Методическая статья

Количественная оценка и полногеномная характеристика РНК SARS-CoV-2 в пробах сточных вод и воздуха

DOI:

10.3791/65053

⸱

30 июня 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол направлен на количественную оценку РНК SARS-CoV-2 в пробах сточных вод и воздуха, которые будут использоваться для эпидемиологических исследований сточных вод, а также на оценку риска воздействия SARS-CoV-2 в аэрозолях внутри и снаружи помещений. Этот протокол также описывает подход к секвенированию с длинной матрицей с мозаичным ампликоном для характеристики всего генома SARS-CoV-2.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпидемиология сточных вод стала многообещающей и эффективной системой эпиднадзора за SARS-CoV-2 и другими инфекционными заболеваниями во многих странах. Этот процесс обычно включает в себя концентрацию сточных вод, экстракцию нуклеиновых кислот, амплификацию выбранных сегментов генома, а также обнаружение и количественную оценку амплифицируемого сегмента генома. Эта методология также может быть использована для обнаружения и количественного определения инфекционных агентов, таких как SARS-CoV-2, в пробах воздуха. Первоначально предполагалось, что SARS-CoV-2 распространяется в основном при тесном личном контакте с каплями, выделяемыми инфицированным человеком во время разговора, чихания, кашля, пения или дыхания. Тем не менее, все больше исследований сообщают о присутствии РНК SARS-CoV-2 в воздухе медицинских учреждений, что делает передачу вируса воздушно-капельным путем жизнеспособным. Это исследование представляет собой совокупность установленных протоколов для облегчения обнаружения, количественной оценки и секвенирования вирусов в окружающей среде как в пробах сточных вод, так и в пробах воздуха.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В декабре 2019 года появилось новое заболевание под названием COVID-19, вызванное ранее неизвестным коронавирусом SARS-CoV-21. Последовавшая за этим глобальная пандемия стала серьезной проблемой для клинических лабораторий и лабораторий общественного здравоохранения во всем мире, поскольку большое количество людей нуждается в тестировании для точной оценки передачи и распространенности вируса в сообществе. Однако во многих регионах достижение необходимого уровня тестирования в своевременном и пространственно-комплексном плане экономически нецелесообразно 2,3. Существующие системы эпиднадзора, основанные на индивидуальной клинической диагностике, в значительной степени зависят от тяжести симптомов и индивидуальных сообщений, а также от того, в какой степени эти симптомы пересекаются с существующими заболеваниями, циркулирующими в популяции 4,5,6,7,8,9,10. Следовательно, большое число бессимптомных случаев способствует значительной недооценке бремени болезни 7,11.

В связи с этими проблемами в качестве дополнительной стратегии эпиднадзора за COVID-19 была предложена эпидемиология сточных вод (ВБЭ). WBE был впервые описан в 2001 году и первоначально использовался для отслеживания кокаина и других незаконных наркотиков13. Этот подход основан на предположении, что можно рассчитать начальную концентрацию любого вещества, стабильного в сточных водах и выделяемого человеком 8,12. WBE успешно применяется во многих странах в качестве дополнительной и эффективной системы эпиднадзора за SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. Большинство методов обнаружения вирусов человека в водной среде состоят из следующих этапов: концентрирование, экстракция нуклеиновых кислот, амплификация выбранного сегмента (или сегментов) генома и обнаружение/количественное определение амплифицированного сегментагенома 3.

Еще одной важной средой для обнаружения и количественного определения SARS-CoV-2 являются пробы воздуха. Первоначально предполагалось, что SARS-CoV-2 передается в основном при тесном личном контакте с респираторными каплями из аэрозолей, образующихся инфицированным человеком во время разговора, чихания, кашля, пения или дыхания17. Тем не менее, в нескольких исследованиях начали сообщать о присутствии РНК SARS-CoV-2 в воздухе, особенно в медицинских учреждениях и других закрытых помещениях 18,19,20,21. Доказательства жизнеспособности SARS-CoV-2 были обнаружены в пробах воздуха, взятых в помещениях больниц и других закрытых помещениях, когда концентрация вируса была достаточно высокой22,23,2 4. Исследования на открытом воздухе, как правило, не обнаружили никаких доказательств SARS-CoV-2, за исключением многолюдных открытых пространств 21,25,26,27,28,29. На данный момент воздушно-капельная передача SARS-CoV-2 признана способом передачи30,31. Недавнее обзорное исследование показывает различия между пребыванием на открытом воздухе, где риск передачи инфекции воздушно-капельным путем минимален за пределами мест скопления людей, и в помещениях, где более высокие риски могут присутствовать в плохо проветриваемых помещениях, в которых могут присутствовать сильные источники (т.е. количество инфицированных людей). Недавнее всестороннее обзорное исследование выявило существенные различия между рисками передачи инфекции воздушно-капельным путем на открытом воздухе и в помещениях, особенно в местах скопления людей с плохой вентиляцией. Исследование показывает, что риск передачи вируса воздушно-капельным путем минимален на открытом воздухе, где имеется больший объем воздуха, доступный для разбавления и рассеивания вирусных частиц32. Эти результаты имеют важное значение для политики и руководящих принципов в области общественного здравоохранения, связанных с COVID-19. Признавая значительные различия в рисках передачи инфекции в помещениях и на открытом воздухе, директивные органы могут разработать более эффективные стратегии по смягчению последствий распространения вируса и защите здоровья населения.

Существует множество методов и протоколов для обнаружения, количественного определения и секвенирования SARS-CoV-2 из различных образцов окружающей среды. В данной статье о методе представлена комбинация хорошо зарекомендовавших себя протоколов, которые позволяют лабораториям с различными уровнями производительности выполнять обнаружение, количественную оценку и секвенирование вирусов в пробах сточных вод и воздуха.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные здесь, были опубликованы в других изданиях и содержат небольшие изменения по сравнению с оригинальными методами.

1. Сбор сточных вод и предварительная обработка проб

ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за низких концентраций РНК SARS-CoV-2 в образцах окружающей среды реализация этапа концентрации имеет решающее значение для успешного обнаружения33,34,35. Здесь описан первый зарегистрированный метод обнаружения SARS-CoV-2 в сточных водах36.

  1. Отбор и концентрирование проб сточных вод
    1. Соберите 1 л составной пробы сточных вод за 24 часа. Храните образец при температуре 4 °C и выполняйте протокол в течение 24 часов.
    2. Гомогенизируйте образец, осторожно встряхивая бутылку. Соберите 70 мл в центробежную пробирку объемом 100 мл или разделите образец на две центробежные пробирки по 50 мл.
    3. Спайк 20 мкл менговируса (3,2 x 10,3 копии/мкл) до 70 мл каждого образца в качестве внутреннего контроля процесса концентрирования. В качестве альтернативы можно добавить 10 мкл менговируса (3,2 x 103 копий/мкл) в каждую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
    4. Гомогенизируйте образец и центрифугу при 700 x g в течение 10 мин для удаления крупных частиц и организмов (гранул).
    5. Полученную надосадочную жидкость используют для концентрирования в центробежных ультрафильтрационных устройствах с отсечкой 10 кДа путем центрифугирования при 4 000 х г в течение 40 мин при 4 °С. Элюируют концентрат центрифугированием при 700 x g в течение 40 мин и инвертированием положения ультрафильтрационного устройства.
    6. Измерьте объем полученного концентрата. Объем будет изменяться в зависимости от количества твердых частиц в образце, которые засоряют центробежные фильтры. В этом исследовании объем полученного концентрата составлял от 200 до 1200 мкл.
    7. Полученный концентрат используют для экстракции РНК с помощью коммерческого набора или собственным методом. Для образцов, используемых в данном исследовании, используется специальный коммерческий набор для экстракции вирусной РНК с объемом элюирования 50 мкл.
    8. Измерьте концентрацию экстрагированной РНК с помощью набора для количественного определения флуориметрической РНК. Извлеченную РНК разделить на аликвоты и заморозить при -80 °C до дальнейшего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого набора процедур выделения РНК должен быть включен отрицательный контроль выделения (NCI), содержащий только буферы для обнаружения возможного загрязнения во время экстракции.
  2. Отбор проб воздуха с помощью компактного пробоотборника Кориолиса
    1. Выберите стратегию отбора проб в соответствии с целью исследования, определив частоту выборки и места отбора проб.
    2. Установите расход на пробоотборнике воздуха (в данном случае 50 л/мин в течение 30 мин). Обратите внимание, что скорость потока более 200 л/мин может привести к деградации вирусной РНК, поэтому рекомендуется использовать скорость потока ниже 200 л/мин.
    3. Поместите стерильный конус в пробоотборник воздуха перед началом сбора, пульсируя началом. После завершения отбора проб добавьте в конус 5-15 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS). Осторожно встряхните или встряхните образец рукой в течение 15 с. Хранят образцы до 24 ч при 4 °C или -80 °C в криопробирках.
    4. По желанию можно выполнить этап концентрации. Очищайте и обеззараживайте шишки после каждого эксперимента с использованием отбеливателя.
    5. Извлекайте РНК с помощью коммерческого набора или собственного метода. Для образцов в данном исследовании используется специальный коммерческий набор для экстракции вирусной РНК с объемом элюирования 50 мкл.
    6. Измерьте концентрацию экстрагированной РНК с помощью набора для количественного определения флуориметрической РНК. Извлеченную РНК разделить на аликвоты и заморозить при -80 °C до дальнейшего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого набора процедур выделения РНК должен быть включен отрицательный контроль выделения (NCI), содержащий только буферы для обнаружения возможного загрязнения во время экстракции.

2. Количественное определение РНК SARS-CoV-2 методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-кПЦР)

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол соответствует диагностической панели CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) RT-PCR37. Разделите смесь праймера/зонда на несколько аликвот, чтобы избежать циклов замораживания и оттаивания.

  1. Приготовьте микс реакций для каждой мишени (менговирус; SARS-CoV-2 [гены N1 и N2]), как показано в таблице 1, в чистом колпаке в комнате настройки реагентов. Смешайте смесь праймеров/зондов и фермент методом инверсии пять раз. В качестве альтернативы легким импульсно-вихревым перемешайте праймеры/зонд и фермент пять раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните все реагенты в холоде во время приготовления и использования. Чтобы свести к минимуму циклы замораживания-оттаивания, настоятельно рекомендуется замораживать аликвотами.
  2. Раскрутите (1 000 x g в течение 15-30 с) тюбики, чтобы собрать содержимое на дне, и поместите пробирки на холодную решетку или на лед.
  3. Маркируйте пробирки для микроцентрифуг объемом 1,5 мл для каждой мишени. Добавьте в каждую микроцентрифужную пробирку необходимое количество каждого реагента (объем на реакцию, умноженный на количество реакций, включая необходимые элементы контроля). Перемешайте пипеткой вверх и вниз и центрифугируйте в течение 5 с, чтобы собрать содержимое на дне.
  4. Храните пробирки для микроцентрифуг в холодном штативе и дозируйте 15 мкл в полоски для ПЦР или 96-луночный планшет в охлаждающей стойке. Накройте планшет крышкой и переместите его в зону обработки нуклеиновых кислот (храните ее в решетке для охлаждения).
  5. Разморозьте аликвоту экстрагированной РНК и осторожно встряхните в течение 5 с. Пипетку 5 мкл РНК (в дополнение к 5 мкл нематричного контроля [NTC], отрицательного контроля выделения [NCI] и положительного контроля [PC]) в каждую реакционную лунку или пробирку, содержащую ранее приготовленную мастермикс. Часто меняйте перчатки по мере необходимости, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
  6. Накройте всю реакционную пластину или пробирки и осторожно вмешайте. Центрифуга (1 000 х г в течение 15-30 с) планшет или ПЦР-пробирки.
  7. Начинают ОТ-кПЦР объемом 25 мкл со следующими циклическими условиями: обратная транскриптаза при 45 °C в течение 10 мин; активация полимеразы при 95 °С в течение 10 мин; 45 циклов денатурации при 95 °С в течение 15 с; и отжиг/удлинение при 60 °C в течение 45 с.
  8. Рассчитайте эффективность выздоровления менговирусных контролеров, по данным Conte et al.38:
    figure-protocol-1 × 100

3. Варианты последовательности в сточных водах и анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол является модифицированным протоколом, созданным Quick et al.39,40. В нем используются два набора праймеров для амплификации генома SARS-CoV-2 методом ПЦР-мозаики - праймеры ARTIC и праймеры VarSkip. Комбинация праймеров используется для того, чтобы гарантировать наилучшее покрытие генома и свести к минимуму возможность новых мутаций, приводящих к отказу праймеров одного типа. В целом, протокол разделен на три части: обратная транскрипция (RT) и генерация ампликонов, подготовка библиотеки секвенирования, а также секвенирование и анализ данных.

  1. Обратная транскрипция и генерация ампликонов
    1. Убедитесь, что входные образцы имеют известное пороговое значение циклического цикла кПЦР (Ct), чтобы правильно разбавить их в воде класса ПЦР. Значение Ct получают при количественном определении с помощью кПЦР. Разведения следующие: если значение Ct равно 12-15, разбавляют образцы 1:100; если значение Ct равно 15-18, разбавляют образцы 1:10; если значение Ct составляет 18-35, образец не разбавляют. Образцы со значением Ct выше 35 имеют высокую вероятность того, что они не будут работать.
    2. В ПЦР-планшете пипетку 16 мкл каждого образца до его положения на планшете. Добавьте 4 мкл мастермикса с обратной транскрипцией (RT) (5x). Накройте планшет и начните реакцию ПЦР при следующих условиях: 25 °C в течение 2 мин, 55 °C в течение 20 мин и 95 °C в течение 1 мин.
    3. Приготовьте 10 мкМ разбавлений каждого набора праймеров (пул ARTIC A и пул B, а также пул VarSkip A и пул B). Подготовьте мастермикс для каждого набора грунтовок (ARTIC набор A и B и набор VarSkip A и B), как показано в таблице 2. В результате получится четыре мастермикса.
    4. На новой ПЦР-пластине пипеткой 20 мкл мастермикса в каждую соответствующую лунку. Добавьте 5 мкл образца RT в каждую смесь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый образец будет иметь четыре реакционные смеси - ARTIC пул A и B и VarSkip пул A и B.
    5. Накройте планшет и начните реакцию ПЦР следующим образом: активация полимеразы при 98 °C в течение 30 с; 35 циклов денатурации при 98 °С в течение 15 с; и отжиг/удлинение при 65 °C в течение 4 мин. Раскрутите тарелку (1 000 x g в течение 15-30 с). Объедините реакционные пулы ARTIC и отдельно объедините реакционные пулы VarSkip. В каждом образце будут две ампликонные реакции по 50 мкл.
    6. Добавьте в каждую лунку 50 мкл реагента на основе гранул для очистки ПЦР и хорошо перемешайте пипетированием. Инкубировать при комнатной температуре 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым использованием энергично перемешивайте реагент для очистки ПЦР, чтобы повторно суспендировать гранулы.
    7. Поместите пластину на подставку для магнитной сепарации и подождите, пока шарики образуют гранулы, а жидкость прозрачится (~ 5 минут). Пипеткой выбросьте надосадочную жидкость. Держите ПЦР-планшет на магнитной подставке.
    8. Удерживая ПЦР-планшет на магнитной подставке, добавьте 200 мкл 80% этанола в каждый образец, не прикасаясь к грануле. Удалите этанол.
    9. Повторите предыдущий шаг. Оставьте пластину на магнитной подставке открытой на 30 секунд, чтобы этанол испарился.
    10. Снимите планшет с магнитной подставки и добавьте 15 мкл воды для ПЦР в каждый образец. Ресуспендируйте гранулы с помощью пипетирования. Выдерживают при комнатной температуре 2 мин.
    11. Поместите пластину обратно на магнитную подставку и дайте шарикам превратиться в гранулы (2 минуты). Осторожно пипеткой 15 мкл надосадочной жидкости из каждого образца на новую ПЦР-пластину.
    12. Измерьте концентрацию каждого образца с помощью набора для количественного определения флуорометрической РНК. Возьмите примерно 50 нг каждого образца в 12,5 мкл для следующего этапа. При необходимости разведите образец в воде для ПЦР.
  2. Подготовка библиотеки
    1. Добавьте 1,75 мкл реакционного буфера из набора для подготовки библиотеки ДНК Illumina и 0,75 мкл смеси ферментов к каждому образцу. Накройте тарелку, коротко встряхните и открутите вниз (1 000 x g в течение 15-30 с). Инкубировать при 21°C в течение 5 мин и при 65°C в течение 5 мин.
    2. В новой пробирке пипетку 3 мкл воды ПЦР-класса для каждого образца на новую ПЦР-пластину. Добавьте 0,75 мкл подготовленных образцов, 1,25 мкл штрих-кодов для подготовки библиотеки секвенирования и 5 мкл мастермикса ДНК-лигазы Т4. Хорошо перемешать пипеткой, кратковременно отжимить (1 000 x g в течение 15-30 с) в центрифуге и инкубировать при 21 °C в течение 20 мин и при 65 °C в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется менее 25 образцов, удвойте все объемы на этом шаге.
    3. Объедините все образцы вместе, добавив по 10 мкл каждого образца в одну и ту же пробирку с низким связыванием. Перейдите к следующему шагу с объемом 480 мкл.
    4. Добавьте в бассейн 192 мкл реагента на основе гранул для очистки ПЦР и хорошо перемешайте пипеткой. Выдерживают при комнатной температуре 10 мин.
    5. Поместите пробирку на магнитную подставку и подождите, пока надосадочная жидкость исчезнет и образуется гранула шарика. Удалите надосадочную жидкость. Извлеките трубку из магнитной подставки.
    6. Добавьте 700 мкл буфера коротких фрагментов (SFB) и перемешайте пипетированием. Положите обратно на магнитную подставку и подождите, пока сформируется гранула и жидкость не вытечет (~ 5 минут). Пипеткой выньте надосадочную жидкость и выбросьте ее.
    7. Повторите предыдущий шаг. Оставьте трубку на магнитной подставке. Добавьте 100 мкл 80% этанола, не прикасаясь к шарику. Пипеткой вылейте этанол и дайте шарику высохнуть в течение 30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте пересыхания шарика.
    8. Снимите пробирку с магнитной подставки и добавьте 35 мкл воды для ПЦР. Перемешать пипеткой и инкубировать при комнатной температуре 2 мин. Поместите трубку на магнитную подставку и дайте шарику превратиться в гранулы, а жидкости — в прозрачность. Пипетку 35 мкл надосадочной жидкости в новую пробирку.
    9. Измерьте концентрацию РНК в объединенной библиотеке. Пипеткой наберите объем, необходимый для достижения количества 30-50 нг РНК, и наполните его водой ПЦР-класса до конечного объема 30 мкл.
    10. Приготовьте реакционную смесь для лигирования адаптера: 30 мкл объединенной библиотеки, 5 мкл переходной смеси II, 10 мкл буфера реакции лигирования (5x) и 5 мкл ДНК-лигазы T4. Смешивание пипетированием и отжимом (1 000 x g в течение 15-30 с). Выдерживают при комнатной температуре 10 мин.
    11. Добавьте 20 мкл реагента на основе гранул для очистки ПЦР и перемешайте пипетированием. Выдерживать 10 мин при комнатной температуре.
    12. Поместите пробирку на магнитную подставку и подождите, пока сформируется гранула гранулы, а надосадочная жидкость станет бесцветной. Осторожно выньте пипетку и выбросьте надосадочную жидкость.
    13. Снимите с магнитной подставки и добавьте 125 мкл SFB. Перемешайте пипеткой и поместите обратно на магнитную подставку, чтобы отделить шарики. Когда жидкость станет прозрачной, пипеткой выбросьте надосадочную жидкость.
    14. Повторите предыдущий шаг. Оставьте пробирку открытой на магнитной подставке на 30 секунд, чтобы оставшаяся жидкость испарилась.
    15. Снимите пробирку с магнитной подставки и добавьте 15 мкл элюирующего буфера. Хорошо перемешайте пипеткой и кратковременно отжим (1 000 x g в течение 15-30 с). Инкубировать при комнатной температуре 5 мин. Поместите на магнитную подставку на 2 минуты.
    16. Пипетку 15 мкл надосадочной жидкости в новую пробирку с низким связыванием. Это окончательная библиотека. Измерьте концентрацию с помощью флуорометрического набора для количественного определения ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На следующем этапе необходимо 12 мкл. Если концентрация очень высока и требуется менее 12 мкл библиотеки, заполните до 12 мкл элюирующим буферным реагентом.
  3. Загрузка и последовательность проточных ячеек
    1. Вставьте проточную ячейку (R9.4.1) в устройство секвенирования ДНК и РНК в режиме реального времени.
    2. Приготовьте грунтовочную смесь, добавив 30 мкл реагента промывочного троса (FLT) в пробирку с реагентом промывочного буфера (FB). Вихрь для смешивания и отжима (1 000 x g в течение 15-30 с).
    3. Откройте крышку заливочного отверстия. С помощью пипетки на 1 000 мкл установите 200 мкл и вставьте наконечник в отверстие для заливки. Поверните колесико регулировки громкости и увеличивайте громкость, пока не будет видна жидкость в наконечнике. Выбросьте наконечник.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поворачивайте колесо только до тех пор, пока в наконечнике не появится несколько мкл жидкости. Вытягивание больших количеств может привести к повреждению проточной ячейки.
    4. Медленно добавьте 800 мкл смеси для заливки в отверстие для заливки, стараясь не допустить образования пузырьков. Подождите 5 минут.
    5. Тем временем подготовьте библиотеки к загрузке. Смешайте 37,5 мкл буфера секвенирования, 25,5 мкл буфера загрузки и 12 мкл библиотеки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перемешайте загрузочный буфер перед пипетированием. Гранулы в этом реагенте оседают очень быстро.
    6. Откройте крышку порта. Пипетка 200 мкл праймерной смеси в заливочное отверстие.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При пипетировании в отверстие для заливки с открытым отверстием крышки можно заметить небольшие капли, выходящие из отверстия для образца. Пипетка работает достаточно медленно, чтобы отверстие для образца могло втянуть капли, не высыпая их через себя.
    7. Перед загрузкой подготовленной библиотеки хорошо перемешать пипеткой. С помощью пипетки на 100 мкл, настроенной на 75 мкл, по капле вставляйте библиотеку и пипетку в отверстие для образца. Не прикасайтесь к порту и подождите, пока каждая капля впитается в порт, прежде чем загружать следующую каплю, чтобы избежать перелива жидкости.
    8. Закройте отверстие крышки и отверстие для заливки. Откройте программу и запустите эксперимент по секвенированию. Выберите basecalling On. Для библиотеки с 96 мультиплексированными выборками обычно достаточно 10-12 часов секвенирования для получения достаточного количества данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью программного обеспечения можно вставить образец листа в формате .csv. Образец листа должен содержать следующие данные: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code и комплект. Необходим идентификатор проточной ячейки (указан на боковой стороне проточной ячейки) вместе с используемым комплектом. Для предложенного протокола следует выбрать комплект LSK109.
  4. Анализ данных секвенирования
    1. Вставка сжатых операций чтения fastq в рабочий процесс wf-artic41. Запустите рабочий процесс отдельно с двумя различными схемами праймеров (ARTIC/V4.1 и NEB-VarSkip/v1a). Два». Для каждого образца создаются файлы primertrimmed.rg.sorted.bam.
    2. Объедините файлы BAM в один файл с помощью команды "samtools merge"42. Вставьте объединенный файл BAM в инструмент Freyja, оставив настройки по умолчанию, чтобы восстановить относительную распространенность родословной43.
    3. Чтобы создать файл FASTA, вставьте объединенный BAM файл в инструменты "samtools mpileup" и "ivar" с настройками по умолчанию44,45. Для вызова мутации загрузите файл FASTA в инструмент Nextclade46,47.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты, сведенные в таблицу 3 , показывают примеры обнаружения и количественного определения РНК SARS-CoV-2 в пробах сточных вод и воздуха с использованием метода, описанного в этой статье. Пробы сточных вод были собраны с очистных сооружений в Испании и Словении и считались положительными, если Ct был менее 40 по крайней мере в двух из трех повторных копий, при этом количественное определение считалось действительным, если Ct имело отклонение менее 5%. В Испании и Португалии были взяты пробы воздуха...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обнаружение и количественное определение микроорганизмов и вирусов с использованием методов (ОТ-)qПЦР получило широкое признание благодаря своей исключительной чувствительности. Однако эти методы сталкиваются с многочисленными проблемами при анализе проб окружающей среды. Пробы сточных вод содержат большое количество ингибирующих веществ, которые могут исказить результаты измерений и привести к неверным результатам. Для преодоления этих ограничений и повышения точности был разработан, разработан и реализован сложный прот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конкурирующих экономических интересов или иных конфликтов интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была выполнена при финансовой поддержке Регионального правительства Кастилии и Леона и программы FEDER (проекты CLU 2017-09, UIC315 и VA266P20).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Адаптер+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19Oxford NanoporeEXP-AMII001секвенирование
AllPrep PowerViral ДНК/РНК НаборQiagen28000-50Набор для экстракции РНК
AMPure XPBeckman CoulterA63880ПЦР-очистка, NGS Clean-up, очистка ПЦР
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon PanelIDT10011442SARS-CoV-2 амплификация генома SARS-CoV-2
Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367SПодготовка библиотеки
CENTRICON PLUS­ 70 10 КДА.Fisher Scientific10296062Фильтры концентрационных фильтров
CORIOLIS COMPACT Air SamplerBertin Technologies083-DU001Пробоотборник воздуха
Duran  лабораторные бутылкиMerckZ305200-10EAПроточные бутылки
Flow Cell (R9.4.1)Оксфорд НанопорыFLO-MIN106DСеквенирование
Общие лабораторные расходные материалы (пробирки, планшеты для количественной ПЦР и т.д.)
Набор для секвенирования лигированияОксфорд НанопорSQK-LSK109Секвенирование
LunaScript  Набор RT SuperMix NEBE3010  синтез кДНК
Набор для контроля экстракции менговируса Biomé rieuxKMGКонтроль концентрации
Nalgene General Long-Long Storage Криогенные пробиркиThermofisher5011-0012Sample Storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (без ПЦРOxford NanoporeEXP-NBD104Штрихкодирование
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNEBE7595DNA Repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer MixNEBE7658Амплификация генома SARS-CoV-2
NEBNext  Буфер для быстрой реакции лигированияNEBB6058Sсеквенирование 
Фосфатно-солевой буферMerckP4474Сбор
Фосфатно-солевой буфер (PBS, 1X), стерильно-отфильтрованныйThermofisherJ61196. АПЭлюирование проб воздуха
Q5  Горячий старт Высокоточный 2X Master MixNEBM0494Горячийстарт ДНК-полимераза
Кубит РНК Набор для анализаThermofisherQ32852Количественное определение РНК
SARS-CoV-2 RUO qPCR Праймер и Набор зондовIDT10006713смесь праймер-зондов и положительный контроль qPCR
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master MixThermofisherA15299RT-qPCR kit
HS

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020).
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission - A brief review. One Health. 15, 100405(2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094(2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226(2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180(2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 - approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404(2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558(2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , American Chemical Society. Washington, DC. (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14(2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. deL., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251(2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787(2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800(2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540(2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955(2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200(2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352(2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732(2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255(2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326(2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599(2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932(2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021).
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021).
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137(2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , Woodhead Publishing. 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC - 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020).
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. Quick, J. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020).
  40. Tyson, J. R. Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. ARTIC SARS-CoV-2 Workflow. , Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022).
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Freyja. , Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022).
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8(2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773(2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215(2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942(2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557(2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926(2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764(2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002(2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods - A scoping review. Water Research. 179, 115899(2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614(2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776(2020).
  60. VATar COVID-19 | Caso de Exito - Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico. , Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022).
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098(2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202(2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574(2023).
  64. Gonçalves, J., et al. Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи