Стандартизированная идентификация структуры соединений в тибетской медицине с использованием масс-спектрометрии ионных ловушек и многоступенчатого фрагментационного анализа

Качественный анализ микрокомпонентов в традиционной китайской медицине (ТКМ) стал важной темой в исследованиях. Из-за большого количества соединений в ТКМ их трудно выделить для анализа спектрометра ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или рентгеновского дифрактометра (XRD), что делает методы на основе масс-спектрометрии (МС), требующие только небольших объемов образцов, все более популярными. Кроме того, жидкостная хроматография (ЖК) в сочетании с МС широко используется в исследованиях ТКМ в последние годы для улучшения разделения сложных образцов и качественного анализа химических соединений¹. Одним из распространенных методов является времяпролетная масс-спектрометрия жидкостной хроматографии и ионизации электрораспылением (LC-ESI-TOF-MS), которая широко используется в качественных исследованиях тибетской медицины². С помощью этого метода сложные компоненты обогащаются и разделяются в колонке LC, а отношение массы к заряду (m/z) ионов аддукта наблюдается с помощью детектора MS. Поиск в тандемных базах данных MS (MS/MS или MS²) в настоящее время является самым быстрым подходом к уверенным аннотациям соединений в низкомолекулярном анализе с использованием квадрупольного времяпролетного (Q-TOF) MS и Orbitrap MS³. Однако низкое качество баз данных и наличие различных изомеров препятствуют идентификации неизвестных соединений. Кроме того, информация, предоставляемая базой данных MS/MS, ограничена 4,5,6,7. Важно исследовать химические соединения в каждой ТКМ с использованием общего протокола, который может быть широко применен к другим ТКМ.

IT-MS улавливает широкий спектр ионов, подавая различные радиочастотные (РЧ) напряжения на кольцевые электроды⁸. IT-MS может выполнять многоступенчатое сканирование MS временных рядов в различных хронологических порядках, обеспечивая фрагментацию многоступенчатого MS ингредиентов (MS n), гдеⁿ - количество стадий⁹ ионов продукта. Линейный IT-MS считается лучшим для идентификации структуры, так как его можно использовать для последовательных экспериментов^{MS n 10}. Целевые ионы могут быть выделены и накоплены в линейном IT-MS¹. MSⁿ (n ≥ 3) в IT-MS предоставляет больше информации о фрагментах, чем MS/MS в Q-TOF-MS. Поскольку IT-MS не может блокировать ион-мишень и его фрагментированные ионы, он является мощным инструментом для выяснения структуры неизвестных соединений, включая изомеры¹. Технология MSⁿ широко применяется для структурного анализа неизвестных белков, пептидов и полисахаридов^11,12. Уровень содержания фрагментных ионов в MSⁿ обеспечивает больше информации о молекулярных фрагментах целевых соединений в сложных образцах, чем MS / MS в Q-TOF-MS. Следовательно, применение технологии MSⁿ для структурной идентификации в ТКМ имеет важное значение.

Тибетская медицина является важным компонентом TCM¹³, и эти лекарства в основном получены из животных, растений и минералов, найденных в районе плато¹⁴. Тибетская медицина Abelmoschus manihot seeds (AMS) - это семя Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS — это традиционная фитотерапия, используемая для лечения таких состояний, как атопический дерматит, ревматизм и проказа. Он содержит халкон, который обладает антибактериальным, противогрибковым, противоопухолевым, антиоксидантным и противовоспалительным действием¹⁵. В настоящем^{исследовании были} усовершенствованы процедуры MSN, и был разработан подробный метод идентификации сложных структур в AMS тибетской медицины с использованием IT-MS и MSⁿ. Некоторые параметры MS, включая ионный режим, дальность сканирования и режим столкновения, были оптимизированы для преодоления проблем с идентификацией следовых соединений. Это исследование направлено на содействие стандартизированной идентификации структуры следовых соединений в ТКМ.

1. Пробоподготовка

1. Точно взвесьте 1 г образца AMS и поместите его в коническую колбу с 30 мл 80% метанола. Перенесите смесь в ультразвуковую ванну на 30 минут экстракции при 25 ° C. Центрифугируйте образец при 14 000 x g в течение 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Частота ультразвукового аппарата ультразвуковой ванны составляет 40 кГц.
2. Подготовьте инъекционный шприц и микропористый мембранный фильтр (0,22 мкм, только органический). Отфильтруйте надосадочную жидкость в бутылку с образцом объемом 2 мл.

2. Настройка MS

1. Включите выключатель вакуумного насоса. Откройте главный клапан баллона с аргоном и клапан парциального давления и отрегулируйте давление примерно до 0,3 МПа. Откройте азотный клапан.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите не менее 8 часов, чтобы обеспечить достаточную степень вакуума для условий эксперимента. Перед анализом убедитесь, что давление газа аргона и азота достаточно высокое.
2. Запустите управляющее программное обеспечение MS. Нажмите « Источник SEI с подогревом » на панели программного обеспечения и введите параметры MS, включая температуру нагревателя (350 °C), расход газа в оболочке (35 arb), расход вспомогательного газа (15 arb), напряжение распыления (3,8 кВ для положительного режима, -2,5 кВ для отрицательного режима) и температуру капилляров (275 °C). Нажмите кнопку «Применить », чтобы активировать источник ионов.

3. Предварительный запуск LC, установление метода и получение MS

1. Приготовьте подвижную фазу А и подвижную фазу В, используя 0,1% водный раствор муравьиной кислоты и чистый ацетонитрил соответственно. Дегазируйте их в ультразвуковой ванне ультразвукового аппарата в течение не менее 15 минут. Подсоедините растворы к каналам для жидкости A и B соответственно (рис. 1A). Приготовьте раствор метанола и воды (1:9 об./об.), а затем вручную залейте его в бутылки с жидкостью для очистки насоса и инжектора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Частота ультразвукового аппарата ультразвуковой ванны составляет 40 кГц.
2. Запустите управляющее программное обеспечение LC-MS.
   1. Нажмите кнопку «Прямое управление», чтобы открыть панель управления LC. Откройте продувочный клапан против часовой стрелки на модуле насоса (рис. 1B).
   2. Нажмите кнопку « Дополнительно », чтобы открыть настройку насоса, и установите параметры продувки на уровне 5 ^млмин-1 в течение 3 минут. Нажмите кнопку «Очистка », чтобы начать удаление пузырьков. Затем закройте продувочный клапан.
3. Нажмите на кнопки «Основной шприц», «Буферная петля для стирки» и «Внешняя игла для стирки », чтобы ополоснуть шприц в течение трех циклов, петлю в течение одного цикла и иглу в течение одного цикла соответственно. Поместите бутылку с образцом в пробоотборник (рис. 1C).
4. Нажмите кнопку «Настройка инструмента», чтобы открыть окно редактирования метода. Нажмите кнопку «Создать», чтобы создать новый метод прибора LC-MS.
5. Установите общее время выполнения метода LC. Затем введите значения для установки предельного давления, общего расхода, градиента потока, температуры образца, температуры колонны и дельты готовой температуры в окне редактирования метода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий расход подвижной фазы по умолчанию постоянен на уровне 0,3 мл/мин с 50% A и 50% B и без температуры колонки при отсутствии хроматографической колонки. Значения температуры образца и дельты температуры готовности по умолчанию составляют 15 °C и 0,1 °C соответственно. Другие настройки зависят от типа используемой колонки жидкостной хроматографии.
6. Выберите общий тип эксперимента MS или MS ⁿ для метода MS. Введите значения, чтобы настроить время сбора данных, полярность, диапазон масс, номер значения отклонения и продолжительность значения отклонения. Нажмите кнопку «Сохранить», чтобы настроить параметры как метод инструмента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки по умолчанию без хроматографической колонки следующие: время сбора данных, 2 мин; полярность, положительная или отрицательная; диапазон масс от 100 до 1 200; число значений отклонения, 2; и продолжительность отклонения значения, 1,99 мин.

4. Операционная многоступенчатая масс-спектрометрия

1. Нажмите кнопку «Настройка последовательности», чтобы открыть таблицу последовательностей.
   1. В таблице введите следующую информацию: тип образца, имя файла, путь, идентификатор образца, метод прибора, положение и объем впрыска.
   2. Нажмите кнопку « Сохранить », чтобы записать таблицу последовательностей, а затем нажмите кнопку « Начать анализ », чтобы выполнить настройки и начать сбор MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тип выборки по умолчанию выбран как неизвестный. Инструментальный метод — это метод, сохраненный на шаге 3.6. Флакон с образцом помещается в свое уникальное место в комнате для образцов. Например, RA1 — это первое место в первом ряду красной области в комнате для образцов. Объем впрыска по умолчанию обычно составляет 2 мкл, что зависит от концентрации образца.
2. Дважды щелкните необработанный файл в проводнике, чтобы загрузить данные MS в программное обеспечение для обработки данных. На базовой пиковой хроматограмме (BPI) выберите область с максимальной площадью под кривой (AUC), щелкнув и перетащив мышь. Соответствующие спектры МС будут отображаться в том же окне.
3. Выберите ион-мишень для следующего анализа МС/МС.
   1. Снова откройте окно редактирования метода. В таблице MSⁿ Setting установите m/z целевого иона на один десятичный знак в столбце «Родительская масса ».
   2. Выберите режим столкновения и введите значение энергии столкновения (CE). Установите диапазон сканирования MS/MS. Нажмите кнопку « Сохранить », чтобы записать метод MS, и введите новое имя файла в таблицу последовательностей. Нажмите кнопку «Пуск », чтобы начать приобретение MS/MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон сканирования MS / MS составлял 40% -130% от целевого родительского иона. Значение CE по умолчанию в режиме диссоциации, вызванной столкновением (CID), составляет 35%.
4. Дважды щелкните необработанный файл в проводнике, чтобы загрузить необработанный файл MS / MS в программное обеспечение для обработки данных.
   1. Определите самый сильный фрагментный ион в спектре MS/MS и введите его значение m/z в список методов MSⁿ. В таблице настроек MSⁿ установите параметры MS³, включая режим столкновения, значение CE и диапазон сканирования.
   2. Нажмите кнопку « Сохранить », чтобы записать метод MS, и введите новое имя файла в таблицу последовательностей. Нажмите кнопку «Пуск », чтобы начать сбор MS³ .
5. Дважды щелкните необработанный файл в проводнике, чтобы загрузить необработанный файл MS³ в программное обеспечение для обработки данных. Повторите шаг 4.4, чтобы получить спектр MS⁴ .
6. Завершите эксперимент MSⁿ , когда в спектре не наблюдается стабильных фрагментных ионов.

5. Ручной анализ данных MSⁿ

1. Дважды щелкните необработанные файлы, чтобы открыть все масс-спектры от MS до MSⁿ. Вручную рассчитайте значения разницы m/z между ионом и соответствующими ионами фрагмента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, значение разницы m/z между ионом (m/z 617,25) и соответствующими ионами-фрагментами (m/z 571,28) составило 45,97 в MS/MS, значение разницы m/z между ионом (m/z 571,28) и соответствующими ионами фрагментов (m/z 525,38) составило 45,90 в MS³, а значения разницы m/z между ионом (m/z 525,38) и соответствующими ионами фрагмента (m/z 344,93 и 273,16) составили 180,45 и 252,22 в МС⁴ соответственно.
2. Вручную нарисуйте «основную» структуру по результатам MS⁴ (последний уровень MSⁿ). Вручную выведите исходную структуру, используя функциональные группы или молекулярные сегменты на основе значения разности m/z. Вручную нарисуйте пути молекулярного расщепления в соответствии с каждой молекулярной структурой в MSⁿ. Примеры ручного молекулярного деривации подробно описаны в разделе репрезентативных результатов.

Целлобиоза была использована в качестве модели для проверки осуществимости MSn в режиме положительных ионов. Как показано на рисунке 2A, ESI-MS (режим положительных ионов) целлобиозы [C 12 H22O11]+ продуцировал протонированную молекулу [M + H]+ при m / z 365. Сканирование ионов продукта (CID-MS/MS) [M+H]+ на m/z 365 привело к получению второго фрагмента иона на m/z 305 (рис. 2B), который был дополнительно проанализирован с использованием анализов MS3 и MS4 (рис. 2C, D). Анализ MS3 привел к третьему фрагменту иона на m/z 254, а анализ MS4 привел к четвертому фрагментному иону на m/z 185. Анализ MS/MS (рис. 2E) показал, что потерянный ион фрагмента в m/z 60 указывает на последовательность фрагментации ионов на m/z 365, а именно гидролиз с раскрытием кольца (отмечен синим цветом), расщепление связи C-C (отмечен красным цветом) и обезвоживание (отмечен зеленым цветом). Аналогичным образом, анализ MS3 показал, что потерянный ион фрагмента при m/z 60 указывает на расщепление связи C-C (отмечено красным) иона при m/z 305. Анализ MS4 показал, что потерянный фрагмент иона при m/z 60 подразумевает гидролиз (отмечен синим цветом) и обезвоживание (отмечен зеленым цветом), что приводит к расщеплению иона с m/z 245 на ион с m/z 185. Ступенчатый переломв анализе MSN показал, что этот метод применим для исследования структуры углеводов.

Предварительный качественный анализ ВМС с использованием ЖХ-К-ТОФ-МС выявил наличие многочисленных неизвестных соединений. Один из них, ион в m/z 617, был выбрандля анализа MSN в отрицательном режиме. Сканирование продукта ионов (CID-MS/MS) [M-H]− при m/z 617 в AMS произвело второй фрагмент иона на m/z 571. Анализ MS3 этого фрагментного иона произвел третий фрагмент иона при m/z 525, а анализ MS4 произвел четвертый фрагмент ионов при m/z 345 и 273 (рис. 3A-D). МС3 m/z 571 дал фрагмент иона при m/z 525 за счет потери части CH2OH в виде метанола (-32 Да) и части OH (-18 Да) в виде воды. Эти результаты MS4 были использованы для ручной идентификации «основной» структуры соединения, а его исходная структура была определена путем сравнения значений m/z иона и его фрагментных ионов. Молекулярная структура соединения в m/z 617 и пути его расщепления в MSn показаны на рисунке 3E. Другое неизвестное соединение на m/z 365 было проанализировано в положительном режиме с использованием MSn. Сканирование ионов продукта (CID-MS/MS) иона [M+H]+ при m/z 365 в AMS дало ионы второго фрагмента при m/z 299, m/z 329 и m/z 347. Анализ MS3 этих фрагментных ионов произвел третий фрагмент иона при m/z 231 (рис. 4A-C). Молекулярная структура и механизм расщепления соединения при m/z 365 показаны на рисунке 4E.

Рисунок 1: Идентификация неизвестных составных структур в тибетской медицине с использованием IT-MS и многоступенчатого масс-спектрометрического анализа. (А) Подвижная фаза для жидкостной хроматографии. (B) Насос жидкостной хроматографии. (C) Комната для образцов. (D) Источник ионов для MS. (E) Внутренняя структура модуля ионной ловушки в MS. (F) Спектр MS4. (G) Информация о молекулярной структуре из результатов MS4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Многоступенчатая фрагментация целлобиозы с помощью IT-MS в режиме положительных ионов . (A) Исходный масс-спектр целлобиозы. (B) Фрагментные ионы в спектре MS/MS. (C) Фрагментные ионы в спектре MS3 . (D) Фрагментные ионы в спектре MS4 . (E) Механизм расщепления и молекулярная структура целлобиозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Многоступенчатая фрагментация и структурный анализ неизвестного иона соединения AMS на m/z 617 с помощью IT-MS в режиме отрицательных ионов . А) Частичный масс-спектр АМС. (B) Фрагментные ионы в спектре MS/MS. (C) Фрагментные ионы в спектре MS3 . (D) Фрагментные ионы в спектре MS4 . (E) Механизм расщепления и молекулярная структура сложного иона AMS при m/z 617. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Многоступенчатый фрагментационный структурный анализ неизвестного иона соединения AMS на m/z 365 с помощью IT-MS в режиме положительных ионов . (А) Частичный масс-спектр ВПП. (B) Фрагментные ионы в спектре MS/MS. (C) Фрагментные ионы в спектре MS3 . (D) Механизм расщепления и молекулярная структура иона соединения AMS при m/z 365. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.