Для понимания патологических механизмов, лежащих в основе стеноза аортального клапана (АВС), и для оценки эффективности терапевтических вмешательств необходима соответствующая модель на животных. В настоящем протоколе описана новая процедура разработки модели кролика AVS с помощью прямого повреждения баллоном in vivo.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модель стеноза аортального клапана кролика, индуцированного прямым повреждением баллоном
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Модели на животных становятся важным инструментом для понимания патологических механизмов, лежащих в основе стеноза аортального клапана (АВС), из-за отсутствия доступа к надежным источникам пораженных аортальных клапанов человека. Среди различных моделей животных модели кроликов AVS являются одними из наиболее часто используемых в исследованиях крупных животных. Тем не менее, традиционные модели AVS кроликов требуют длительного периода приема пищевых добавок и генетических манипуляций для индуцирования значительного стеноза аортального клапана, что ограничивает их использование в экспериментальных исследованиях. Для устранения этих ограничений предложена новая модель кроликов AVS, в которой стеноз индуцируется прямым баллонным повреждением аортального клапана. В настоящем протоколе описана успешная методика индуцирования АВС у новозеландских белых кроликов (NZW) с пошаговыми процедурами подготовки, хирургического вмешательства и послеоперационного ухода. Эта простая и воспроизводимая модель предлагает многообещающий подход к изучению возникновения и прогрессирования АВС и предоставляет ценный инструмент для изучения основных патологических механизмов заболевания.
Введение
Все большее признание получает тот факт, что использование соответствующих моделей на животных может способствовать лучшему пониманию патологических механизмов, лежащих в основе стеноза аортального клапана (АВС), из-за отсутствия доступа к надежным источникам пораженных аортальных клапанов человека, связанных с прогрессированием аортального стеноза (АС). Среди различных животных моделей для изучения АВС кролики являются одной из наиболее часто используемых моделей АВС крупных животных, а модель АВС кроликов индуцируется либо с помощью добавок холестерина/витамина D2, либо с помощью генетических манипуляций 1,2,3,4.
Несмотря на то, что кроличьи модели AVS предоставили значительное представление о развитии и прогрессировании AVS, по-прежнему остается сложной задачей последовательное и воспроизводимое индуцирование AVS, как видно из наших предварительных экспериментов.
В дополнение к генетически восприимчивым моделям животных, индуцированных диетой и генетически восприимчивым, была создана новая модель AVS путем прямой механической травмы у мышей 5,6. Модель механической травмы успешно индуцирует аортальный стеноз и представляет собой простую и воспроизводимую модель AVS у мышей дикого типа. Насколько нам известно, ранее не проводилось исследований, изучающих влияние механической травмы на аортальный клапан на кроличьих моделях. Таким образом, в данном исследовании представлена новая процедура индуцирования АВС у самцов новозеландских белых кроликов путем прямого баллонного повреждения аортального клапана, которая может точно имитировать состояние клапанного аортального стеноза. Этот протокол включает в себя пошаговое описание подготовки, хирургической процедуры и послеоперационного ухода, которые полезны для индуцирования воспроизводимых моделей кроликов AVS.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры исследований на животных были утверждены и проведены в соответствии с Законом о благополучии лабораторных животных, Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию, а также Руководящими принципами и политикой в отношении экспериментов на животных, предоставленными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Медицинском колледже Католического университета Кореи (номер утверждения: CUMC-2021-0176-05). В настоящем исследовании использовались 3-месячные кролики-самцы новозеландской белой (NZW) массой 3,5-4,0 кг, которые содержались в стандартных условиях в индивидуальных клетках. Кроликов кормили либо обычной пищей, либо диетой, обогащенной 0,5% холестерином, с добавлением 50 000 ЕД витамина D2 (см. таблицу материалов). Дизайн эксперимента и методы анализа индукции модели кролика AVS изображены на рисунке 1.
1. Подготовка к операции
- Убедитесь, что все медицинские и хирургические инструменты (см. Таблицу материалов) стерилизованы в начале операции.
- Подготовьте набор баллонного катетера для дилатации, выполнив следующие действия.
- Подсоедините устройство для дефляции, заполненное смесью физиологического раствора и имеющегося в продаже контрастного вещества (1:1), к части с замком Люэра баллонного катетера (см. Таблицу материалов).
- Наполните баллон раствором для надувания и удалите воздух из баллонного катетера.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании инфляционный раствор состоял из 30% йодиксанола с 0,9% физиологического раствора (см. таблицу материалов). - Проверьте правильность надувания баллона, продув просвет баллона раствором для надувания.
2. Хирургическое вмешательство при травме аортального клапана
- Вводят внутримышечно тилетамин и золазепам (15 мг/кг) и ксилазин (5 мг/кг) (см. таблицу материалов) для обезболивания животного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением анестезии кролики были предварительно обработаны подкожной инъекцией гликопирролата (0,05 мг/кг) в качестве преданестезирующего антихолинергического средства. Адекватный уровень анестезии определялся по сочетанию критериев, включая отсутствие реакции на защемление пальца ноги и стабильную частоту дыхания. - Введите внутривенный катетер 24 G в краевую ушную вену и соедините инфузионный набор с гепаринизированным физиологическим раствором (100 ЕД/кг гепарина).
- Подключите кролика к многопараметрическому ветеринарному монитору (см. Таблицу материалов) для непрерывного мониторинга жизненно важных показателей, таких как сигнал насыщения кислородом (SpO2), температура и артериальное давление.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для мониторинга SpO 2 прикрепите датчик SpO2 к языку кролика. Для контроля температуры введите зонд в прямую кишку кролика. Для контроля артериального давления наденьте манжету на переднюю конечность. - Поместите кролика в положение лежа на спине на операционном столе, оборудованном рентгеноскопией С-дуги (см. таблицу материалов), и удалите волосы из вентральной области шеи с помощью машинок для стрижки шерсти животных (рис. 2A).
- Простерилизуйте место разреза йодом, а кролика накройте хирургическими полотенцами.
- Расположите сердце кролика в центре изображения С-дуги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все исследователи должны носить защитное снаряжение с прикрепленными термолюминесцентными дозиметрами (TLD) для снижения лучевой нагрузки во время проведения операции под контролем С-дуги.- Включите С-дугу и выберите режим рентгеноскопии для визуализации сердца.
- Отрегулируйте положение кролика так, чтобы сердце находилось в центре поля визуализации.
- Сделайте продольный разрез примерно 3 см на коже шеи, и хирургическими ножницами разрежьте фасцию и жировую ткань.
- Обнажайте левую общую сонную артерию (LCCA), осторожно разделяя мышцы до тех пор, пока не обнажится примерно 3-3,5 см LCCA (Рисунок 2B).
- Наложите на LCCA шелковый шов 3-0 (см. Таблицу материалов) в верхней и нижней части открытого LCCA, чтобы остановить кровоток.
- Вставьте внутривенный катетер 22 G в LCCA и введите направляющий провод (0,016 дюйма, см. Таблицу материалов) в левый желудочек (ЛЖ) через внутривенный катетер, убедившись, что кончик катетера правильно расположен в поле визуализации С-дуги.
ПРИМЕЧАНИЕ: При введении внутривенного катетера осторожно ослабьте лигатурный шов на пути к аортальному клапану, чтобы обеспечить продвижение катетера. - Извлеките внутривенный катетер, оставив направляющий провод, и поместите оболочку 4-F (см. Таблицу материалов) поверх направляющей проволоки в LCCA, чтобы ввести баллонный катетер (Рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: После замены внутривенного катетера с оболочкой весь захваченный воздух должен быть удален из оболочки. - Осторожно введите баллонный катетер диаметром 8 мм по проводнику в аортальный клапан под рентгеноскопическим контролем С-дуги (рис. 2D).
- Поместите наконечник баллонного катетера примерно на 1-2 см дистальнее аортального клапана и надуйте баллон, продувая раствор для надувания с помощью надувного насоса под давлением 6 атм.
- Переместите баллон в вершину LV и потяните его обратно в выпускное отверстие LV. Повторите эту процедуру пять раз, а затем сдуйте баллон (рис. 2E, F).
- Повторите шаги 2.8-2.9 три раза, чтобы обеспечить адекватное повреждение клапана.
- Извлеките баллонный катетер и проводник. Медленно снимите оболочку с LCCA и сразу же завяжите LCCA швом на пути вниз к аортальному клапану.
- Очистите область разреза физиологическим раствором, чтобы удалить сгустки крови, и осмотрите место прокола на предмет артериального кровотечения.
- Закройте мышцу и кожу нерассасывающимся швом 3-0 и простерилизуйте все стороны раны йодом.
3. Послеоперационный уход
- Снимите контрольные пластыри и клипсы, и держите кролика в инкубаторе интенсивной терапии.
ПРИМЕЧАНИЕ: После операции кролики находились под пристальным наблюдением в течение 1 дня в инкубаторе интенсивной терапии, а затем были перемещены в домашнюю клетку. - Купировать послеоперационную боль с помощью 5 мг/кг трамадола и 3 мг/кг кетопрофена и вводить антибиотики (4 мг/кг гентамицина) два раза в день в течение 3 дней путем подкожной инъекции (см. таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Послеоперационное обезболивание должно проводиться в соответствии с ветеринарными рекомендациями и рекомендациями IACUC (например, опиоиды, НПВП, местный анестетик или их комбинация). - Кормите 0,5% обогащенной холестерином диетой с 50 000 ЕД витамина D2 (HC + VitD2) в течение 8 недель.
4. Эхокардиография
- Через 8 недель после травмы баллоном обезболивайте кролика, используя ту же процедуру, что описана в шаге 2.1.
- Визуализируйте аортальные клапаны с помощью двумерных трансторакальных изображений и записывайте изображения в режиме М с короткой и длинной осями.
- Поместите кролика в положение лежа на спине на эхо-столе.
- Побрейте область груди с помощью машинки для стрижки и крема для депиляции.
- Нанесите гель для ультразвукового датчика (см. Таблицу материалов) на грудную клетку.
- Отрегулируйте датчик так, чтобы получить парастернальный вид по длинной оси и парастернальный вид по короткой оси аортального клапана.
- Используйте визуализацию в М-режиме для записи изображений аортального клапана как по длинной, так и по короткой оси и сохраняйте изображения для последующего анализа.
5. Гистологический анализ
- После эхокардиографии усыпьте кролика, введя внутривенную инъекцию хлорида калия (KCl, 3 г/20 мл, 1 мл).
- Вскройте грудную полость, возьмите сердце с восходящей аортой7 и поместите его на лед в фосфатно-солевой буфер (PBS).
- Сразу же погрузите сердце в 4%-ный раствор параформальдегида (PFA) и встройте его в парафиновый блок (см. таблицу материалов).
- Разрежьте залитый парафином сердечный блок на срезы толщиной 4 мкм с помощью микротома и окрасьте срезы трихромом Массона (МТ), ализариновым красным и фон Коссой (см. таблицу материалов) для оценки отложения коллагена и кальцификации клапана, соответственно 8,9.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Модель AVS кролика, индуцированная повреждением аортального клапана
Для индукции кроличьей модели AVS в данном исследовании использовали кроликов-самцов NZW массой 3,5-4,0 кг. В соответствии с хирургическими процедурами, описанными на этапе 2 (рис. 2), модель AVS была создана по травме аортального клапана, которая привела к механической дегенерации аортального клапана и кальцификации. Контрольная группа включала кроликов, которых кормили диетой, обогащенной 0,5% холестери...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Модели AVS на животных обычно используются для изучения патологических аспектов AVS, включая начало и прогрессирование AVS. Этот протокол представляет новую модель AVS кролика, индуцированную прямым баллонным повреждением аортального клапана. В этом исследовании модель повреждения аортального клапана показала значительное утолщение створок и кальцификацию. По сравнению с моделью легкой формы АВС, индуцированной пищевыми добавками, аортальный клапан в модели прямого повреждения баллоном был избирательно поврежден, что при...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не могут заявить о конфликте интересов в этой работе.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIT) (No 2020R1A4A3079570), Министерством образования (No 2021R1I1A1A01051425) и Программой стратегического развития промышленных технологий (No 20014873), финансируемой Министерством торговли, промышленности и энергетики Республики Корея.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 3-0 Шелковый шовный материал | AILEE | SK312 | |
| 4% параформальдегид(PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Ализарин красный Раствор | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | ASAHI | Направляющая проволока | |
| Задняя крышка стола | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Баллон Устройство для сдувания | Деmax Medical | DID30s Bionet Ветеринарный | |
| монитор | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Сертифицированная диета для кроликов | Purina | 5322 | 4,7% гидрогенизированное кокосовое масло, 0,5% холестерин и 1% Molasse |
| Curadle Smart Incubator | Autoelex | CS-CV206 | Отделение интенсивной терапии (ОИТ) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | Витамин D2 |
| Фехтнер Щипцы для конъюнктивы титан | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| Щипцы | HEBU | HB203 | |
| Гентамицин | Шин Пунг | ||
| Гликопирролат | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Нормальный физиологический раствор 500 мл | |
| раствор гематоксилина | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW pharmaceutical | 25,000 U | |
| Инфузионный набор для одноразового использования | SWOON MEDICAL | ||
| Йод | зеленый фармацевтический | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Инфляционный раствор (контрастное вещество) |
| IV катетер 22 г BD | |||
| Внутривенный катетер 24 г BD | 382412 | ||
| кетопрофен | SamChunDang | ||
| шприц Luer-Lok 10 мл | шприц Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok 3 мл | Becton Dickinson OLYMPUS | ||
| SZ61 | |||
| Microtome | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT набор для удаления морилок | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Держатель для | Solco | 009-1304 | |
| Иглодержатель с замком и швом | JEUNGDO BIO & PLANT | H-1222-18 | |
| Парафин | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Хлорид калия 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Идеальная гидрофильная оболочка | MERIT MEDICAL PID4F11018SS | Чехол 4F | |
| PTA Баллонный катетер для дилатации | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Баллонный катетер 8,0 мм |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| sterile Gauze | DAE HAN Medical | 10 см x 20 см | |
| Хирургические перчатки | Ansell | Ansell | |
| Хирургический халат | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| Хирургические ножницы | Nopa, Германия | AC020/16 | |
| Хирургическая лента | 3M micopore | 1530-1 | |
| Шприц 1 мл | Shin Chang Medical | ||
| Шприц 10 мл | Shin Chang Medical | ||
| Тканевая кассета | Scilav korea | Cas3003 | |
| Датчик гель | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Ультразвуковая система Tramadol HCl | |
| Philps | Affiniti 50 | ||
| Von Kossa stain kit | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
Ссылки
- Aliev, G., Burnstock, G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: A model of atherosclerosis. Histology and Histopathology. 13 (3), 797-817 (1998).
- Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Aldington, L., Rogers, K. A. Development of aortic valve sclerosis in a rabbit model of atherosclerosis: An immunohistochemical and histological study. Journal of Heart Valve Disease. 14 (3), 365-375 (2005).
- Drolet, M. C., Couet, J., Arsenault, M. Development of aortic valve sclerosis or stenosis in rabbits: role of cholesterol and calcium. Journal of Heart Valve Disease. 17 (4), 381-387 (2008).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310(2011).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (2), 270-278 (2014).
- Niepmann, S. T., et al. Graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics human functional and morphological disease phenotype. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 847-856 (2019).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; A versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).
- Wirrig, E. E., Gomez, M. V., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. COX2 inhibition reduces aortic valve calcification in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (4), 938-947 (2015).
- Jung, S. H., et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2(hi) macrophages in infarcted hearts. Nature Communications. 13 (1), 4580(2022).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111 (24), 3316-3326 (2005).
- Lindman, B. R., et al. Calcific aortic stenosis. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16006(2016).
- Cuniberti, L. A., et al. Development of mild aortic valve stenosis in a rabbit model of hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2303-2309 (2006).
- Marechaux, S., et al. Identification of tissue factor in experimental aortic valve sclerosis. Cardiovascular Pathology. 18 (2), 67-76 (2009).
- Hara, T., et al. Progression of calcific aortic valve sclerosis in WHHLMI rabbits. Atherosclerosis. 273, 8-14 (2018).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
