Method Article

Разработка ПЭТ-индикатора D-пептида, меченного 68галлием, для визуализации экспрессии запрограммированного лиганда смерти 1

DOI:

10.3791/65047

⸱

February 3rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 2State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Department of Advanced Nuclear Medicine Sciences, Institute for Quantum Medical Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, 4Department of Pharmacy, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании был разработан неинвазивный метод в режиме реального времени для оценки распределения запрограммированного лиганда смерти 1 во всем организме, основанный на позитронно-эмиссионной томографии антагониста D-додекапептида [68Ga]. Этот метод имеет преимущества по сравнению с обычной иммуногистохимией и повышает эффективность выявления подходящих пациентов, которым будет полезна терапия блокады контрольных точек иммунного ответа.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка терапии блокады контрольных точек иммунного ответа на основе белка программируемой клеточной смерти 1 (PD-1)/лиганда запрограммированной смерти 1 (PD-L1) произвела революцию в терапии рака в последние годы. Тем не менее, только часть пациентов реагирует на ингибиторы PD-1/PD-L1 из-за гетерогенной экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках. Эта гетерогенность представляет собой проблему точного обнаружения опухолевых клеток с помощью широко используемого иммуногистохимического (ИГХ) подхода. Эта ситуация требует более совершенных методов стратификации пациентов, которым будет полезна терапия блокады контрольных точек иммунного ответа, для повышения эффективности лечения. Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) позволяет в режиме реального времени визуализировать экспрессию PD-L1 по всему телу неинвазивным способом. В связи с этим возникла необходимость в разработке радиомеченных индикаторов для выявления распределения PD-L1 в опухолях с помощью ПЭТ-визуализации.

По сравнению со своими L-аналогами, декстровращающие (D)-пептиды обладают такими свойствами, как протеолитическая резистентность и значительно более длительный метаболический период полувыведения. В этом исследовании был разработан новый метод обнаружения экспрессии PD-L1 на основе ПЭТ-визуализации 68меченых Ga-меченым PD-L1 D-пептида, антагониста D-додекапептида (DPA), у мышей с опухолями. Результаты показали, что [68Ga]DPA может специфически связываться с опухолями, гиперэкспрессирующими PD-L1 in vivo, и показали благоприятную стабильность, а также отличную способность к визуализации, что позволяет предположить, что [68Ga]DPA-PET является перспективным подходом для оценки статуса PD-L1 в опухолях.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Открытие белков контрольных точек иммунного ответа стало прорывом в терапии опухолей и привело к значительному прогрессу в разработке терапии блокады контрольных точек иммунногоответа. Белок программируемой клеточной смерти 1 (PD-1) и лиганд запрограммированной смерти 1 (PD-L1) являются потенциальными мишенями для лекарств с несколькими антителами, одобренными Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA). PD-1 экспрессируется инфильтрирующими опухоль иммунными клетками, такими как CD4+, CD8+ Т-клетки и регуляторные Т-клетки. PD-L1 является одним из лигандов PD-1, который гиперэкспрессируется в различных опухолевых клетках 2,3. Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 инактивирует PD-1, тем самым подавляя противоопухолевый иммунный ответ4. Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование PD-L1 может улучшить киллинговый эффект иммунных клеток и устранить опухолевыеклетки. В настоящее время хромогенная иммуногистохимия (ВПХ) является наиболее часто используемым подходом для выявления пациентов, которые с наибольшей вероятностью ответят на терапию контрольными точками иммунного ответа 6,7. Однако из-за гетерогенной экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках результаты биопсии ВПХ не могут дать точную информацию об экспрессии PD-L1 у пациентов8. Предыдущие исследования показали, что только 20-40% пациентов получают долгосрочную пользу от терапии блокадой контрольных точек иммунного ответа 1,9,10. Таким образом, существует острая необходимость в разработке нового метода обхода ложноотрицательных результатов, вызванных гетерогенной экспрессией этих белков контрольных точек иммунного ответа.

Технология молекулярной визуализации, такая как позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), позволяет визуализировать все тело в режиме реального времени неинвазивным способом и, таким образом, может превзойти традиционный метод ИГХ 11,12,13. Радиоактивно меченные антитела, пептиды и малые молекулы являются перспективными индикаторами для мониторинга экспрессии PD-L1 у онкологических больных 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило три терапевтических моноклональных антитела PD-L1: авелумаб, атезолизумаб и дурвалумаб26. Иммуно-ПЭТ-индикаторы на основе этих антител были хорошо задокументированы 27,28,29,30,31,32. Ранние фазы клинических испытаний выявили ограниченную ценность для клинического применения из-за неблагоприятной фармакокинетики30. По сравнению с антителами, пептиды демонстрируют более быстрый вывод крови и органов из здоровых органов и могут бытьлегко химически модифицированы. Сообщалось о нескольких пептидах с высоким сродством к PD-1/PD-L12; WL12 является пептидом, который демонстрирует специфическое связывание с PD-L134. Радиомеченные индикаторы [64Cu]WL12, [68Ga]WL12 и [18F]FPyWL12 демонстрируют высокую in vivo специфическую способность к нацеливанию на опухоль, что позволяет получать высококачественные изображения экспрессии PD-L1 в опухолях 26,35,36,37. Более того, первая оценка на людях радиоактивно меченного WL12 продемонстрировала, что [68Ga]WL12 (хелатированный NOTA) обладает безопасным и эффективным потенциалом для клинической визуализации опухолей38. Из-за своей высокой гидрофобности и высокого поглощения здоровой печенью WL12 имеет ограниченное клиническое применение. Другие радиомечущие пептиды, такие как TPP1 и SETSKSF, которые специфически связываются с PD-L1, также показали потенциальную стабильность и специфичность для визуализации экспрессии PD-L1 во всем теле39,40. Однако немодифицированные пептиды легко расщепляются протеазами и быстро метаболизируются почками. Правовращающие(D)-пептиды широко используются в качестве эффективных медиаторов из-за плохой стабильности левосторонних (L)-пептидов 41,42,43. D-пептиды гиперустойчивы к протеолитическому разложению и имеют значительно более длительный метаболический период полувыведения. По сравнению со своими L-аналогами, D-пептиды в основном проявляют специфическую связывающую способность 44,45,46.

В этом исследовании был разработан новый метод обнаружения экспрессии PD-L1, основанный на ПЭТ-визуализации 68Ga-меченого PD-L1-таргетированного D-пептида, антагониста D-додекапептида (DPA), в мышиной модели47 с опухолью. Стабильность [68Ga]DPA была впервые изучена в фосфатно-солевом буфере (PBS) и сыворотке крови мышей, после чего было проверено сродство связывания [68Ga]DPA в опухолях с гиперэкспрессией PD-L1. После этого была проведена ПЭТ-визуализация на моделях ксенотрансплантатов глиобластомы, чтобы подтвердить, является ли [68Ga]DPA идеальным ПЭТ-индикатором для мониторинга экспрессии PD-L1 в опухолях. Сочетание ПЭТ-визуализации и ДПА не только обеспечивает новый подход к преодолению проблем, связанных с гетерогенной экспрессией PD-L1, но и закладывает основу для разработки радиоиндикаторов на основе D-пептида.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедуры экспериментов на животных были одобрены Комитетом по этике животных Нанкинского медицинского университета или Национальными институтами квантовой науки и технологии. Эксперименты на мышах проводились строго в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Синтез пептидов

  1. Набухают 100 мг смолы 4-метилбензидриламина (MBHA) (нагрузочная способность 0,37 ммоль/г) в 1 мл N-метил-2-пирролидона (NMP) в течение 30 мин при слабом барботированииN2.
  2. Приготовьте свежий бульонный буфер, состоящий из защищенных Fmoc аминокислот (5,0 экв.), HCTU (4,9 экв.) и DIPEA (10,0 экв.) в 1 мл NMP и добавьте в смолу (100 мг). Дайте реакции сцепления протекать в течение 1,5-2 ч.
  3. Приготовьте буфер для снятия защиты, состоящий из 50% морфолина в NMP. Промывайте смолу (100 мг) 2 x 30 мин с 1 мл буфера для защиты в каждой промывке, чтобы удалить группу Fmoc на аминной группе. Промойте смолу дихлорметаном (DCM; 1 мл) в течение 1 мин, удалите DCM и повторно промойте смолу NMP (1 мл) еще 1 мин. Затем снимите NMP и повторно промойте смолу DCM в течение 1 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры промывки проводятся при мягком пузырьке N2 . Вышеописанные процедуры повторяют до последней аминокислоты.
  4. Для добавления 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (ДОТА) к пептиду предварительно активируйте DOTA N-(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодиимида гидрохлорид (EDC· HCl) и N-гидроксисукцинимид (NHS). Инкубация биржевого буфера DOTA/EDC· HCl/NHS в молярном соотношении 1:1:1 в диметилсульфоксиде (ДМСО) в течение 3 ч, с конечной концентрацией DOTA 1 М. Затем добавьте бульонный буфер (1 мл) к смоле (100 мг) и дайте реакции продолжаться в течение 2 ч с мягким барботированиемN2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1,4,7-триазациклонан-1,4,7-триуксусная кислота (NOTA) также может быть использована в качестве хелатора для комплексообразования 68Ga. Те же процедуры могут быть использованы для соединения NOTA.
  5. Тщательно промойте смолу сверху с помощью DCM и одновременно примените вакуум, чтобы удалить остаточный реакционный раствор. Промойте смолу 3 раза с помощью DCM (1,5 мл), а затем смойте MeOH (1,5 мл), чтобы смола дала усадку. Поместите смолу под азот на ночь или под высокий вакуум не менее чем на 4 часа, пока смола не высохнет.
  6. Поместите высушенную пептидсодержащую смолу DPA в полипропиленовый контейнер объемом 2 мл с завинчивающейся крышкой. Добавьте соответствующий коктейль для расщепления (95/2,5/2,5 TFA/TIS/H2O в объеме; 1 мл/100 мг смолы) и плотно закройте контейнер завинчивающейся крышкой. Осторожно перемешайте реакцию на орбитальном шейкере в вытяжном шкафу при температуре 20-25 °C в течение 2 ч.
    ВНИМАНИЕ: Готовьте трифторуксусную кислоту (ТЖК) в вытяжном шкафу, надев защитную одежду из-за ее высокой коррозионной природы.
  7. Удалите большую часть ТЖК путем испарения под азотом в вытяжном шкафу. Осаждают пептиды, добавляя диэтиловый эфир (~1,5 мл/100 мг смолы).
  8. Смешайте смесь для растирания пептидов и центрифугируйте при комнатной температуре (10 000 × г, 5 мин). Осторожно вылейте растворитель из емкости. Повторите шаги 1.7-1.8.
  9. Остатки высушить на воздухе в открытой емкости в течение 10 минут. Добавьте 50% (об./об.) водного ацетонитрила и встряхивайте в течение 1-2 с для растворения продуктов (1 мл/100 мг смолы).
  10. Удалите смолу, процедив смесь, а затем промойте смолу 2 раза, используя 0,2 мл 50% (об./об.) водного ацетонитрила. Смешайте фильтраты для высокоэффективной очистки с помощью жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Используйте следующие условия ВЭЖХ. Колонна: YMC-Triat-C18 (внутренний диаметр 4,6 мм, 150 мм, 5 мм); градиент растворителя: растворитель А-деионизированная вода; растворитель В-ацетонитрил (0,1% ТЖК); время течения: 20 мин, с ацетонитрилом от 10% до 90%; Скорость потока: 1 мл/мин.
  11. Собранные элюенты ВЭЖХ замораживают на ночь при -80 °C и лиофилизируют (-50 °C и <1 Па). Для радиоактивного мечения растворяют твердый пептид в буфере из ацетата натрия (100 мМ, рН 5,0) в конечной концентрации 1 мг/мл в качестве исходного буфера.

2. Радиомаркировка 68Ga

ПРИМЕЧАНИЕ 68Ga был сгенерирован в Первой больнице Нанкина (Нанкин, Китай) с использованием генератора 68Ge/68Ga.

  1. Пипетку 5 мкл буфера для заготовки в полипропиленовый контейнер объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой. Добавьте в контейнер 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 мкл).
  2. Перемешайте смесь в течение 5 с. Измерьте рН с помощью тест-полосок. Отрегулируйте pH до 4-4,5 с NaOH (0,1 M).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий pH имеет решающее значение для комплексообразования между 68Ga и DOTA.
  3. Выдерживают раствор при комнатной температуре 5-10 мин. Подвергнуть реакционную смесь радио-ВЭЖХ для анализа выхода радиомечения в следующих условиях: колонка: YMC-Triat-C18 (внутренний диаметр 4,6 мм, 150 мм, 5 мм); градиент растворителя: растворитель А-деионизированная вода; растворитель В-ацетонитрил (0,1% ТЖК); время течения: 20 мин, с ацетонитрилом от 10% до 90%; Скорость потока: 1 мл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Радиотонкослойная хроматография (ТСХ) может быть использована в качестве альтернативного подхода к изучению выхода радиомечения. Рекомендуемый буфер для элюирования ТСХ составляет 0,1 M Na3C6H5O7, pH 4.

3. Испытание на стабильность трассировщика

  1. Тест на стабильность трассировщика в PBS
    1. Добавьте [68Ga]DPA (10 мкл, 3,7 МБк, в NaOAc) к PBS (990 мкл). Инкубируют при 37 °C в течение 1, 2 и 4 ч при легком перемешивании.
    2. Собирайте по 200 мкл раствора в каждый момент времени. Введите его в радио-ВЭЖХ для анализа.
  2. Стабильность индикаторов в сыворотке крови мышей
    1. Добавьте [68Ga]DPA (10 мкл, ~3,7 MBq, в NaOAc) в сыворотку мышей (90 мкл, свежеприготовленная). Инкубируют при 37 °C в течение 1, 2 и 4 ч при легком перемешивании.
    2. Собирайте по 20 мкл раствора в каждый момент времени. Добавьте MeCN и воду (100 мкл, 1:1, v/v).
    3. Центрифужируют смесь в течение 10 мин (5 000 × г, 25 °C). Анализ надосадочной жидкости с помощью радио-ВЭЖХ.

4. Анализ экспрессии PD-L1 методом проточной цитометрии

  1. Приготовьте питательную среду, добавив среду RPMI-1640 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицин (об./об.). Ресуспендируйте клетки U87MG в питательной среде и засевайте в 12-луночные планшеты при плотности10-5 клеток/лунку. Поместите клетки в инкубатор (5% CO2, 37 °C) и культивируйте не менее 24 ч, не беспокоя.
  2. Промойте клетки 0,5 мл PBS и добавьте 250 мкл трипсина-ЭДТА (0,25%). Поместите клетки обратно в инкубатор (5% CO2, 37 °C) на 2 минуты.
  3. Добавьте 1 мл питательной среды, чтобы остановить диссоциацию клеток. Добавьте среду в клетки, чтобы отделить их от посуды путем пипетирования вверх и вниз, и собрать их в пробирки по 1,5 мл. Центрифугируют клетки в течение 5 мин (100 × г).
  4. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл PBS. Центрифугируют клетки в течение 5 мин (100 × г). Повторите этот шаг еще раз.
  5. Флуоресцеин-изотиоцианат (FITC)-конъюгированное антитело PD-L1 с 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA) до 20 нмоль/л. Добавляют к клеткам и инкубируют при 4 °C в течение 1 ч.
  6. Центрифугируют клетки в течение 5 мин (100 × г) с последующей промывкой холодным ПБС дважды. Анализ PD-L1-положительных клеток с помощью проточного цитометра и аналитического программного обеспечения.

5. Иммуноцитохимия

  1. Высевают клетки U87MG в чашки для культивирования клеток со стеклянным дном (35 мм) при плотности 2,5 × 105 клеток на лунку. При достижении 60% слияния проводят аспирацию питательной среды и добавляют 1 мл PBS. Аккуратно встряхните несколько раз и аспирируйте. Выполните этап стирки 3 раза.
  2. Добавьте в посуду 500 мкл 4% параформальдегида. Поместите клетки при комнатной температуре и зафиксируйте на 30 минут.
  3. Промойте клетки 3 раза с помощью PBS. Добавьте 1 мл 3% BSA (масс./об., в PBS) и заблокируйте неподвижные ячейки на 2 ч при комнатной температуре.
  4. Удалите 3% BSA и непосредственно инкубируйте клетки с первичными антителами к PD-L1 (mAb, 1:100, разбавленные 3% BSA) в течение ночи при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После блокировки ячеек БСА не промывать ПБС.
  5. Промойте клетки 3 раза 3% буфером BSA. Инкубируют клетки с FITC-конъюгированными вторичными антителами IgG Fc (1:500, разведенные в PBS) в течение 1 ч.
  6. Промойте клетки 3 раза с помощью PBS. Добавьте 0,5 мл DAPI (1 мкг/мл) к клеткам и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч. Промыть окрашенные клетки 3 раза PBS и наблюдать с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа.

6. Эксперимент по клеточному поглощению и ингибированию

  1. Эксперимент по клеточному поглощению
    1. Культивирование клеток U87MG в 12-луночных планшетах до достижения 80% слияния. Удалите средство и промойте ячейки 0,5 мл PBS.
    2. Разбавьте [68Ga]DPA в свежей среде до концентрации 74 KBq/мл. Добавьте 0,5 мл разбавленного буфера [68Ga]DPA в каждую лунку.
    3. Инкубируют клетки с [68Ga]DPA при 37 °C в течение разной продолжительности (10, 30, 40 и 120 минут). Аспирируйте среду с помощью пипетки. Промойте клетки PBS (0,5 мл) три раза.
    4. Добавьте раствор NaOH (0,5 М, 300 мкл на лунку) для лизировки клеток. Через 30 с соберите вязкие клеточные лизаты в пробирки по 1,5 мл.
    5. Дважды вымойте планшет 0,4 мл PBS. Соберите промывочный раствор в вышеуказанную пробирку объемом 1,5 мл.
    6. Запустить встроенный компьютер автоматического гамма-счетчика; Поместите тюбики во встроенную полку. После загрузки всех образцов на конвейер нажмите кнопку СТАРТ. Результаты рассчитываются во внутреннем программном обеспечении. Считывание записывает коррелированное количество в минуту (CPM) каждой пробирки.
  2. Конкурентный анализ связующего
    1. Культивирование клеток U87MG в 12-луночных планшетах до достижения 80% слияния. Удалите средство и промойте ячейки 0,5 мл PBS.
    2. Разбавляют [68Ga]DPA в свежей среде до концентрации 74 КБк/мл. Растворите соответствующее количество соединений BMS202 в 10% ДМСО до получения концентрации 10 мМ (400 мкл).
    3. Разбавьте 4 мкл 10 мМ BMS202 в 396 мкл PBS до получения концентрации 100 мкМ. Повторите этот шаг, чтобы получить различные концентрации BMS202 (1 мкМ, 10 нМ, 100 пМ и 1 пМ).
    4. Добавьте 0,5 мл разбавленного буфера [68Ga]DPA в каждую лунку (0,37 MBq на лунку). Добавьте 5 мкл раствора BMS202 в каждую лунку (по три лунки для каждой концентрации). Инкубируют клетки в клеточном инкубаторе при температуре 37 °C в течение 120 мин.
    5. Аспирируйте среду с помощью пипетки. Промойте клетки 3 x 0,5 мл PBS.
    6. Добавьте раствор NaOH (0,5 М, 300 мкл на лунку) для лизиса клеток. Через 30 с соберите вязкоклеточные лизаты в пробирки по 1,5 мл. Вымойте планшет 2 x 0,4 мл PBS.
    7. Соберите промывочный раствор в вышеуказанную пробирку объемом 1,5 мл. Поместите пробирки во встроенную полку автоматического гамма-счетчика.
    8. Выполните те же процедуры, что и на шаге 6.1.6.

7. Позитронно-эмиссионная томография

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте ПЭТ-визуализацию мелких животных с помощью микро-ПЭТ-сканера, который обеспечивает 159 поперечных осевых срезов, расположенных на расстоянии 0,796 мм друг от друга (от центра к центру), с горизонтальным полем зрения 10 см и осевым полем зрения 12,7 см. Все данные, собранные в режиме списка, организованы в трехмерные синограммы. Затем Фурье собирается в двумерные синограммы (кадр × мин.: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).

  1. В этом исследовании использовали голых мышей BALB/C мужского пола в возрасте 5-8 недель. Соберите клетки U87MG, выполнив шаги 4.1-4.4, и аспирируйте клетки в шприц объемом 0,5 мл. Подкожно вводят клетки мышам (1 × 106 клеток на опухоль, две опухоли на мышь). Контролируйте рост опухоли после инъекции до тех пор, пока объем опухоли не составит 100-300мм3.
  2. Обезболивайте мышей 1%-2% (v/v) изофлураном (1 мл/мин). Включите нагревательный прибор и держите подстилку животного из ПЭТ при температуре 37 °C.
  3. Поместите мышей под наркозом в правильное положение на подстилку животного ПЭТ-аппарата. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
    ВНИМАНИЕ: Держите мышей в положении лежа, чтобы избежать смерти во время сканирования. В течение всего процесса визуализации вводите поток изофлурана (1,0 мл/мин) через нос с помощью предварительно установленной трубки.
  4. Отрегулируйте положение лежанки животного с помощью панели управления. Вводят индикаторы (10-17 MBq/100-200 мкл) внутривенно через предварительно установленный катетер для хвостовой вены.
  5. Создание рабочего процесса сканирования на главном компьютере с помощью указанного программного обеспечения (см. Таблицу материалов) Создайте учебную папку и установите протокол сбора данных в соответствии с протоколом производителя. Выполняйте динамическое сканирование (60 минут для каждой мыши) на всех мышах в режиме 3D-списка.
  6. Определите протокол гистограммы и протокол реконструкции в соответствии с протоколом производителя. Используйте фильтр Хэннинга с отсечкой по Найквисту 0,5 цикла/пиксель для реконструкции динамических изображений ПЭТ (25-30 мин и 55-60 мин) с помощью фильтрованной обратной проекции. Генерация проекционных изображений максимальной интенсивности (MIP) для всех мышей.
  7. Объедините протоколы в рабочий процесс и запустите его. Проанализируйте полученные трехмерные изображения с помощью программного обеспечения, следуя протоколу производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте программное обеспечение для моделирования для выбора интересующих объемов. Радиоактивность корректируется с поправкой на время инъекции и представляется в виде процента от общей дозы инъекции на грамм ткани (% ID/г).

8. Биораспределение ex vivo

  1. Вводят [68Ga]DPA (1,85 MBq/100 мкл) голым мышам BALB/C, содержащим U87MG, через инъекцию в хвостовую вену. Обезболивайте мышей с помощью 1%-2% (v/v) изофлурана (1 мл/мин), затем жертвуйте трех мышей через вывих шейки после инъекции в течение 5, 30, 60 и 120 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лица, демонстрирующие эту процедуру, должны быть обучены техническим навыкам вывиха шейки матки, чтобы обеспечить быструю потерю сознания. Это гарантирует, что все процедуры эвтаназии в этом эксперименте будут выполнены гуманно.
  2. После того, как смерть будет подтверждена, вскройте грудную стенку мышей. Затем откройте сердце. Используйте шприц объемом 1 мл для забора крови; выдавить кровь из шприца в пробирку для радиоиммунного анализа (РИА) (диаметром 13 мм) для гамма-счетчика.
  3. Иссеките основные органы и опухоли и поместите их в пробирки РИА (диаметром 13 мм) для гамма-счетчика. Основные органы включают общую кровь, сердце, тимус, печень, селезенку, кости, желудок, почки, мышцы, кишечные лимфатические узлы, тонкую кишку, поджелудочную железу, яички, мозг и легкие. Взвесьте все органы.
  4. Измерьте радиоактивность в собранных органах с помощью автогамма-счетчика и скорректируйте значения по затуханию. Рассчитайте процент введенной дозы на грамм влажной ткани (% ID/г).

9. Иммуногистохимия

  1. Соберите ткани глиомы и промойте их 3 раза PBS. Положите свежие салфетки в 4% параформальдегид и зафиксируйте на ночь при температуре 4 °C.
  2. Заделайте неподвижные ткани в парафин и разрежьте их до толщины 10 мкм. Поместите срезы в инкубатор (60 °C) и инкубируйте в течение 2 ч. Удалите и увлажните срезы, инкубируя в течение 10 минут каждый в следующих средах: ксилол (дважды), абсолютный спирт, 95% спирт, 90% спирт, 80% спирт, 75% спирт.
  3. Поместите срезы в 0,01 М цитрата натрия и нагрейте их до 92-95 °С. Поддерживайте температуру в течение 40 минут для получения антигена.
  4. Добавить 200 мкл раствораН2О2(3%) к срезам и инактивировать эндопероксидазы в течение 10 мин при комнатной температуре. Блокируют неспецифические участки обработкой 3% БСА в течение 2 ч при комнатной температуре.
  5. Инкубируют срезы в первичных антителах к PD-L1 (мАТ, 1:100, разбавленные 3% БСА) в течение ночи при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После блокировки BSA не мойте PBS.
  6. Промойте срезы 3 раза с помощью PBS. Инкубируют срезы с мечеными HRP вторичными антикроличьими антителами к козам (1:500, разведенные в PBS) при комнатной температуре в течение 1 ч.
  7. Промойте клетки 3 раза с помощью PBS. Добавьте 200 мкл рабочего раствора 3,3-диаминобензидина (DAB) (раствор А: раствор Б: раствор С = 1:1:18) к срезам и инкубируйте в течение 5 мин в темноте.
  8. Промойте срезы 3 раза с помощью PBS. Добавить 500 мкл раствора гематоксилина (100%) и инкубировать 5 мин при комнатной температуре. Промыть срезы водой в течение 30 с. Поместите срезы в дифференцирующий раствор (75% спирт:HCL = 99:1) на 30 с. Промойте срезы водой в течение 1 мин.
  9. Обезвоживают образцы путем последовательной инкубации с 75% спиртом, 80% спиртом, 90% спиртом, 95% спиртом, абсолютным спиртом и ксилолом (дважды) (по 10 мин каждый). Смонтируйте все секции с помощью нейтральной смолы и рассмотрите их под оптическим микроскопом.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

[68Ga]Радиомаркировка и стабильность DPA
Модельный пептид DPA является эффективным антагонистом PD-L1. DOTA-DPA получен с чистотой >95% и выходом 68%. Масса DOTA-DPA экспериментально наблюдается на уровне 1 073,3 ([M+2H]2+). до 68Галлий считается подходящим радионуклидом для мечения пептидов для ПЭТ-визуализации, поэтому был выбран для данного исследования. Для радиомечения DPA с 68Ga (период полувыведения: 68 мин) синтез...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важнейшие этапы, описанные в этом методе, включают эффективное мечение 68Ga в DPA и выбор подходящего временного окна для ПЭТ-визуализации, которое должно идеально соответствовать фармакодинамической картине DPA в опухоли.

В отличие от ИГХ, ПЭТ-визуализация позволяет в режиме реального времени обнаруживать экспрессию PD-L1 по всему телу неинвазивным способом, позволяя визуализировать каждую положительную область в гетерогенной опухоли 6,7

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конкурирующие интересы не декларируются.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Некоммерческим фондом Центрального научно-исследовательского института Китайской академии медицинских наук (No 2022-RC350-04) и Инновационным фондом медицинских наук CAMS (No 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 и 2022-I2M-2-002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота (DOTA)Merck60239-18-168Ga  хелатирование
3,3-диаминобензидина (DAB) НаборSigma-AldrichD7304-1SETИммуногистохимия
анти-PD-L1 моноклональное антителоWuhan Proteintech17952-1-apИммуногистохимия: первичное антитело
BMS202Selleck1675203-84-5Анализ конкурентного связывания: ингибитор
BSAMerckV900933Иммунофлуоресцентный: блокирующий 
DAPIMerckD9542Иммунофлуоресцентный: окрашивание ядра
Дихлорметан (DCM)Merck34856Растворитель
DIPEAMerck3439Пептидная муфта
EDC· HClMerckE6383Активация DOTA
FBSGibco10099Клеточная культура: добавка
FITC-конъюгированное антитело против человеческого IgG Fc антителоBiolegend409310Иммунофлуоресцентное: вторичное антитело
FITC-конъюгированное антитело против PD-L1 антителоBiolegend393606Проточная цитометрия: прямое антитело
HCTUEnergy ChemicalE070004-25 гПептидное связывание
HRP меченое козье антитело против кроликаServicebioGB23303Иммуногистохимия: вторичное антитело
Гидроксисукцинимид (NHS)Merck130672Активация DOTA
MeCNMerckPHR1551растворителем
МорфолинMerck8.06127Fmoc- дезащита
NMPMerck8.06072Сольвент
ПараформальдегидMerck30525-89-4Фиксация тканей
PBSGibco10010023Клеточная культура: буфер
Пенициллин-стрептомицин Gibco10378016Клеточная культура: добавка
RIA пробиркаPolyLabP10301AВ качестве контейнера для образца ткани
RPMI-1640 средаGibco11875093Клеточная культура: основная среда
ацетат натрияMerck1.06264Соль для буфера
Trypsin-EDTAGibco25200056Клеточная культура: агент диссоциации
U87MG клеточная линияProcell Life Science & Технология CoCL-0238Модель ячейки
Equipment
68Ge/68Ga генераторIsotope Technologies Мюнхен, ITMНе применимоГенерация [68Ga]
Счетчик автогаммаPerkin Elmer Мастер2Детектирование радиоактивности
Конфокальная флуоресцентная микроскопияКейенсНаблюдение за результатами иммунофлуоресценции
Проточный цитометрБектон Дикинсон, Б.Д.LSRIIМониторинг PD-L1-положительных клеток
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)SHIMAZULC-20AT Очистка пептида DPA
ПЭТ-сканерSiemens Medical SolutionsInveon MultiModality SystemПЭТ визуализация
Оптическая микроскопияNikon Eclipse E100Наблюдение за результатами иммуногистохимии
Синтезатор твердофазных пептидовPromega Vac-Man Laboratory Vacuum ManifoldLOT#11101Синтез пептида DPA-DOTA
Software
ASIProSiemens Medical SolutionsНе применимоАнализ результатов ПЭТ-КТ
FlowJoBecton Dickinson, BDFlowJo 7.6.1Анализ результатов проточного цитометра
Inveon Acquisition Workplace (IAW)Siemens Medical SolutionsНеприменимо Управление ПЭТ мехиновой
призмойGraphpadPrism 8.0Анализ данных 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
  2. Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747(2022).
  3. Topalian, S. L., Drake, C. G., Pardoll, D. M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 27 (4), 450-461 (2015).
  4. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  5. Xiao, Z., et al. PEIGel: A biocompatible and injectable scaffold with innate immune adjuvanticity for synergized local immunotherapy. Materials Today Bio. 15, 100297(2022).
  6. Teng, M. W. L., Ngiow, S. F., Ribas, A., Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Research. 75 (11), 2139-2145 (2015).
  7. Dolled-Filhart, M., et al. Development of a companion diagnostic for pembrolizumab in non-small cell lung cancer using immunohistochemistry for programmed death ligand-1. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 140 (11), 1243-1249 (2016).
  8. Meng, X. J., Huang, Z. Q., Teng, F. F., Xing, L. G., Yu, J. M. Predictive biomarkers in PD-1/PD-L1 checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Treatment Reviews. 41 (10), 868-876 (2015).
  9. Hakozaki, T., Hosomi, Y., Kitadai, R., Kitagawa, S., Okuma, Y. Efficacy of immune checkpoint inhibitor monotherapy for patients with massive non-small-cell lung cancer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 146 (11), 2957-2966 (2020).
  10. Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the percentage of US patients with cancer who are eligible for and respond to checkpoint inhibitor immunotherapy drugs. Jama Network Open. 2 (5), 192535(2019).
  11. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (7), 591-607 (2008).
  12. Zhang, L., et al. Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (2), 373-393 (2021).
  13. Sun, J., et al. Imaging-guided targeted radionuclide tumor therapy: From concept to clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 190, 114538(2022).
  14. Xu, M., et al. Preclinical study of a fully human Anti-PD-L1 antibody as a theranostic agent for cancer immunotherapy. Molecular Pharmaceutics. 15 (10), 4426-4433 (2018).
  15. Niemeijer, A. N., et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nature Communications. 9 (1), 4664(2018).
  16. Mayer, A. T., et al. Practical immuno-PET radiotracer design considerations for human immune checkpoint imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (4), 538-546 (2017).
  17. Lv, G., et al. PET Imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. Journal of Nuclear Medicine. 61 (1), 117-122 (2020).
  18. Li, D., et al. Immuno-PET imaging of 89Zr labeled anti-PD-L1 domain antibody. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1674-1681 (2018).
  19. Lesniak, W. G., et al. PD-L1 detection in tumors using [(64)Cu]Atezolizumab with PET. Bioconjugate Chemistry. 27 (64), 2103-2110 (2016).
  20. Kristensen, L. K., et al. CD4(+) and CD8a(+) PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics. 9 (26), 8221-8238 (2019).
  21. Christensen, C., Kristensen, L. K., Alfsen, M. Z., Nielsen, C. H., Kjaer, A. Quantitative PET imaging of PD-L1 expression in xenograft and syngeneic tumour models using a site-specifically labelled PD-L1 antibody. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 47 (5), 1302-1313 (2020).
  22. Bensch, F., et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response to PD-L1 blockade in cancer. Nature Medicine. 24 (12), 1852-1858 (2018).
  23. Gonzalez Trotter, D. E., et al. In vivo imaging of the programmed death ligand 1 by 18F PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1852-1857 (2017).
  24. Lv, G., et al. Promising potential of a 18F-labelled small-molecular radiotracer to evaluate PD-L1 expression in tumors by PET imaging. Bioorganic Chemistry. 115, 105294(2021).
  25. Miao, Y., et al. One-step radiosynthesis and initial evaluation of a small molecule PET tracer for PD-L1 imaging. Bioorganic & Medicinal Chemical Letters. 30 (24), 127572(2020).
  26. Kumar, D., et al. Peptide-based PET quantifies target engagement of PD-L1 therapeutics. The Journal of Clinical Investigation. 129 (2), 616-630 (2019).
  27. Powles, T., et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature. 515 (7528), 558-562 (2014).
  28. Herbst, R. S., et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515 (7528), 563-567 (2014).
  29. Marciscano, A. E., Gulley, J. L. Avelumab demonstrates promise in advanced NSCLC. Oncotarget. 8 (61), 102767-102768 (2017).
  30. Vaddepally, R. K., Kharel, P., Pandey, R., Garje, R., Chandra, A. B. Review of indications of FDA-approved immune checkpoint inhibitors per NCCN guidelines with the level of evidence. Cancers. 12 (3), 738(2020).
  31. Antonia, S. J., et al. Durvalumab after chemoradiotherapy in stage III non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 377 (20), 1919-1929 (2017).
  32. Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 4 (12), 1721-1728 (2018).
  33. Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, M. R., Nedrow, J. R. Radiopharmaceutical therapy in cancer: clinical advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (9), 589-608 (2020).
  34. (US) M. M. M, et al. Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions. United States patent. , US-2017260237-A1 (2014).
  35. Chatterjee, S., et al. Rapid PD-L1 detection in tumors with PET using a highly specific peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 258-263 (2017).
  36. De Silva, R. A., et al. Peptide-based 68Ga-PET radiotracer for imaging PD-L1 expression in cancer. Molecular Pharmaceutics. 15 (9), 3946-3952 (2018).
  37. Lesniak, W. G., et al. Development of [18F]FPy-WL12 as a PD-L1 specific PET imaging peptide. Molecular Imaging. 18, 1536012119852189(2019).
  38. Zhou, X., et al. First-in-humans evaluation of a PD-L1-binding peptide PET radiotracer in non-small cell lung cancer patients. Journal of Nuclear Medicine. 63 (4), 536-542 (2022).
  39. Hu, K., et al. Developing native peptide-based radiotracers for PD-L1 PET imaging and improving imaging contrast by pegylation. Chemical Communications. 55 (29), 4162-4165 (2019).
  40. Liu, H., et al. A novel small cyclic peptide-based 68Ga-Radiotracer for positron emission tomography imaging of PD-L1 expression in tumors. Molecular Pharmaceutics. 19 (1), 138-147 (2022).
  41. Rabideau, A. E., Pentelute, B. L. A D-amino acid at the N-terminus of a protein abrogates its degradation by the N-end rule pathway. ACS Central Science. 1 (8), 423-430 (2015).
  42. Uppalapati, M., et al. A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable, and longer-circulating in vivo. ACS Chemical Biology. 11 (4), 1058-1065 (2016).
  43. Garton, M., et al. Method to generate highly stable D-amino acid analogs of bioactive helical peptides using a mirror image of the entire PDB. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1505-1510 (2018).
  44. Jia, F. J., et al. D-amino acid substitution enhances the stability of antimicrobial peptide polybia-CP. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (10), 916-925 (2017).
  45. Carmona, G., Rodriguez, A., Juarez, D., Corzo, G., Villegas, E. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids. Protein Journal. 32 (6), 456-466 (2013).
  46. Feng, Z., Xu, B. Inspiration from the mirror: D-amino acid containing peptides in biomedical approaches. Biomolecular Concepts. 7 (3), 179-187 (2016).
  47. Hu, K., et al. Whole-body PET tracking of a d-dodecapeptide and its radiotheranostic potential for PD-L1 overexpressing tumors. Acta Pharmaceutica Sinica. B. 12 (3), 1363-1376 (2022).
  48. Qiu, X. Y., et al. PD-L1 confers glioblastoma multiforme malignancy via Ras binding and Ras/Erk/EMT activation. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1754-1769 (2018).
  49. Hu, K., et al. Development of a stable peptide-based PET tracer for detecting CD133-expressing cancer cells. ACS Omega. 7 (1), 334-341 (2021).
  50. Jin, Z. -H., et al. Radiotheranostic agent 64Cu-cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 for management of peritoneal metastasis in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 26 (23), 6230-6241 (2020).
  51. Hu, K., et al. Harnessing the PD-L1 interface peptide for positron emission tomography imaging of the PD-1 immune checkpoint. RSC Chemical Biology. 1 (4), 214-224 (2020).
  52. Hu, K., et al. PET imaging of VEGFR with a novel 64Cu-labeled peptide. ACS Omega. 5 (15), 8508-8514 (2020).
  53. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  54. Zhao, J., et al. Concurrent injection of unlabeled antibodies allows positron emission tomography imaging of programmed cell death ligand 1 expression in an orthotopic pancreatic tumor model. ACS Omega. 5 (15), 8474-8482 (2020).
  55. Moroz, A., et al. A preclinical assessment of 89Zr-atezolizumab identifies a requirement for carrier added formulations not observed with 89Zr-C4. Bioconjugate Chemistry. 29 (10), 3476-3482 (2018).
  56. Nedrow, J. R., et al. Imaging of programmed cell death ligand 1: impact of protein concentration on distribution of anti-PD-L1 SPECT agents in an immunocompetent murine model of melanoma. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1560-1566 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gallium 68 PET TracerD Peptide ImagingPD L1 ExpressionImmune CheckpointTumor ImagingRadiolabeled PeptidePET ImagingFlow CytometryImmunohistochemistryTumor Bio Distribution

Related Articles