Методическая статья

Ультраструктурная локализация эндогенного LC3 методом срезовой коррелятивной светоэлектронной микроскопии

DOI:

10.3791/65067

⸱

31 марта 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine-Cell Biology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы представляем протокол оптимизированной коррелятивной световой электронной микроскопии на срезе на основе эндогенного флуоресцентного мечения в качестве инструмента для исследования локализации редких белков по отношению к клеточной ультраструктуре. Эффективность этого подхода демонстрируется ультраструктурной локализацией эндогенного LC3 в истощенных клетках без лечения бафиломицином.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация аутофагических органелл на ультраструктурном уровне с помощью электронной микроскопии (ЭМ) необходима для установления их идентичности и выявления деталей, важных для понимания аутофагического процесса. Однако в методах ЭМ часто отсутствует молекулярная информация, что затрудняет корреляцию ультраструктурной информации, полученной с помощью ЭМ, с локализацией специфических белков аутофагии с помощью флуоресцентной микроскопии. Кроме того, редкость аутофагосом в неизмененных клеточных условиях затрудняет исследование с помощью ЭМ, которое требует большого увеличения и, следовательно, обеспечивает ограниченное поле зрения.

В ответ на обе проблемы был применен метод коррелятивной световой электронной микроскопии (CLEM) на срезе, основанный на флуоресцентном мечении, для корреляции общего аутофагосомального маркера, LC3, с ультраструктурой ЭМ. Метод был использован для быстрого скрининга клеток во флуоресцентной микроскопии на мечение LC3 в сочетании с другими соответствующими маркерами. Впоследствии основные ультраструктурные особенности выбранных LC3-меченых пятен были идентифицированы с помощью CLEM. Метод применяли к истощенным клеткам без добавления ингибиторов лизосомального закисления.

В этих условиях LC3 был обнаружен преимущественно на аутофагосомах и редко в аутолизосомах, в которых LC3 быстро деградирует. Эти данные показывают как осуществимость, так и чувствительность этого подхода, демонстрируя, что CLEM может быть использован для получения ультраструктурного понимания LC3-опосредованной аутофагии в естественных условиях - без медикаментозного лечения или генетических изменений. В целом, этот метод представляет собой ценный инструмент для исследования ультраструктурной локализации белков аутофагии и других дефицитных антигенов путем связывания световой микроскопии с данными ЭМ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аутофагия является ключевым процессом для клиренса и переработки цитоплазматических белков и органелл. Процесс макроаутофагии (далее называемый аутофагией) включает в себя образование двухмембранных органелл, аутофагосом, что позволяет клеткам заключать цитоплазматические молекулы и органеллы для лизосомальной деградации. Аутофагия происходит на базальном уровне в большинстве клеток и усиливается в ответ на клеточные условия, такие как голодание или клеточный стресс. Аутофагия происходит либо субстрат-специфичным образом, нацеленным на определенные структуры или белки для деградации, либо как неселективный объемный процесс, охватывающий части цитозоля. При селективной аутофагии аутофагосомы образуются путем конъюгации белков семейства Atg8 (ассоциированных с микротрубочками белков легкой цепи 1A/B 3A/B/C [LC3] и GABARAPs) с мембранами, полученными из перерабатываемых эндосом, Гольджи и/или эндоплазматического ретикулума (ER)1. LC3 распознает аутофагический груз в цитозоле напрямую или через адаптеры селективной аутофагии, такие как P62/SQSTM. Новые аутофагические мембраны затем могут быть конъюгированы с LC3, расширяться и сливаться, образуя законченную двойную мембрану, содержащую груз, называемую аутофагосомой. Аутофагосома созревает и в конечном итоге сливается с эндосомой или лизосомой, после чего аутофагический груз и адапторы деградируют2.

В исследованиях формирования, созревания и слияния аутофагосом часто используются технологии световой микроскопии. Флуоресцентная микроскопия LC3 обычно используется для оценки количества и клеточной локализации аутофагосом в различных условиях. Кроме того, связывая LC3 с pH-чувствительным GFP и pH-стабильным RFP в так называемом тандемном зонде, можно измерить общий поток аутофагии в живых клетках в зависимости от потери флуоресценции GFP3. Эти подходы являются ценными инструментами для исследователей, позволяющими понять роль и механизм аутофагии в различных условиях. Еще одним бесценным инструментом является электронная микроскопия (ЭМ), которая выявляет ультраструктуру аутофагических органелл на разных стадиях аутофагии 4,5,6,7,8. На сегодняшний день ЭМ по-прежнему является методом выбора для определения точных стадий формирования аутофагосом путем различения различных аутофагических мембран по морфологии: фагофор (двойная мембрана, не полностью закрытая), аутофагосома (закрытая двойная мембрана вокруг цитозольного груза) и аутолизосома ([частичная] потеря внутренней аутофагической мембраны). Однако морфология без молекулярной информации может быть подвержена неправильной идентификации или двусмысленности. Иммуно-ЭМ является наиболее полным методом одновременной молекулярной характеристики и морфологической классификации аутофагических органелл. Например, мечение ЛК3 иммунозолотом на размороженных криосекциях позволяет ультраструктурно локализовать ЛК3 и точно идентифицировать ЛК3-меченые органеллы9.

Недостатком ЭМ является малое поле зрения, которое приходит с большим увеличением, необходимым для наблюдения тонкой ультраструктуры аутофагических мембран и, в случае иммуно-ЭМ, для определения метки, которая маркирует интересующий белок. Из-за их дефицита и низкого уровня белка это, как правило, затрудняет количественный ЭМ-анализ аутофагосом. Чтобы увеличить количество аутофагосом, клетки часто голодают и обрабатывают бафиломицином А1 (BafA1), ингибитором лизосомального закисления и деградации. Без лечения BafA1 поиск аутофагосом с помощью ЭМ занимает много времени из-за дефицита этих органелл. Метод, представленный в данной рукописи, решает эту проблему путем флуоресцентного мечения и визуализации эндогенного LC3 на размороженных криосекциях во флуоресцентном микроскопе перед дальнейшей подготовкой к ЭМ. Флуоресцентные изображения затем направляют поиск LC3-меченых структур в ЭМ. После сбора ЭМ-изображения коррелируют с флуоресцентными изображениями, чтобы добавить молекулярную информацию — наличие LC3 — к ультраструктуре клетки. Этот метод «на сечении» значительно повышает способность находить LC3-меченые структуры, особенно в необработанных условиях, для последующей идентификации и классификации с помощью ЭМ.

Этот метод был применен к истощенным клеткам гепатобластомы HEPG210 для поиска аутофагосом в неизмененных (т.е. без использования BafA1) условиях. Было обнаружено относительно небольшое количество флуоресцентных пунктов (менее одного на профиль клетки в срезе 90 нм), что согласуется с высокой оборачиваемостью LC311. Эта разреженность LC3-puncta подчеркивала ценность CLEM; путем отбора участков с несколькими флуоресцентными пунктами для визуализации в ЭМ были обнаружены и охарактеризованы LC3-положительные органеллы гораздо более эффективным образом, чем с помощью обычной иммуно-ЭМ. Это показало, что большинство LC3-положительных органелл были аутофагосомами, что определяется их морфологией, что контрастирует с результатами, полученными в клетках, обработанных BafA1, где аутолизосомыболее распространены. Эти данные показывают, что с помощью КЛЭМ на срезе аутофагия может быть изучена на ультраструктурном уровне без необходимости ингибирования аутофагического потока.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка инструментов и реактивов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации о необходимых реагентах, буферах и растворах см. Дополнительный файл 1 или 12 . Подробную информацию обо всех материалах, реагентах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов.

  1. Фиксаторы
    1. Подготовьте 0,2 М фосфатный буфер (ПБ) или 0,2 М ТРУБЫ, HEPES, EGTA, MgSO4 (PHEM), как описано в Дополнительном файле 1, для использования в качестве основы для фиксирующих растворов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксаторы обычно буферизуются в буфере 0,1 М PB или PHEM для защиты от закисления, вызванного реакцией альдегида с биологическим материалом.
    2. Поскольку качество параформальдегида (PFA) является ключом к надежной фиксации ультраструктуры образцов, используйте PFA EM-класса. Чтобы следовать этому протоколу, используйте 16% исходные растворы, приготовленные из высококачественных гранул PFA (см. Дополнительный файл 1).
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид является опасным химическим веществом (заявления об опасности H228, H301, H302, H311, H314, H315, H317, H318, H331, H332, H335, H341, H350). При работе с PFA надевайте средства защиты (перчатки, лабораторный халат и защитные очки) и работайте в химическом капюшоне. Отходы, содержащие PFA, должны собираться и утилизироваться в соответствии с руководящими принципами и правилами институтов.
    3. Смешайте 10 мл 0,2 М ПБ, 5 мл 16% ПФА (в деминерализованной воде [dH 2 O]) и 5 мл dH2O для приготовления фиксирующего раствора 4% PFA.
    4. Необязательно: Добавление 0,02%-0,5% глутарового альдегида (ГА) к фиксирующему раствору, начиная с этапа 1.1.3, улучшает сохранность ультраструктуры, но снижает антигенность образца по отношению ко многим антителам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется фиксация GA, используйте GA EM-класса от подходящего поставщика.
      ВНИМАНИЕ: Глутаровый альдегид является опасным химическим веществом (заявления об опасности H301, H302, H314, H317, H330, H332, H334, H335, H400, H411). Работайте в химическом капюшоне и надевайте средства защиты (перчатки, лабораторный халат и защитные очки) при работе с ГА. Отходы, содержащие ГА, должны собираться и утилизироваться в соответствии с руководящими принципами и правилами институтов.
  2. Инструменты и материалы
    1. Поцарапайте поверхность алюминиевых штифтов держателя образцов и обработайте их ультразвуком в этаноле 3 x 10 мин, чтобы удалить остатки металла и обеспечить оптимальное сцепление при установке на штифты блоков клеток, залитых желатином.
    2. Используйте контейнер для хранения, подходящий для хранения алюминиевых штифтов держателя образцов с их образцами в жидком азоте (LN2).
    3. Сделайте манипулятор, прикрепив один волосок или ресницу к концу деревянной шпажки с помощью лака для ногтей.
    4. Сделайте петлю звукоснимателя. Согните проволоку из нержавеющей стали толщиной 0,3 мм вокруг круглого стержня диаметром 3 мм и скрутите концы вместе, образовав петлю на одном конце. Вставьте скрученные концы в наконечник пипетки. Вставьте с другого конца деревянную шпажку и прикрепите клеем или смолой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Петля звукоснимателя также имеется в продаже (см. Таблицу материалов).
    5. Чтобы подготовить петли для сушки сетки, выполните те же действия, что и для изготовления петель для захвата: сформируйте проволоку из нержавеющей стали в петлю диаметром 4 мм и прикрепите к большому наконечнику пипетки клей или смолу.
    6. Покройте решетки тонкой поддерживающей пленкой, такой как formvar (протокол в Дополнительном файле 1). Перед использованием покройте сетки тонким слоем карбона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовые к использованию сетки имеются в продаже (см. Таблицу материалов). Решетки с покрытием Formvar можно хранить неограниченное время при комнатной температуре (RT); Решетки с углеродным покрытием могут храниться в RT в течение нескольких месяцев.
    7. Подготовьте чистые предметные стекла и большие защитные стекла (24 мм x 24 мм идеально подходит для стеклянных стекол шириной 25 мм), как показано на рисунке 13.

2. Фиксация и пробоподготовка

  1. Фиксация
    1. Используйте фиксатор, приготовленный на этапе 1.1.3 (4% PFA в 0,1 М PB). Для адгезивных клеточных линий культивируют 1-5 × 10 6 клеток в чашках6 см. Добавляют фиксатор в питательную среду в соотношении 1:1 и инкубируют образец в течение 5 мин при RT. Затем смесь со средней фиксацией заменяют только фиксатором и инкубируют в течение 2 ч при РТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное количество клеток, слияние и условия культивирования могут варьироваться в зависимости от используемой модельной системы.
    2. Хранят образцы в течение ночи или до 3-4 недель в 0,5% PFA в 0,1 M PB при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: GA может быть добавлен к фиксации (см. шаг 1.1.4) и длина фиксации может быть изменена для нахождения оптимального баланса между сохранением морфологии и антигенности, которая отличается в зависимости от образца и маркировки. Дополнительные сведения см. в разделе14.
  2. Пример встраивания
    1. Вымойте посуду с фиксированными ячейками 3 раза с помощью PBS на RT. Затем замените PBS, содержащим 0,15% глицина, и инкубируйте в течение 10 мин при RT.
    2. Замените PBS, содержащий 0,15% глицина, на 1% желатин в PBS, предварительно нагретом до 37 °C, и соскребите и перенесите клетки в 1% желатине в микроцентрифужную пробирку. Гранулируют клетки при 6 000 × г в течение 1 мин при RT в микроцентрифуге. Затем удалите 1%-ный желатин, не нарушая гранулу, и добавьте 12% желатина, подогретого до 37 °C. Ресуспендируйте гранулы клеток, осторожно пипетируя вверх и вниз наконечниками пипеток или стеклянными пипетками Пастера, предварительно нагретыми до 37 °C.
    3. Инкубируют при 37 °С в течение 10 мин; Затем гранулируют клетки при 6 000 × г в течение 1 мин. Затвердейте желатин на льду в течение 30 минут.
    4. Чтобы удалить клетки с желатином из пробирки, отрежьте конец трубки, содержащий гранулу, от остальной части трубки лезвием бритвы. Затем, перпендикулярно первому срезу, разрежьте конец трубки с клеточной гранулой пополам.
    5. Инкубируют две половинки с концами трубки, содержащие гранулы клеток с желатином, в 2,3 М сахарозе в течение 10 мин при 4 °C. Это приводит к тому, что половинки гранул ячеек с желатином слегка сжимаются и вытесняются из пластиковой трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы с желатиновыми ячейками следует хранить при температуре 4 °C или ледяной температуре, насколько это возможно, чтобы сахароза 2,3 М не стала слишком вязкой, а желатин слишком мягким. Во время манипуляций с гранулами клеток с желатином на следующих этапах работайте только с одним образцом за раз, а остальные держите на льду или работайте в холодном (~4 °C) помещении. Избегайте перегрева гранул с желатиновыми ячейками солнечным светом, горячими лампами микроскопа или другими источниками тепла.
    6. Удалите половинки трубки с гранулами клеток с желатином из 2,3 М сахарозы. Затем пинцетом извлеките половинки гранул из пластиковой трубки с помощью пинцета. Вручную разрежьте гранулу на блоки соответствующего размера (~1мм3) лезвием бритвы. Используйте стереоанализирующий микроскоп, чтобы увеличить объект во время резки.
    7. Вливать в желатиновые клеточные блоки 2,3 М сахарозы в течение 3-16 ч, вращая встык в роторе при 4 °C.
    8. Поместите блок ячеек с желатином на алюминиевый штифт держателя образца (см. шаг 1.2.1). Оставьте достаточно 2,3 М сахарозы по краям блока, чтобы она образовала тонкий «воротник» между блоком и штифтом. Избегайте слишком большого количества 2,3 М сахарозы, покрывающей верхнюю часть блока. Замораживание и хранение в LN2.

3. Секционирование

  1. Обрезка (см. также12)
    1. Возьмите из хранилища LN2 штифт с блоком залитых желатином клеток и поместите его в криомикротом, установленный при температуре -80 °C.
    2. Обрежьте переднюю часть блока, чтобы выровнять его поверхность и получить участки ~250 нм. Окуните петлю диаметром 3 мм в раствор пикапа (1:1 2,3 М сахарозы и 2% метилцеллюлозы), вставьте петлю в криокамеру микротома и подождите, пока в капле не начнет образовываться лед (обычно 5-7 с). Затем сразу же возьмите срезы, быстро, но осторожно прижав к ним каплю. Снимите петлю с криокамеры, подождите, пока капля полностью оттает, и прижмите каплю к предметному стеклу.
    3. Проверьте ориентацию ячеек путем окрашивания срезов толуидиновым синим.
      1. Нанесите каплю раствора толуидинового синего (см. Дополнительный файл 1) поверх секций на предметном стекле и высушите на нагревательной пластине при температуре 80 °C, пока края капли не высохнут.
      2. Снимите предметное стекло с нагревательной пластины и осторожно смойте толуидиновый синий dH2O, собрав его в подходящий контейнер для отходов.
      3. Высушите предметное стекло и проверьте ориентацию клеток в срезах с помощью простого настольного светового микроскопа.
    4. Обрежьте боковые стороны блока, сделав надрез 50-100 мкм в боковой части грани образца блока с помощью ножевого уголка. Обрежьте четыре стороны грани блока образца, повернув держатель образца на 90° после обрезки каждой стороны, чтобы создать выступающий прямоугольник размером ~250 мкм x 375 мкм. Выделите выступающую область в соответствии с ориентацией ячейки, определенной на предыдущем шаге.
  2. Секционирование и подбор
    1. Охладите криомикротом до -100 °C. Отрежьте ленту от выступающего прямоугольника, отрезки толщиной 70-90 нм с серебристо-золотистым отливом. Отведите срезы от края алмазного ножа волоском на палочке (см. раздел 1.2.3), чтобы получилась длинная (2-5 мм) лента.
    2. После того, как сформируется подходящая лента, прекратите секционирование, чтобы забрать ленту. Окуните 3-миллиметровую петлю в 2,3 М сахарозы и 2% метилцеллюлозы, смешанных 1:1, вставьте петлю в криокамеру микротома и подождите, пока капля не начнет замерзать (обычно 5-7 с). Затем сразу же подберите срезы, быстро, но осторожно прижимая к ним каплю. Извлеките петлю из криокамеры, подождите, пока капля полностью оттает, и прижмите каплю к подготовленной сетке (шаг 1.2.6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решетки с секциями можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких месяцев.

4. Маркировка и световая микроскопия

  1. Маркирование
    1. Поместите решетки секциями (Рисунок 1A) стороной вниз на ~1 мл PBS в небольшую чашку или многолуночную тарелку. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе удаляется желатин, который находится между ячейками; Желатин после секционирования не нужен и мешает оставшемуся протоколу.
    2. Обработайте сетки стороной вниз на каплях ~75 мкл на парапленке (см. рис. 1B). Начните с промывки PBS + 0,15% глицина (3 x 2 мин) при RT. Затем инкубируют сетки с 0,1% бычьим сывороточным альбумином (BSA)-c + 0,5% желатином из рыбьей кожи (FSG) в PBS в течение 10 мин при RT в качестве стадии блокировки. Первичные антитела разводят в 0,1% BSA-c + 0,5% FSG в PBS и инкубируют сетки на ~10 мкл капель этого раствора в течение 1 ч при RT (рис. 1C).
    3. Промыть сетки 0,1% BSA в PBS 5x на RT. Затем разводят вторичные антитела и 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; 10 мкг/мл) в 0,1% BSA-c + 0,5% FSG в PBS и инкубируют сетки на ~10 мкл капель этого раствора в течение 30+ мин при RT (рис. 1C). Промойте решетки в PBS 5x на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опционально вторичное антитело может быть помечено 5, 10, 15 или 20 нм частицами коллоидного золота, конъюгированными с белком А (PAG) для локализации интересующего белка при ЭМ. При желании инкубируют сетки с ПАГ в течение 20 мин при РТ после шага 4.1.3. Затем промойте 5 раз PBS на RT. Избегайте одновременного использования нескольких первичных антител и обратите внимание на реактивность PAG к IgG разных видов, чтобы предотвратить нежелательные перекрестные реакции. Дополнительные сведения см. в разделе12.
  2. Монтажные образцы для световой микроскопии
    1. Погрузите решетки в 50% глицерин в dH 2 O2x 5 мин при RT. Поместите сетки между предметным стеклом и покровным стеклом в 50% глицерин, по одной сетке на покровное стекло, так, чтобы секции были обращены к покровному стеклу (Рисунок 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Качество маркировки может ухудшиться, если решетки хранятся в 50% глицерине более 30 минут. Поэтому рекомендуется монтировать и образовывать две или три сетки одновременно, а остальные оставлять на вторичном растворе для маркировки.
  3. Световая микроскопия
    1. Возьмите предметное стекло с многослойными сетками на широкопольный микроскоп с автоматизированным столиком. Выберите масляный объектив с большим увеличением (63x или 100x). Создайте мозаичный набор изображений (часть) ленты разделов (рисунок 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые вторичные антитела могут образовывать флуоресцентные агрегаты на сетках, особенно вокруг складок или разрывов в срезах. Кроме того, некоторые типы клеток и тканей содержат автофлуоресцентные структуры. Если такие проблемы ожидаются, рекомендуется включить отрицательную контрольную сетку, не инкубированную с первичными антителами.
  4. Размонтирование и электромагнитный контраст
    1. Добавьте 10 мкл dH2O на боковую сторону сэндвича из предметного стекла и покрытия и подождите, пока капиллярное действие заполнит границу раздела стекло-покровное стекло. Осторожно снимите покровное стекло, не смешивая погружное масло с глицерином. Извлеките сетки пинцетом и погрузите в dH2O 3x при RT, чтобы смыть 50% глицерина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Масло может препятствовать окрашиванию уранила и ухудшать электромагнитный контраст.
    2. Аккуратно просушите тыльную сторону сетки безворсовой папиросной бумагой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец также был помечен частицами коллоидного золота, выполните следующие действия: поместите сетку секциями вниз на капли PBS и промойте 2 раза при RT. Постфикс в 1% GA в течение 5 мин при RT (см. предостережение под 1.1.4). Стирка в PBS 2x на RT.
    3. Поместите решетки стороной вниз на капли dH2O и промойте 8 раз при RT.
    4. Для окрашивания срезов для контрастирования в ЭМ инкубируют с уранилацетатом (UA), pH 7, в течение 5 мин при RT (рис. 1F).
    5. Перед размещением сеток охладите UA:метилцеллюлозу, рН 4, поместив капли на парапленке на металлическую пластину на льду. Затем промойте решетки ледяной UA: метилцеллюлозой, pH 4, 2x и инкубируйте с ледяной UA: метилцеллюлозой, pH 4, в течение 10 мин (рисунок 1F).
      ВНИМАНИЕ: Уранилацетат является опасным химическим веществом (заявления об опасности H300, H330, H373, H411). На этапах, требующих UA, работайте в химическом капюшоне и надевайте средства защиты (лабораторный халат, перчатки и защитные очки). Собирать и утилизировать отходы, содержащие ЕС, в соответствии с руководящими принципами и правилами институтов.
    6. Выкрутите сетки, вставив петлю для сушки сетки в каплю UA:метилцеллюлозы под сеткой и осторожно приподняв ее, пока сетка не снимется с капли12. Удалите излишки UA:метилцеллюлозы, прикоснувшись петлей под углом ~60° (секциями вниз) к безворсовой фильтровальной бумаге (см. Таблицу материалов) и медленно протаскивая ее по бумаге до тех пор, пока UA:метилцеллюлоза не перестанет впитываться. Затем поместите петлю с сеткой в подходящую решетку и дайте высохнуть в течение >10 минут при RT (Рисунок 1G).

5. ЭМ

  1. Используйте обзор, полученный с помощью световой микроскопии, для определения области интереса (ROI) для визуализации в просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ; Рисунок 1Н). Аннотируйте ROI в наборе данных световой микроскопии. После того, как регион выбран, получите набор тайлов изображения с увеличением 20 000x-50 000x в TEM. Реконструируйте набор тайлов изображения в программном обеспечении для постобработки15,16.

6. Корреляция и анализ

  1. Загрузите набор данных световой микроскопии и ЭМ в подходящее программное обеспечение для обработки изображений, такое как ImageJ/Fiji17, плагин ec-CLEM в Icy18 или Photoshop. Обрежьте и поверните набор данных для световой микроскопии в соответствии с набором листов EM.
    1. Выполните корреляцию на основе сигнала DAPI во флуоресценции и ядерных контурах в ЭМ (рис. 1I). Смещайте изображения, чтобы точно накладывать их друг на друга, и точно выполняйте ручную корреляцию. Чтобы сделать подход более точным, примените корреляцию на основе ориентиров, например, с помощью плагина ec-CLEM в Icy или плагина BigWarp в ImageJ, чтобы коррелировать изображения путем ручного выбора соответствующих точек. Подробный, пошаговый протокол корреляции с ec-CLEM доступен19.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подход также хорошо работает с использованием бимодальных реперных зондов20,21.
  2. Проанализируйте коррелированные изображения, выбрав ROI на основе флуоресцентного сигнала в подходящей программе (например, ImageJ). Для количественного анализа создайте коллекцию ROI для всех помеченных органелл. Затем изучите соответствующую ультраструктуру отдельных ROI и классифицируйте их по морфологическим элементам.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптимизированный иммуно-ЭМ протокол для иммунозолотого мечения LC3 на ультратонких криосрезах был недавно опубликован De Maziere et al.9. Это исследование включало голодание без BafA1, в которых LC3 присутствовал, но относительно редко и его было трудно обнаружить с помощью ЭМ. В отдельном исследовании был представлен метод CLEM на срезе, который использует чувствительность флуоресцентного мечения для визуализации относительно редких и низкоэкспрессируемых эндогенных белков и соотнесения их с ультраструктурой ЭМ14. Здесь эти два подхода объединены с помощью оптимизированного протокола маркировки LC3 в рамках CLEM-подхода.

Клетки HEPG2, клетки печени с относительно высокими уровнями базальной аутофагии22, голодали в минимальной среде (сбалансированный раствор соли Эрла [EBSS]) в течение 2 ч до фиксации в 4% PFA. За этим последовала пробоподготовка методом ультратонкого криосекционирования Токуясу (разделы 1-3; см. Слот и Гёзе12), который хорошо совместим с CLEM 14,23 на сечении. Размороженные криосрезы флуоресцентно мечили (раздел протокола 4 и рис. 1) с использованием мышиного первичного антитела9 к LC3. Кроме того, для индикации эндолизосом использовался кроличий анти-LAMP1, за которым следовали вторичные антитела к мышам AlexaFluor488 и антикроличьи AlexaFluor568. Сетки были зажаты между покровным стеклом и предметным стеклом и визуализированы на РТ на широкопольном микроскопе (масляный объектив 100x 1,47 NA, камера sCMOS).

Преимуществом флуоресцентного мечения тонких срезов перед обычными цельноклеточными ПЧ является повышенное разрешение по Z, так как физическая толщина среза составляет 60-90 нм. Благодаря этому улучшенному Z-разрешению, флуоресцентное мечение LC3 и LAMP1 на тонких срезах показывает очень слабую колокализацию (рис. 2A). В клетках, обработанных лизосомальными ингибиторами, такими как BafA1, наблюдается высокая колокализация, поскольку лизосомально заключенный LC3 остается недеградированным9. В необработанных клетках LC3 быстро разрушается при контакте с ферментативно активными, LAMP1-положительными лизосомами, и поэтому колокализация в этих условиях встречается редко. Как правило, наблюдалось менее одного LC3 punctum на профиль клетки. Это указывает на то, что даже в условиях голодания оборот аутофагосом происходит быстро, что приводит к низкому уровню аутофагосом. Это также подчеркивает важность использования CLEM для поиска редких структур, меченных LC3, используя большое поле зрения, обеспечиваемое световой микроскопией. Кроме того, более высокая чувствительность флуоресцентного мечения по сравнению с мечением золотом позволяет идентифицировать больше LC3-положительных органелл, чем в обычном иммуно-ЭМ, что еще больше облегчает их характеристику.

После получения полного набора тайлов ленты срезов, сетки извлекали из микроскопа и постокрашивали на ЭМ с использованием UA и методом loop-out (шаги протокола 4.4-4.6; Рисунок 1F,G). Этот метод «петли» гарантирует, что тонкий слой UA:метилцеллюлозы остается на сетке, что создает желаемый контраст в ЭМ. Толщина слоя зависит от скорости и угла, с которым UA:метилцеллюлоза смывается на фильтровальную бумагу. Слишком быстрое перетаскивание цикла может привести к тому, что на сетке останется слишком много UA:метилцеллюлозы и потемнеет внешний вид секций в EM. Слишком медленное перетаскивание может оттянуть слишком много UA:метилцеллюлозы, что приведет к слишком малому окрашиванию и плохой морфологии, а также рискует выпадением сетки из петли. «Масляное пятно» (рис. 1G) на сухих сетках указывает на подходящую толщину слоя UA:метилцеллюлозы.

После выхода из контура и сушки сетки визуализировались в ПЭМ при ROI, выбранных с помощью флуоресценции. Наборы данных ПЧ и ЭМ коррелировали путем наложения сигнала DAPI на контуры ядер, видимых в ЭМ, создавая интегрированное изображение, содержащее информацию об обеих модальностях.

Найти ту же область в EM, что и выбранная в ПЧ, может быть непросто. Поэтому рекомендуется иметь под рукой обзорное изображение набора тайлов IF при поиске в EM. Пользователи должны искать узнаваемые особенности в обеих модальностях, такие как складки или разрывы в сечениях, полосы сетки или расположение ядер. Также важно иметь в виду, что образец может выглядеть повернутым и зеркально отраженным в электромагнитном диапазоне. Для упрощения корреляции можно использовать «сетки поиска» со специфическими функциями для идентификации областей (см. Таблицу материалов).

Корреляция LC3-положительных органелл с ультраструктурой ЭМ показала, что различные пункты представляют собой различные стадии аутофагии (рис. 2B). Несмотря на то, что сохранение аутофагосомальной ультраструктуры в криосекциях является сложной задачей, часто наблюдались органеллы с цитоплазматическим содержимым и двойными мембранами (рис. 2C, стрелки в органеллах 1-5; Дополнительный рисунок S1), которые являются определяющими морфологическими особенностями аутофагосом. Интересно, что довольно слабые флуоресцентные пятна были идентифицированы ЭМ как LC3-положительные аутолизосомы (рис. 2С, органелла 6; аутофагическое содержание отмечено *), характеризующиеся плотным содержимым и внутрипросветными везикулами. Это показало, что очень малые количества LC3 видны в ПЧ ультратонких криосекций, и указало на то, что, несмотря на деградационную среду, некоторое количество LC3 обнаруживается в стационарных автолизосомах. Однако большинство LC3-положительных пунктатов представляли собой аутофагосомы, в то время как аутолизосомы встречались очень редко. Это отличается от клеток, обработанных BafA1, которые в основном накапливают аутолизосомы, а не аутофагосомы.

Таким образом, этот протокол описывает метод CLEM на срезе для связывания молекулярной информации, полученной с помощью флуоресцентной микроскопии, с ультраструктурой ЭМ. Этот метод повышает чувствительность иммуно-ЭМ, так как для мечения используются только флуорофоры, которые обычно дают больше сигнала, чем ЭМ-зонды. Метод особенно подходит для использования ультратонких криосекций, в которых можно получить высокие уровни специфической флуоресценции при незначительном фоновом окрашивании. Используя флуоресценцию для скрининга редких структур или событий и сопоставляя выбранные ROI с EM, можно значительно сократить время работы EM и связанные с этим затраты. Чувствительность и осуществимость метода демонстрируется визуализацией LC3 в необработанных, истощенных клетках, показывающей, что LC3 преимущественно связывается с аутофагосомами в этих условиях, с очень низкими уровнями, видимыми в аутолизосомах.

figure-results-1
Рисунок 1: Схематическое изображение КЛЭМ на разрезе . (А) Криосрезы из ячеек, внедренных в желатин, собираются на медной сетке, покрытой формваром. (Б) Сетки обрабатываются по частям на каплях соответствующих растворов. (C) Сетки помечены первичными и флуоресцентными вторичными антителами. (D) Сетки зажаты между покровным стеклом и предметным стеклом в 50% глицерина. (E) Флуоресцентные изображения собираются с помощью широкопольного микроскопа. (F) Сетки извлекаются из предметного стекла и далее обрабатываются окрашиванием уранилом для ЭМ. (G) После высыхания сетки могут быть отображены с помощью TEM. (H) Набор тайлов изображений ПЭМ с большим увеличением получен из области, выбранной из данных флуоресценции. (I) Изображения, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии и ЭМ, коррелируют и накладываются друг на друга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: КЛЭМ LC3 и LAMP1 в истощенных клетках HEPG2. Клетки HEPG2 голодали в течение 2 ч в EBSS перед фиксацией 4% PFA в течение 2 ч. (A) Визуализация LC3 (зеленый) и LAMP1 (красный) на срезах показывает относительно небольшое количество LC3 puncta и небольшую колокализацию с LAMP1. (B) Связывание молекулярной информации из ПЧ (левая панель) с ультраструктурной информацией, полученной в ЭМ (средняя панель), путем наложения двух модальностей визуализации, основанных на DAPI и ядерных контурах (пунктирные линии, правая панель). Ультраструктура отдельных компартментов, помеченных LC3, как показано на рисунке 1 (правая панель), показана на рисунке C. (C) Ультраструктура LC3-положительных компартментов. Слева показаны CLEM-изображения, а справа — псевдоцветные (бежевые) EM-изображения (неокрашенные EM-изображения показаны на дополнительном рисунке S1). Внутренняя и наружная аутофагосомные мембраны обозначены белыми и черными стрелками соответственно. Аутофагическое содержание внутри аутолизосомы в примере 6 обозначается *. Масштабные линейки = 10 мкм (А), 1 мкм (В), 200 нм (С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Неокрашенные ЭМ-изображения LC3-положительных органелл. (А-Ж) Неокрашенные ЭМ изображения псевдоцветных примеров 1-6 показаны на рисунке 2C. Органеллы отбирали методом флуоресценции LC3, как показано на рисунке 2. Внутренняя и наружная аутофагосомные мембраны обозначены белыми и черными стрелками соответственно. Аутофагическое содержание внутри аутолизосомы в примере 6 обозначается *. Масштабные линейки = 200 нм. Сокращения: AL = аутолизосома; AP = аутофагосома; M = митохондрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Буферы и растворы, использованные в этом исследовании. Этот дополнительный файл содержит рецепты и протоколы, необходимые для создания буферов и растворов, используемых в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный здесь метод использует преимущества последних достижений в области криосекции КЛЭМ - высокую чувствительность маркировки ПЧ и точную (погрешность <100 нм) корреляцию между ФМ и ЭМ14,24. В результате получается метод с чувствительностью к флуоресцентным меткам дефицитных эндогенных белков и возможностью наложения их с высокой точностью на ультраструктуру ЭМ. Таким образом, этот метод позволяет избежать необходимости (чрезмерной) экспрессии экзогенно меченных белков и использования менее чувствительных ЭМ-меток. Целесообразность метода показана на примерах CLEM на эндогенных LC3 в клетках, лишенных голодания, без применения лизосомальных ингибиторов.

Размороженные криосрезы, полученные методом Токуясу, являются идеальными образцами для иммуно-ЭМ, так как в отличие от смоляных срезов проницаемы для антител. В сочетании с процедурами мягкой фиксации и контрастирования, это, как правило, обеспечивает превосходную эффективность мечения по сравнению с другими методами без ущерба для детализированной ультраструктуры и превосходно визуализирует клеточные мембраны 12,25,26. Кроме того, криосекции хорошо совместимы с флуоресцентной микроскопией, что делает их ценными субстратами для CLEM. Как классическое мечение иммунозолотом, так и CLEM на криосекциях дали плодотворную информацию в понимании субклеточной организации 14,27,28,29,30.

В настоящее время применение CLEM на размороженных криосекциях становится все более распространенным в результате непрерывных разработок и оптимизаций 14,20,24,31,32,33,34, которые улучшили качество, применимость и точность подхода. Теперь, благодаря точной корреляции больших наборов плиток ПЧ и ЭМ изображений, этот метод облегчает скрининг ультраструктуры флуоресцентно меченных эндогенных клеточных компонентов 14,32,33. Это является преимуществом по сравнению с классическим иммуно-ЭМ, где поиск меченых золотом структур обычно требует большого увеличения и, следовательно, является более трудоемким и трудоемким. Именно по этой причине локализация LC3 в ультраструктуре значительно выигрывает от CLEM. LC3-положительные органеллы часто встречаются, когда аутофагический клиренс блокируется (т.е. когда клетки обрабатываются BafA1 или агентами, повышающими pH), в то время как аутофагические органеллы быстро очищаются в неизмененных или истощенных клетках, что приводит к очень низким равновесным уровням. В таких условиях поиск LC3-меченых органелл с помощью классической иммуно-ЭМ может быть сложной задачей, и CLEM дает явное преимущество.

Ранее CLEM на срезах смолы применялся в исследованиях с использованием эктопической экспрессии LC3-GFP или тандемного зонда LC3-GFP-RFP 35,36,37,38,39. В этих исследованиях флуоресцентная визуализация проводилась перед встраиванием или непосредственно в секции40 акриловой смолы, а затем образцы были просеяны с помощью ЭМ. Есть несколько преимуществ встраивания смолы; Аутофагосомная ультраструктура, как правило, хорошо сохраняется, особенно если материал заморожен под высоким давлением40. Более того, контраст окрашенного тяжелыми металлами материала, содержащего смолу, как правило, более выражен, чем у криосекций, окрашенных уранилом. Участки с полимерной инструкцией совместимы с объемными ЭМ-методами, такими как матричная томография, FIB-SEM или последовательная блок-торцевая РЭМ, в то время как криосекции — нет. В подходах, которые выполняют визуализацию перед встраиванием, визуализация живых клеток является вариантом41, который недоступен в CLEM для криосекций. Ключевым преимуществом CLEM на криосекциях по сравнению с этими альтернативами является высокий сигнал IF, позволяющий иммунолокализовать редкие белки без необходимости мембранной пермеабилизации или гиперэкспрессии. Это позволяет избежать потенциальной мембранной экстракции, артефактов гиперэкспрессии42 и генетической модификации субъекта, что в сочетании с возможностью коррелировать большие области в ИФ и ЭМ делает его отличным инструментом для изучения LC3 и аутофагии.

Здесь применение CLEM на срезе к истощенным клеткам HEPG2 показало, что LC3 преимущественно локализуется в структурах, идентифицированных как аутофагосомы. Кроме того, в аутолизосомах было обнаружено несколько слабо флуоресцентных пятен. Это прямо противоположно клеткам, обработанным BafA19 , и отражает быструю деградацию аутофагосомных белков после слияния аутофагосом с лизосомами. В целом, данные продемонстрировали, что CLEM размороженных криосекций может дать представление о LC3-опосредованной аутофагии в нативных условиях. Полученные данные также подчеркивают чувствительность технологии, поскольку LC3 был обнаружен даже в аутолизосомах, которые содержат только низкие уровни интактных эпитопов LC3. Дальнейшее применение этого метода путем визуализации LC3 в различных моделях и условиях улучшит наше понимание аутофагии и других LC3-опосредованных биологических процессов, таких как LC3-ассоциированный фагоцитоз или конъюгация ATG8 с отдельными мембранами.

Помимо аутофагии, КЛЭМ на срезе может применяться к другим редким событиям или структурам, таким как деление клеток, инфекция, редкие типы клеток в тканях, кинетохоры, первичные реснички или органеллы, специфичные для типа клеток. Эффективный скрининг интересующего субъекта с помощью ИФ может значительно облегчить ультраструктурное изучение этих раритетов. Кроме того,было показано, что этот метод может быть использован для локализации белков более чувствительным образом, чем классическая иммуно-ЭМ. Регулировка длины фиксации может еще больше расширить эту чувствительность, позволяя ультраструктурно локализовать очень малораспространенные или плохо антигенные белки. Наконец, метод CLEM на срезах облегчает быстрый отбор количественного числа органелл, способствуя более надежному анализу ультраструктурного распределения данного белка.

Для криосекции требуется оборудование и опыт для криосекции. В группах, имеющих доступ к этим инструментам (например, криомикротомам), реализация КЛЭМ на срезе проста и требует только наличия автоматизированного широкопольного микроскопа, к которому имеет доступ большинство лабораторий. Кроме того, этот метод доступен в учреждениях EM по всему миру. Поскольку КЛЭМ на срезе сочетает в себе применение известных методов ПЧ и ЭМ, метод легко адаптируется и может сочетаться, например, с томографией 20,33,43, серийным срезом объемной ЭМ ограниченного числа секций44 или микроскопией сверхвысокого разрешения 45. Эта универсальность метода позволяет применять его к широкому кругу биологических вопросов.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим коллег из Центра молекулярной медицины Университетской клиники Утрехта за плодотворные дискуссии и обратную связь. Мы благодарим бывших и нынешних коллег из лаборатории Клумпермана за постоянное совершенствование наших технологий микроскопии. Инфраструктура EM, используемая для этой работы, является частью исследовательской программы National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI), финансируемой Голландским исследовательским советом (NWO), проект номер 184.034.014 для JK.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Химикаты и реагенты
Антитела ослик против мыши Alexa Fluor 488Life Technologies#A21202используйте 1:250
Антитело осла против кролика Alexa Fluor 568Life TechnologiesA#10042используйте 1:250
Антитело мыши против LC3Cosmo BioCTB-LC3-2-ICиспользуйте 1:100
Антитело кролик анти-LAMP1Клеточная сигнализация9091использование 1:250
Бычья сыворотка Альбумин, фракция VSigma-AldrichA-9647
BSA-cAurion900.099
BSA-конъюгированное золотоКлеточное микроскопическое ядро, UMC UtrechtBSAG 5 нм
Безводный хлороформMerck1.02447.0500
DAPIInvitrogen10184322Используйте при конечной концентрации 10 &микро; г/мл
EGTASigma-AldrichE4378
Желатин из рыбьей кожиSigma-AldrichG7765
Пищевой желатинMerckG1890
Formvar, Vinylec ESPI02492-RA
GluteraldehydeServa23115.01Смотрите ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ
ГлицериновыйбумMBAK 7044.1000
ГлицинMerck1042010250
HEPESSigma-AldrichH3375
метилцеллюлоза, 25 сантипуазовSigma-AldrichM-6385
MgSO4Riedel-de Haen12142
Na2HPO4 (компонент PB A)Merck106580-0500
NaBH4Merck806373
2PO4 (компонент PB B)Merck106346
NH4OHSigma-Aldrich221228-0025
Щавелевая кислотаMerck100495
параформальдегидные приллыSigma-Aldrich441244Смотрите ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ
ТРУБКИMerck110220
Белок-А сопряженное золотоЯдро для микроскопии клеток, UMC UtrechtPAG 5, 10, 15 или 20 нм
Сахароза D(+)VWR27483294
УранилацетатSPI020624-ABСм. ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ
<сильно>Инструменты и расходные материалы
Петля Электроннаямикроскопия Sciences70944
Фильтровальная бумага, качественная, средне-быстраяLLG6.242 668
Сетки Finder TedPellaG100F1
СеткиЯдро клеточной микроскопии, UMC UtrechtCU 100 меш
<сильно>микроскопы
Leica Thunder широкопольный микроскопLeicaComponents: 100x, объектив 1,47 NA TIRF; Фотометрическая камера prime 95B sCMOS; программное обеспечение LAS X;
Ультракриомикротом Leica UC7Leica
Tecnai T12FEIКомпоненты: камера Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM; SerialEM software
Software
ec-CLEM в ледяномоткрытом исходном кодеPaul-Gilloteaux et al., 2017
Fijiopen sourceSchindelin et al., 2012
IMODopensource Mastronarde et al., 2017
PhotoshopAdobe
SerialEMopen источникMastronarde et al., 2018

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, Y., Reggiori, F. Molecular regulation of autophagosome formation. Biochemical Society Transactions. 50 (1), 55-69 (2022).
  2. Reggiori, F., Ungermann, C. Autophagosome maturation and fusion. Journal of Molecular Biology. 429 (4), 486-496 (2017).
  3. Kimura, S., Noda, T., Yoshimori, T. Dissection of the autophagosome maturation process by a novel reporter protein, tandem fluorescent-tagged LC3. Autophagy. 3 (5), 452-460 (2007).
  4. Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., Ohsumi, Y. Ultrastructural analysis of the autophagic process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. The Journal of Cell Biology. 124 (6), 903-913 (1994).
  5. Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T., Ohsumi, Y. Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction. The Journal of Cell Biology. 119 (2), 301-311 (1992).
  6. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28, 435-492 (1966).
  7. Arstila, A. U., Trump, B. F. Studies on cellular autophagocytosis. The formation of autophagic vacuoles in the liver after glucagon administration. The American Journal of Pathology. 53 (5), 687-733 (1968).
  8. Eskelinen, E. L., Reggiori, F., Baba, M., Kovács, A. L., Seglen, P. O. Seeing is believing: The impact of electron microscopy on autophagy research. Autophagy. 7 (9), 935-956 (2011).
  9. De Mazière, A., et al. An optimized protocol for immuno-electron microscopy of endogenous LC3. Autophagy. 18 (12), 3004-3022 (2022).
  10. López-Terrada, D., Cheung, S. W., Finegold, M. J., Knowles, B. B. Hep G2 is a hepatoblastoma-derived cell line. Human Pathology. 40 (10), 1512-1515 (2009).
  11. Tanida, I., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Lysosomal turnover, but not a cellular level, of endogenous LC3 is a marker for autophagy. Autophagy. 1 (2), 84-91 (2005).
  12. Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nature Protocols. 2 (10), 2480-2491 (2007).
  13. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Current Protocols in Cell Biology. 13 (1), (2001).
  14. vander Beek, J., de Heus, C., Liv, N., Klumperman, J. Quantitative correlative microscopy reveals the ultrastructural distribution of endogenous endosomal proteins. The Journal of Cell Biology. 221 (1), e202106044(2022).
  15. Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
  16. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Paul-Gilloteaux, P., et al. EC-CLEM: Flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nature Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
  19. Heiligenstein, X., Paul-Gilloteaux, P., Raposo, G., Salamero, J. eC-CLEM: A multidimension, multimodel software to correlate intermodal images with a focus on light and electron microscopy. Methods in Cell Biology. 140, 335-352 (2017).
  20. Fermie, J., et al. Bimodal endocytic probe for three-dimensional correlative light and electron microscopy. Cell Reports Methods. 2 (5), 100220(2022).
  21. Fokkema, J., et al. Fluorescently labelled silica coated gold nanoparticles as fiducial markers for correlative light and electron microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 13625(2018).
  22. Czaja, M. J., et al. Functions of autophagy in normal and diseased liver. Autophagy. 9 (8), 1131(2013).
  23. Robinson, J. M., Takizawa, T., Pombo, A., Cook, P. R. Correlative fluorescence and electron microscopy on ultrathin cryosections: Bridging the resolution gap. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (7), 803-808 (2001).
  24. Mohammadian, S., et al. High accuracy, fiducial marker-based image registration of correlative microscopy images. Scientific Reports. 9 (1), 3211(2019).
  25. Tokuyasu, K. T. A study of positive staining of ultrathin frozen sections. Journal of Ultrasructure Research. 63 (3), 287-307 (1978).
  26. Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. European Journal of Cell Biology. 38 (1), 87-93 (1985).
  27. Klumperman, J., Raposo, G. The complex ultrastructure of the endolysosomal system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (10), a016857(2014).
  28. Geuze, H. J., Slot, J. W., Strous, G. J., Lodish, H. F., Schwartz, A. L. Intracellular site of asialoglycoprotein receptor-ligand uncoupling: Double-label immunoelectron microscopy during receptor-mediated endocytosis. Cell. 32 (1), 277-287 (1983).
  29. Biazik, J., Ylä-Anttila, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. Ultrastructural relationship of the phagophore with surrounding organelles. Autophagy. 11 (3), 439-451 (2015).
  30. Fahimi, H. D., Reich, D., Völkl, A., Baumgart, E. Contributions of the immunogold technique to investigation of the biology of peroxisomes. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 105-114 (1996).
  31. Vicidomini, G., et al. A novel approach for correlative light electron microscopy analysis. Microscopy Research and Technique. 73 (3), 215-224 (2010).
  32. Vicidomini, G., et al. High data output and automated 3D correlative light-electron microscopy method. Traffic. 9 (11), 1828-1838 (2008).
  33. Cortese, K., et al. 3D HDO-CLEM: cellular compartment analysis by correlative light-electron microscopy on cryosection. Methods in Cell Biology. 111, 95-115 (2012).
  34. van Rijnsoever, C., Oorschot, V., Klumperman, J. Correlative light-electron microscopy (CLEM) combining live-cell imaging and immunolabeling of ultrathin cryosections. Nature Methods. 5 (11), 973-980 (2008).
  35. Razi, M., Chan, E. Y. W., Tooze, S. A. Early endosomes and endosomal coatomer are required for autophagy. The Journal of Cell Biology. 185 (2), 305-321 (2009).
  36. Ligeon, L. A., Barois, N., Werkmeister, E., Bongiovanni, A., Lafont, F. Structured illumination microscopy and correlative microscopy to study autophagy. Methods. 75, 61-68 (2015).
  37. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: An ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  38. Gudmundsson, S., Kahlhofer, J., Baylac, N., Kallio, K., Eskelinen, E. L. Correlative light and electron microscopy of autophagosomes. Methods in Molecular Biology. 1880, 199-209 (2019).
  39. Kriel, J., et al. Correlative light and electron microscopy (CLEM): bringing together the best of both worlds to study neuronal autophagy. Imaging and Quantifying Neuronal Autophagy. 171, 135-147 (2022).
  40. Largeau, C., Legouis, R. Correlative light and electron microscopy to analyze LC3 proteins in Caenorhabditis elegans embryo. Methods in Molecular Biology. 1880, 281-293 (2019).
  41. Fermie, J., et al. Single organelle dynamics linked to 3D structure by correlative live-cell imaging and 3D electron microscopy. Traffic. 19 (5), 354-369 (2018).
  42. Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: Caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
  43. Ladinsky, M. S., Howell, K. E. Electron tomography of immunolabeled cryosections. Methods in Cell Biology. 79, 543-558 (2007).
  44. Oorschot, V., Lindsey, B. W., Kaslin, J., Ramm, G. TEM, SEM, and STEM-based immuno-CLEM workflows offer complementary advantages. Scientific Reports. 11 (1), 899(2021).
  45. Franke, C., et al. Correlative single-molecule localization microscopy and electron tomography reveals endosome nanoscale domains. Traffic. 20 (8), 601-617 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Correlative Light Electron MicroscopyLC3 LocalizationAutophagic OrganellesElectron MicroscopyFluorescence MicroscopyAutophagosomesImmunogold LabelingAutolysosomesProtein Ultrastructural LocalizationTransmission Electron Microscopy

Похожие статьи