Ультраструктурная локализация эндогенного LC3 методом срезовой коррелятивной светоэлектронной микроскопии

Аутофагия является ключевым процессом для клиренса и переработки цитоплазматических белков и органелл. Процесс макроаутофагии (далее называемый аутофагией) включает в себя образование двухмембранных органелл, аутофагосом, что позволяет клеткам заключать цитоплазматические молекулы и органеллы для лизосомальной деградации. Аутофагия происходит на базальном уровне в большинстве клеток и усиливается в ответ на клеточные условия, такие как голодание или клеточный стресс. Аутофагия происходит либо субстрат-специфичным образом, нацеленным на определенные структуры или белки для деградации, либо как неселективный объемный процесс, охватывающий части цитозоля. При селективной аутофагии аутофагосомы образуются путем конъюгации белков семейства Atg8 (ассоциированных с микротрубочками белков легкой цепи 1A/B 3A/B/C [LC3] и GABARAPs) с мембранами, полученными из перерабатываемых эндосом, Гольджи и/или эндоплазматического ретикулума (ER)¹. LC3 распознает аутофагический груз в цитозоле напрямую или через адаптеры селективной аутофагии, такие как P62/SQSTM. Новые аутофагические мембраны затем могут быть конъюгированы с LC3, расширяться и сливаться, образуя законченную двойную мембрану, содержащую груз, называемую аутофагосомой. Аутофагосома созревает и в конечном итоге сливается с эндосомой или лизосомой, после чего аутофагический груз и адапторы деградируют².

В исследованиях формирования, созревания и слияния аутофагосом часто используются технологии световой микроскопии. Флуоресцентная микроскопия LC3 обычно используется для оценки количества и клеточной локализации аутофагосом в различных условиях. Кроме того, связывая LC3 с pH-чувствительным GFP и pH-стабильным RFP в так называемом тандемном зонде, можно измерить общий поток аутофагии в живых клетках в зависимости от потери флуоресценции GFP³. Эти подходы являются ценными инструментами для исследователей, позволяющими понять роль и механизм аутофагии в различных условиях. Еще одним бесценным инструментом является электронная микроскопия (ЭМ), которая выявляет ультраструктуру аутофагических органелл на разных стадиях аутофагии 4,5,6,7,8. На сегодняшний день ЭМ по-прежнему является методом выбора для определения точных стадий формирования аутофагосом путем различения различных аутофагических мембран по морфологии: фагофор (двойная мембрана, не полностью закрытая), аутофагосома (закрытая двойная мембрана вокруг цитозольного груза) и аутолизосома ([частичная] потеря внутренней аутофагической мембраны). Однако морфология без молекулярной информации может быть подвержена неправильной идентификации или двусмысленности. Иммуно-ЭМ является наиболее полным методом одновременной молекулярной характеристики и морфологической классификации аутофагических органелл. Например, мечение ЛК3 иммунозолотом на размороженных криосекциях позволяет ультраструктурно локализовать ЛК3 и точно идентифицировать ЛК3-меченые органеллы⁹.

Недостатком ЭМ является малое поле зрения, которое приходит с большим увеличением, необходимым для наблюдения тонкой ультраструктуры аутофагических мембран и, в случае иммуно-ЭМ, для определения метки, которая маркирует интересующий белок. Из-за их дефицита и низкого уровня белка это, как правило, затрудняет количественный ЭМ-анализ аутофагосом. Чтобы увеличить количество аутофагосом, клетки часто голодают и обрабатывают бафиломицином А1 (BafA1), ингибитором лизосомального закисления и деградации. Без лечения BafA1 поиск аутофагосом с помощью ЭМ занимает много времени из-за дефицита этих органелл. Метод, представленный в данной рукописи, решает эту проблему путем флуоресцентного мечения и визуализации эндогенного LC3 на размороженных криосекциях во флуоресцентном микроскопе перед дальнейшей подготовкой к ЭМ. Флуоресцентные изображения затем направляют поиск LC3-меченых структур в ЭМ. После сбора ЭМ-изображения коррелируют с флуоресцентными изображениями, чтобы добавить молекулярную информацию — наличие LC3 — к ультраструктуре клетки. Этот метод «на сечении» значительно повышает способность находить LC3-меченые структуры, особенно в необработанных условиях, для последующей идентификации и классификации с помощью ЭМ.

Этот метод был применен к истощенным клеткам гепатобластомы HEPG2¹⁰ для поиска аутофагосом в неизмененных (т.е. без использования BafA1) условиях. Было обнаружено относительно небольшое количество флуоресцентных пунктов (менее одного на профиль клетки в срезе 90 нм), что согласуется с высокой оборачиваемостью LC3¹¹. Эта разреженность LC3-puncta подчеркивала ценность CLEM; путем отбора участков с несколькими флуоресцентными пунктами для визуализации в ЭМ были обнаружены и охарактеризованы LC3-положительные органеллы гораздо более эффективным образом, чем с помощью обычной иммуно-ЭМ. Это показало, что большинство LC3-положительных органелл были аутофагосомами, что определяется их морфологией, что контрастирует с результатами, полученными в клетках, обработанных BafA1, где аутолизосомы^{более распространены}. Эти данные показывают, что с помощью КЛЭМ на срезе аутофагия может быть изучена на ультраструктурном уровне без необходимости ингибирования аутофагического потока.

1. Подготовка инструментов и реактивов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации о необходимых реагентах, буферах и растворах см. Дополнительный файл 1 или ¹² . Подробную информацию обо всех материалах, реагентах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов.

1. Фиксаторы
   1. Подготовьте 0,2 М фосфатный буфер (ПБ) или 0,2 М ТРУБЫ, HEPES, EGTA, MgSO₄ (PHEM), как описано в Дополнительном файле 1, для использования в качестве основы для фиксирующих растворов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксаторы обычно буферизуются в буфере 0,1 М PB или PHEM для защиты от закисления, вызванного реакцией альдегида с биологическим материалом.
   2. Поскольку качество параформальдегида (PFA) является ключом к надежной фиксации ультраструктуры образцов, используйте PFA EM-класса. Чтобы следовать этому протоколу, используйте 16% исходные растворы, приготовленные из высококачественных гранул PFA (см. Дополнительный файл 1).
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид является опасным химическим веществом (заявления об опасности H228, H301, H302, H311, H314, H315, H317, H318, H331, H332, H335, H341, H350). При работе с PFA надевайте средства защиты (перчатки, лабораторный халат и защитные очки) и работайте в химическом капюшоне. Отходы, содержащие PFA, должны собираться и утилизироваться в соответствии с руководящими принципами и правилами институтов.
   3. Смешайте 10 мл 0,2 М ПБ, 5 мл 16% ПФА (в деминерализованной воде [dH 2 O]) и 5 мл dH₂O для приготовления фиксирующего раствора 4% PFA.
   4. Необязательно: Добавление 0,02%-0,5% глутарового альдегида (ГА) к фиксирующему раствору, начиная с этапа 1.1.3, улучшает сохранность ультраструктуры, но снижает антигенность образца по отношению ко многим антителам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется фиксация GA, используйте GA EM-класса от подходящего поставщика.
      ВНИМАНИЕ: Глутаровый альдегид является опасным химическим веществом (заявления об опасности H301, H302, H314, H317, H330, H332, H334, H335, H400, H411). Работайте в химическом капюшоне и надевайте средства защиты (перчатки, лабораторный халат и защитные очки) при работе с ГА. Отходы, содержащие ГА, должны собираться и утилизироваться в соответствии с руководящими принципами и правилами институтов.
2. Инструменты и материалы
   1. Поцарапайте поверхность алюминиевых штифтов держателя образцов и обработайте их ультразвуком в этаноле 3 x 10 мин, чтобы удалить остатки металла и обеспечить оптимальное сцепление при установке на штифты блоков клеток, залитых желатином.
   2. Используйте контейнер для хранения, подходящий для хранения алюминиевых штифтов держателя образцов с их образцами в жидком азоте (LN₂).
   3. Сделайте манипулятор, прикрепив один волосок или ресницу к концу деревянной шпажки с помощью лака для ногтей.
   4. Сделайте петлю звукоснимателя. Согните проволоку из нержавеющей стали толщиной 0,3 мм вокруг круглого стержня диаметром 3 мм и скрутите концы вместе, образовав петлю на одном конце. Вставьте скрученные концы в наконечник пипетки. Вставьте с другого конца деревянную шпажку и прикрепите клеем или смолой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Петля звукоснимателя также имеется в продаже (см. Таблицу материалов).
   5. Чтобы подготовить петли для сушки сетки, выполните те же действия, что и для изготовления петель для захвата: сформируйте проволоку из нержавеющей стали в петлю диаметром 4 мм и прикрепите к большому наконечнику пипетки клей или смолу.
   6. Покройте решетки тонкой поддерживающей пленкой, такой как formvar (протокол в Дополнительном файле 1). Перед использованием покройте сетки тонким слоем карбона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовые к использованию сетки имеются в продаже (см. Таблицу материалов). Решетки с покрытием Formvar можно хранить неограниченное время при комнатной температуре (RT); Решетки с углеродным покрытием могут храниться в RT в течение нескольких месяцев.
   7. Подготовьте чистые предметные стекла и большие защитные стекла (24 мм x 24 мм идеально подходит для стеклянных стекол шириной 25 мм), как показано на ^{рисунке 13}.

2. Фиксация и пробоподготовка

1. Фиксация
   1. Используйте фиксатор, приготовленный на этапе 1.1.3 (4% PFA в 0,1 М PB). Для адгезивных клеточных линий культивируют 1-5 × 10 6 клеток в чашках⁶ см. Добавляют фиксатор в питательную среду в соотношении 1:1 и инкубируют образец в течение 5 мин при RT. Затем смесь со средней фиксацией заменяют только фиксатором и инкубируют в течение 2 ч при РТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное количество клеток, слияние и условия культивирования могут варьироваться в зависимости от используемой модельной системы.
   2. Хранят образцы в течение ночи или до 3-4 недель в 0,5% PFA в 0,1 M PB при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: GA может быть добавлен к фиксации (см. шаг 1.1.4) и длина фиксации может быть изменена для нахождения оптимального баланса между сохранением морфологии и антигенности, которая отличается в зависимости от образца и маркировки. Дополнительные сведения см. в разделе¹⁴.
2. Пример встраивания
   1. Вымойте посуду с фиксированными ячейками 3 раза с помощью PBS на RT. Затем замените PBS, содержащим 0,15% глицина, и инкубируйте в течение 10 мин при RT.
   2. Замените PBS, содержащий 0,15% глицина, на 1% желатин в PBS, предварительно нагретом до 37 °C, и соскребите и перенесите клетки в 1% желатине в микроцентрифужную пробирку. Гранулируют клетки при 6 000 × г в течение 1 мин при RT в микроцентрифуге. Затем удалите 1%-ный желатин, не нарушая гранулу, и добавьте 12% желатина, подогретого до 37 °C. Ресуспендируйте гранулы клеток, осторожно пипетируя вверх и вниз наконечниками пипеток или стеклянными пипетками Пастера, предварительно нагретыми до 37 °C.
   3. Инкубируют при 37 °С в течение 10 мин; Затем гранулируют клетки при 6 000 × г в течение 1 мин. Затвердейте желатин на льду в течение 30 минут.
   4. Чтобы удалить клетки с желатином из пробирки, отрежьте конец трубки, содержащий гранулу, от остальной части трубки лезвием бритвы. Затем, перпендикулярно первому срезу, разрежьте конец трубки с клеточной гранулой пополам.
   5. Инкубируют две половинки с концами трубки, содержащие гранулы клеток с желатином, в 2,3 М сахарозе в течение 10 мин при 4 °C. Это приводит к тому, что половинки гранул ячеек с желатином слегка сжимаются и вытесняются из пластиковой трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы с желатиновыми ячейками следует хранить при температуре 4 °C или ледяной температуре, насколько это возможно, чтобы сахароза 2,3 М не стала слишком вязкой, а желатин слишком мягким. Во время манипуляций с гранулами клеток с желатином на следующих этапах работайте только с одним образцом за раз, а остальные держите на льду или работайте в холодном (~4 °C) помещении. Избегайте перегрева гранул с желатиновыми ячейками солнечным светом, горячими лампами микроскопа или другими источниками тепла.
   6. Удалите половинки трубки с гранулами клеток с желатином из 2,3 М сахарозы. Затем пинцетом извлеките половинки гранул из пластиковой трубки с помощью пинцета. Вручную разрежьте гранулу на блоки соответствующего размера (~1^мм3) лезвием бритвы. Используйте стереоанализирующий микроскоп, чтобы увеличить объект во время резки.
   7. Вливать в желатиновые клеточные блоки 2,3 М сахарозы в течение 3-16 ч, вращая встык в роторе при 4 °C.
   8. Поместите блок ячеек с желатином на алюминиевый штифт держателя образца (см. шаг 1.2.1). Оставьте достаточно 2,3 М сахарозы по краям блока, чтобы она образовала тонкий «воротник» между блоком и штифтом. Избегайте слишком большого количества 2,3 М сахарозы, покрывающей верхнюю часть блока. Замораживание и хранение в LN₂.

3. Секционирование

1. Обрезка (см. также¹²)
   1. Возьмите из хранилища LN₂ штифт с блоком залитых желатином клеток и поместите его в криомикротом, установленный при температуре -80 °C.
   2. Обрежьте переднюю часть блока, чтобы выровнять его поверхность и получить участки ~250 нм. Окуните петлю диаметром 3 мм в раствор пикапа (1:1 2,3 М сахарозы и 2% метилцеллюлозы), вставьте петлю в криокамеру микротома и подождите, пока в капле не начнет образовываться лед (обычно 5-7 с). Затем сразу же возьмите срезы, быстро, но осторожно прижав к ним каплю. Снимите петлю с криокамеры, подождите, пока капля полностью оттает, и прижмите каплю к предметному стеклу.
   3. Проверьте ориентацию ячеек путем окрашивания срезов толуидиновым синим.
      1. Нанесите каплю раствора толуидинового синего (см. Дополнительный файл 1) поверх секций на предметном стекле и высушите на нагревательной пластине при температуре 80 °C, пока края капли не высохнут.
      2. Снимите предметное стекло с нагревательной пластины и осторожно смойте толуидиновый синий dH₂O, собрав его в подходящий контейнер для отходов.
      3. Высушите предметное стекло и проверьте ориентацию клеток в срезах с помощью простого настольного светового микроскопа.
   4. Обрежьте боковые стороны блока, сделав надрез 50-100 мкм в боковой части грани образца блока с помощью ножевого уголка. Обрежьте четыре стороны грани блока образца, повернув держатель образца на 90° после обрезки каждой стороны, чтобы создать выступающий прямоугольник размером ~250 мкм x 375 мкм. Выделите выступающую область в соответствии с ориентацией ячейки, определенной на предыдущем шаге.
2. Секционирование и подбор
   1. Охладите криомикротом до -100 °C. Отрежьте ленту от выступающего прямоугольника, отрезки толщиной 70-90 нм с серебристо-золотистым отливом. Отведите срезы от края алмазного ножа волоском на палочке (см. раздел 1.2.3), чтобы получилась длинная (2-5 мм) лента.
   2. После того, как сформируется подходящая лента, прекратите секционирование, чтобы забрать ленту. Окуните 3-миллиметровую петлю в 2,3 М сахарозы и 2% метилцеллюлозы, смешанных 1:1, вставьте петлю в криокамеру микротома и подождите, пока капля не начнет замерзать (обычно 5-7 с). Затем сразу же подберите срезы, быстро, но осторожно прижимая к ним каплю. Извлеките петлю из криокамеры, подождите, пока капля полностью оттает, и прижмите каплю к подготовленной сетке (шаг 1.2.6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решетки с секциями можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких месяцев.

4. Маркировка и световая микроскопия

1. Маркирование
   1. Поместите решетки секциями (Рисунок 1A) стороной вниз на ~1 мл PBS в небольшую чашку или многолуночную тарелку. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе удаляется желатин, который находится между ячейками; Желатин после секционирования не нужен и мешает оставшемуся протоколу.
   2. Обработайте сетки стороной вниз на каплях ~75 мкл на парапленке (см. рис. 1B). Начните с промывки PBS + 0,15% глицина (3 x 2 мин) при RT. Затем инкубируют сетки с 0,1% бычьим сывороточным альбумином (BSA)-c + 0,5% желатином из рыбьей кожи (FSG) в PBS в течение 10 мин при RT в качестве стадии блокировки. Первичные антитела разводят в 0,1% BSA-c + 0,5% FSG в PBS и инкубируют сетки на ~10 мкл капель этого раствора в течение 1 ч при RT (рис. 1C).
   3. Промыть сетки 0,1% BSA в PBS 5x на RT. Затем разводят вторичные антитела и 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; 10 мкг/мл) в 0,1% BSA-c + 0,5% FSG в PBS и инкубируют сетки на ~10 мкл капель этого раствора в течение 30+ мин при RT (рис. 1C). Промойте решетки в PBS 5x на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опционально вторичное антитело может быть помечено 5, 10, 15 или 20 нм частицами коллоидного золота, конъюгированными с белком А (PAG) для локализации интересующего белка при ЭМ. При желании инкубируют сетки с ПАГ в течение 20 мин при РТ после шага 4.1.3. Затем промойте 5 раз PBS на RT. Избегайте одновременного использования нескольких первичных антител и обратите внимание на реактивность PAG к IgG разных видов, чтобы предотвратить нежелательные перекрестные реакции. Дополнительные сведения см. в разделе¹².
2. Монтажные образцы для световой микроскопии
   1. Погрузите решетки в 50% глицерин в dH 2 O₂x 5 мин при RT. Поместите сетки между предметным стеклом и покровным стеклом в 50% глицерин, по одной сетке на покровное стекло, так, чтобы секции были обращены к покровному стеклу (Рисунок 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Качество маркировки может ухудшиться, если решетки хранятся в 50% глицерине более 30 минут. Поэтому рекомендуется монтировать и образовывать две или три сетки одновременно, а остальные оставлять на вторичном растворе для маркировки.
3. Световая микроскопия
   1. Возьмите предметное стекло с многослойными сетками на широкопольный микроскоп с автоматизированным столиком. Выберите масляный объектив с большим увеличением (63x или 100x). Создайте мозаичный набор изображений (часть) ленты разделов (рисунок 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые вторичные антитела могут образовывать флуоресцентные агрегаты на сетках, особенно вокруг складок или разрывов в срезах. Кроме того, некоторые типы клеток и тканей содержат автофлуоресцентные структуры. Если такие проблемы ожидаются, рекомендуется включить отрицательную контрольную сетку, не инкубированную с первичными антителами.
4. Размонтирование и электромагнитный контраст
   1. Добавьте 10 мкл dH₂O на боковую сторону сэндвича из предметного стекла и покрытия и подождите, пока капиллярное действие заполнит границу раздела стекло-покровное стекло. Осторожно снимите покровное стекло, не смешивая погружное масло с глицерином. Извлеките сетки пинцетом и погрузите в dH₂O 3x при RT, чтобы смыть 50% глицерина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Масло может препятствовать окрашиванию уранила и ухудшать электромагнитный контраст.
   2. Аккуратно просушите тыльную сторону сетки безворсовой папиросной бумагой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец также был помечен частицами коллоидного золота, выполните следующие действия: поместите сетку секциями вниз на капли PBS и промойте 2 раза при RT. Постфикс в 1% GA в течение 5 мин при RT (см. предостережение под 1.1.4). Стирка в PBS 2x на RT.
   3. Поместите решетки стороной вниз на капли dH₂O и промойте 8 раз при RT.
   4. Для окрашивания срезов для контрастирования в ЭМ инкубируют с уранилацетатом (UA), pH 7, в течение 5 мин при RT (рис. 1F).
   5. Перед размещением сеток охладите UA:метилцеллюлозу, рН 4, поместив капли на парапленке на металлическую пластину на льду. Затем промойте решетки ледяной UA: метилцеллюлозой, pH 4, 2x и инкубируйте с ледяной UA: метилцеллюлозой, pH 4, в течение 10 мин (рисунок 1F).
      ВНИМАНИЕ: Уранилацетат является опасным химическим веществом (заявления об опасности H300, H330, H373, H411). На этапах, требующих UA, работайте в химическом капюшоне и надевайте средства защиты (лабораторный халат, перчатки и защитные очки). Собирать и утилизировать отходы, содержащие ЕС, в соответствии с руководящими принципами и правилами институтов.
   6. Выкрутите сетки, вставив петлю для сушки сетки в каплю UA:метилцеллюлозы под сеткой и осторожно приподняв ее, пока сетка не снимется с капли¹². Удалите излишки UA:метилцеллюлозы, прикоснувшись петлей под углом ~60° (секциями вниз) к безворсовой фильтровальной бумаге (см. Таблицу материалов) и медленно протаскивая ее по бумаге до тех пор, пока UA:метилцеллюлоза не перестанет впитываться. Затем поместите петлю с сеткой в подходящую решетку и дайте высохнуть в течение >10 минут при RT (Рисунок 1G).

5. ЭМ

1. Используйте обзор, полученный с помощью световой микроскопии, для определения области интереса (ROI) для визуализации в просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ; Рисунок 1Н). Аннотируйте ROI в наборе данных световой микроскопии. После того, как регион выбран, получите набор тайлов изображения с увеличением 20 000x-50 000x в TEM. Реконструируйте набор тайлов изображения в программном обеспечении для постобработки^15,16.

6. Корреляция и анализ

1. Загрузите набор данных световой микроскопии и ЭМ в подходящее программное обеспечение для обработки изображений, такое как ImageJ/Fiji¹⁷, плагин ec-CLEM в Icy¹⁸ или Photoshop. Обрежьте и поверните набор данных для световой микроскопии в соответствии с набором листов EM.
   1. Выполните корреляцию на основе сигнала DAPI во флуоресценции и ядерных контурах в ЭМ (рис. 1I). Смещайте изображения, чтобы точно накладывать их друг на друга, и точно выполняйте ручную корреляцию. Чтобы сделать подход более точным, примените корреляцию на основе ориентиров, например, с помощью плагина ec-CLEM в Icy или плагина BigWarp в ImageJ, чтобы коррелировать изображения путем ручного выбора соответствующих точек. Подробный, пошаговый протокол корреляции с ec-CLEM доступен¹⁹.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подход также хорошо работает с использованием бимодальных реперных зондов^20,21.
2. Проанализируйте коррелированные изображения, выбрав ROI на основе флуоресцентного сигнала в подходящей программе (например, ImageJ). Для количественного анализа создайте коллекцию ROI для всех помеченных органелл. Затем изучите соответствующую ультраструктуру отдельных ROI и классифицируйте их по морфологическим элементам.

Оптимизированный иммуно-ЭМ протокол для иммунозолотого мечения LC3 на ультратонких криосрезах был недавно опубликован De Maziere et al.9. Это исследование включало голодание без BafA1, в которых LC3 присутствовал, но относительно редко и его было трудно обнаружить с помощью ЭМ. В отдельном исследовании был представлен метод CLEM на срезе, который использует чувствительность флуоресцентного мечения для визуализации относительно редких и низкоэкспрессируемых эндогенных белков и соотнесения их с ультраструктурой ЭМ14. Здесь эти два подхода объединены с помощью оптимизированного протокола маркировки LC3 в рамках CLEM-подхода.

Клетки HEPG2, клетки печени с относительно высокими уровнями базальной аутофагии22, голодали в минимальной среде (сбалансированный раствор соли Эрла [EBSS]) в течение 2 ч до фиксации в 4% PFA. За этим последовала пробоподготовка методом ультратонкого криосекционирования Токуясу (разделы 1-3; см. Слот и Гёзе12), который хорошо совместим с CLEM 14,23 на сечении. Размороженные криосрезы флуоресцентно мечили (раздел протокола 4 и рис. 1) с использованием мышиного первичного антитела9 к LC3. Кроме того, для индикации эндолизосом использовался кроличий анти-LAMP1, за которым следовали вторичные антитела к мышам AlexaFluor488 и антикроличьи AlexaFluor568. Сетки были зажаты между покровным стеклом и предметным стеклом и визуализированы на РТ на широкопольном микроскопе (масляный объектив 100x 1,47 NA, камера sCMOS).

Преимуществом флуоресцентного мечения тонких срезов перед обычными цельноклеточными ПЧ является повышенное разрешение по Z, так как физическая толщина среза составляет 60-90 нм. Благодаря этому улучшенному Z-разрешению, флуоресцентное мечение LC3 и LAMP1 на тонких срезах показывает очень слабую колокализацию (рис. 2A). В клетках, обработанных лизосомальными ингибиторами, такими как BafA1, наблюдается высокая колокализация, поскольку лизосомально заключенный LC3 остается недеградированным9. В необработанных клетках LC3 быстро разрушается при контакте с ферментативно активными, LAMP1-положительными лизосомами, и поэтому колокализация в этих условиях встречается редко. Как правило, наблюдалось менее одного LC3 punctum на профиль клетки. Это указывает на то, что даже в условиях голодания оборот аутофагосом происходит быстро, что приводит к низкому уровню аутофагосом. Это также подчеркивает важность использования CLEM для поиска редких структур, меченных LC3, используя большое поле зрения, обеспечиваемое световой микроскопией. Кроме того, более высокая чувствительность флуоресцентного мечения по сравнению с мечением золотом позволяет идентифицировать больше LC3-положительных органелл, чем в обычном иммуно-ЭМ, что еще больше облегчает их характеристику.

После получения полного набора тайлов ленты срезов, сетки извлекали из микроскопа и постокрашивали на ЭМ с использованием UA и методом loop-out (шаги протокола 4.4-4.6; Рисунок 1F,G). Этот метод «петли» гарантирует, что тонкий слой UA:метилцеллюлозы остается на сетке, что создает желаемый контраст в ЭМ. Толщина слоя зависит от скорости и угла, с которым UA:метилцеллюлоза смывается на фильтровальную бумагу. Слишком быстрое перетаскивание цикла может привести к тому, что на сетке останется слишком много UA:метилцеллюлозы и потемнеет внешний вид секций в EM. Слишком медленное перетаскивание может оттянуть слишком много UA:метилцеллюлозы, что приведет к слишком малому окрашиванию и плохой морфологии, а также рискует выпадением сетки из петли. «Масляное пятно» (рис. 1G) на сухих сетках указывает на подходящую толщину слоя UA:метилцеллюлозы.

После выхода из контура и сушки сетки визуализировались в ПЭМ при ROI, выбранных с помощью флуоресценции. Наборы данных ПЧ и ЭМ коррелировали путем наложения сигнала DAPI на контуры ядер, видимых в ЭМ, создавая интегрированное изображение, содержащее информацию об обеих модальностях.

Найти ту же область в EM, что и выбранная в ПЧ, может быть непросто. Поэтому рекомендуется иметь под рукой обзорное изображение набора тайлов IF при поиске в EM. Пользователи должны искать узнаваемые особенности в обеих модальностях, такие как складки или разрывы в сечениях, полосы сетки или расположение ядер. Также важно иметь в виду, что образец может выглядеть повернутым и зеркально отраженным в электромагнитном диапазоне. Для упрощения корреляции можно использовать «сетки поиска» со специфическими функциями для идентификации областей (см. Таблицу материалов).

Корреляция LC3-положительных органелл с ультраструктурой ЭМ показала, что различные пункты представляют собой различные стадии аутофагии (рис. 2B). Несмотря на то, что сохранение аутофагосомальной ультраструктуры в криосекциях является сложной задачей, часто наблюдались органеллы с цитоплазматическим содержимым и двойными мембранами (рис. 2C, стрелки в органеллах 1-5; Дополнительный рисунок S1), которые являются определяющими морфологическими особенностями аутофагосом. Интересно, что довольно слабые флуоресцентные пятна были идентифицированы ЭМ как LC3-положительные аутолизосомы (рис. 2С, органелла 6; аутофагическое содержание отмечено *), характеризующиеся плотным содержимым и внутрипросветными везикулами. Это показало, что очень малые количества LC3 видны в ПЧ ультратонких криосекций, и указало на то, что, несмотря на деградационную среду, некоторое количество LC3 обнаруживается в стационарных автолизосомах. Однако большинство LC3-положительных пунктатов представляли собой аутофагосомы, в то время как аутолизосомы встречались очень редко. Это отличается от клеток, обработанных BafA1, которые в основном накапливают аутолизосомы, а не аутофагосомы.

Таким образом, этот протокол описывает метод CLEM на срезе для связывания молекулярной информации, полученной с помощью флуоресцентной микроскопии, с ультраструктурой ЭМ. Этот метод повышает чувствительность иммуно-ЭМ, так как для мечения используются только флуорофоры, которые обычно дают больше сигнала, чем ЭМ-зонды. Метод особенно подходит для использования ультратонких криосекций, в которых можно получить высокие уровни специфической флуоресценции при незначительном фоновом окрашивании. Используя флуоресценцию для скрининга редких структур или событий и сопоставляя выбранные ROI с EM, можно значительно сократить время работы EM и связанные с этим затраты. Чувствительность и осуществимость метода демонстрируется визуализацией LC3 в необработанных, истощенных клетках, показывающей, что LC3 преимущественно связывается с аутофагосомами в этих условиях, с очень низкими уровнями, видимыми в аутолизосомах.

Рисунок 1: Схематическое изображение КЛЭМ на разрезе . (А) Криосрезы из ячеек, внедренных в желатин, собираются на медной сетке, покрытой формваром. (Б) Сетки обрабатываются по частям на каплях соответствующих растворов. (C) Сетки помечены первичными и флуоресцентными вторичными антителами. (D) Сетки зажаты между покровным стеклом и предметным стеклом в 50% глицерина. (E) Флуоресцентные изображения собираются с помощью широкопольного микроскопа. (F) Сетки извлекаются из предметного стекла и далее обрабатываются окрашиванием уранилом для ЭМ. (G) После высыхания сетки могут быть отображены с помощью TEM. (H) Набор тайлов изображений ПЭМ с большим увеличением получен из области, выбранной из данных флуоресценции. (I) Изображения, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии и ЭМ, коррелируют и накладываются друг на друга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: КЛЭМ LC3 и LAMP1 в истощенных клетках HEPG2. Клетки HEPG2 голодали в течение 2 ч в EBSS перед фиксацией 4% PFA в течение 2 ч. (A) Визуализация LC3 (зеленый) и LAMP1 (красный) на срезах показывает относительно небольшое количество LC3 puncta и небольшую колокализацию с LAMP1. (B) Связывание молекулярной информации из ПЧ (левая панель) с ультраструктурной информацией, полученной в ЭМ (средняя панель), путем наложения двух модальностей визуализации, основанных на DAPI и ядерных контурах (пунктирные линии, правая панель). Ультраструктура отдельных компартментов, помеченных LC3, как показано на рисунке 1 (правая панель), показана на рисунке C. (C) Ультраструктура LC3-положительных компартментов. Слева показаны CLEM-изображения, а справа — псевдоцветные (бежевые) EM-изображения (неокрашенные EM-изображения показаны на дополнительном рисунке S1). Внутренняя и наружная аутофагосомные мембраны обозначены белыми и черными стрелками соответственно. Аутофагическое содержание внутри аутолизосомы в примере 6 обозначается *. Масштабные линейки = 10 мкм (А), 1 мкм (В), 200 нм (С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Неокрашенные ЭМ-изображения LC3-положительных органелл. (А-Ж) Неокрашенные ЭМ изображения псевдоцветных примеров 1-6 показаны на рисунке 2C. Органеллы отбирали методом флуоресценции LC3, как показано на рисунке 2. Внутренняя и наружная аутофагосомные мембраны обозначены белыми и черными стрелками соответственно. Аутофагическое содержание внутри аутолизосомы в примере 6 обозначается *. Масштабные линейки = 200 нм. Сокращения: AL = аутолизосома; AP = аутофагосома; M = митохондрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Буферы и растворы, использованные в этом исследовании. Этот дополнительный файл содержит рецепты и протоколы, необходимые для создания буферов и растворов, используемых в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.