ключевую роль в функциональной организации фоторецепторов для оптимизации сенсорной трансдукции. В исследовании Panda et al.17 эти результаты были оценены путем выделения мутантов дрозофилы, содержащих дефектные ферменты, которые контролируют уровни специфических липидов.
Сложный глаз мухи является полезной экспериментальной системой для выяснения фундаментальных механизмов в биологии. Мощная генетическая методология, разработанная у дрозофилы , может быть использована для анализа и открытия сигнальных белков, участвующих в фототрансдукции мух. В этой коллекции методов подробно описываются основные методы исследования фундаментальных механизмов зрения мух, включая анатомический и оптический анализ сложного глаза, а также молекулярных компонентов и биохимических реакций фоторецепторных клеток. Видеостатьи также содержат важные советы о трудностях, присущих этим методологиям. Эта коллекция методов также должна быть полезна ученым за пределами этой области исследований, поскольку эти методы могут быть адаптированы к другим биологическим препаратам.