Методическая статья

Эффективная васкуляризация органоидов почек путем интраселомной трансплантации куриным эмбрионам

DOI:

10.3791/65090

⸱

17 февраля 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine - Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory of Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 3IBPS, CNRS UMR7622, Developmental Biology Laboratory, Sorbonne Université, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем подробный протокол трансплантации органоидов почек в поломическую полость куриных эмбрионов. Этот метод индуцирует васкуляризацию и ускоренное созревание органоидов в течение 8 дней и может быть использован для эффективного изучения этих процессов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоиды почек, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, содержат нефроноподобные структуры, которые в определенной степени напоминают таковые во взрослой почке. К сожалению, их клиническая применимость затруднена отсутствием функциональной сосудистой сети и, следовательно, ограниченным созреванием in vitro. Трансплантация органоидов почек в хеломическую полость куриных эмбрионов индуцирует васкуляризацию перфузированными кровеносными сосудами, в том числе образование клубочковых капилляров, и усиливает их созревание. Этот метод очень эффективен, позволяя проводить трансплантацию и анализ большого количества органоидов. В этой статье описывается подробный протокол интрацеломической трансплантации органоидов почек у куриных эмбрионов с последующей инъекцией флуоресцентно меченного лектина для окрашивания перфузированной сосудистой сети и сбора трансплантированных органоидов для анализа изображений. Этот метод может быть использован для индукции и изучения васкуляризации и созревания органоидов, чтобы найти ключи к усилению этих процессов in vitro и улучшить моделирование заболеваний.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Было показано, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (hiPSC), полученные из органоидов почек, обладают потенциалом для исследований развития 1,2,3,4, скрининга токсичности 5,6 и моделирования заболеваний5,7,8,9,10,11,12,13. Однако их применимость для этих и возможных клинических целей трансплантации ограничена отсутствием сосудистой сети. Во время эмбрионального развития почек подоциты, мезангиальные клетки и эндотелиальные клетки сосудов (ЭК) взаимодействуют, образуя сложную структуру клубочка. Без этого взаимодействия клубочковый фильтрационный барьер, состоящий из подоцитов, клубочковой базальной мембраны (GBM) и ECs, не может нормально развиваться14,15,16. Хотя органоиды почек in vitro содержат некоторые ЭК, они не образуют надлежащую сосудистую сеть и со временемуменьшаются 17. Поэтому неудивительно, что органоиды остаются незрелыми. Трансплантация мышам индуцирует васкуляризацию и созревание органоидов почек 18,19,20,21. К сожалению, это трудоемкий процесс, который не подходит для анализа большого количества органоидов.

Куриные эмбрионы используются для изучения васкуляризации и развития уже болеевека 22. Они легко доступны, требуют минимального ухода, не имеют полностью функциональной иммунной системы и могут нормально развиваться после вскрытия яичной скорлупы23,24,25,26. Было показано, что трансплантация органоидов на их хориоаллантоисную мембрану (CAM) приводит к васкуляризации27. Однако продолжительность трансплантации на CAM, а также уровень созревания трансплантата ограничены образованием CAM, которое завершается до 7-го эмбрионального дня. Поэтому недавно был разработан метод эффективной васкуляризации и созревания органоидов почек посредством интрасиломической трансплантации куриным эмбрионам28. С 1930-х годов известно, что целомическая полость куриных эмбрионов является благоприятной средой для дифференцировки эмбриональных тканей29,30. Он может быть доступен на ранних стадиях эмбрионального развития и позволяет относительно неограниченно расширять трансплантат во всех направлениях.

В этой статье изложен протокол трансплантации органоидов почек, полученных из hiPSC, в поломическую полость куриных эмбрионов 4-го дня. Этот метод индуцирует васкуляризацию и усиленное созревание органоидов в течение 8 дней. Инъекция флуоресцентно меченного хрусталика culinaris agglutinin (LCA) перед принесением эмбрионов в жертву позволяет визуализировать перфузированные кровеносные сосуды в органоидах с помощью конфокальной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В соответствии с законодательством Нидерландов, для этого исследования не требовалось одобрения комитета по защите животных.

1. Подготовка органоидов почек, полученных из hiPSC, к трансплантации

  1. Дифференцируйте ИПСК до органоидов почек с использованием протокола, разработанного Takasato et al.4,18,31. Культивируйте органоиды в соответствии с этим протоколом на вставках для культивирования полиэфирных клеток с порами 0,4 мкм (вставки для клеточных культур) до 7 + 12 дня дифференцировки. Каждая вставка клеточной культуры будет содержать три органоида.
  2. Удалите органоиды из вкладыша для клеточной культуры.
    1. Сделайте отверстие посередине мембраны клеточной культуры, вставьте парой рассекающих щипцов. С помощью рассекающих ножниц сделайте три надреза в мембране от отверстия посередине до края вставки клеточной культуры, разрезав между органоидами. Это приведет к трем частям мембраны, к каждой из которых прикреплен один органоид, которые все еще соединены со вставкой клеточной культуры на внешнем крае.
    2. Возьмитесь за один из кусочков мембраны близко к ее внешнему краю с помощью щипцов и оторвите его от вкладыша для клеточной культуры. Поместите кусочек мембраны с прикрепленным органоидом в чашку Петри. Добавьте несколько капель фосфатно-буферного физиологического раствора Дульбекко (DPBS) без кальция и магния (DPBS-/-) в органоид, чтобы избежать обезвоживания. Повторите то же самое для двух других органоидов.
  3. Разделите органоиды пополам, удерживая их мембрану на месте щипцами и разрезая их пополам лезвием бритвы из нержавеющей стали с двумя лезвиями (весь органоид слишком велик для целома, чтобы вместить его на этой стадии развития). Аккуратно отожмите две половинки органоида от мембраны с помощью диссектора твердой мозговой оболочки. Откажитесь от мембраны и оставьте органоиды в DPBS-/- до пересадки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте максимум три органоида одновременно для трансплантации, чтобы избежать стресса для органоидов перед трансплантацией. В идеале, один человек подготавливает органоиды, а другой выполняет трансплантацию.

2. Подготовка куриных эмбрионов к трансплантации

  1. Инкубируют оплодотворенные яйца белого леггорна. Начинайте инкубацию яиц на почечной органоидной дифференцировке 7+8 дня, чтобы обеспечить правильные сроки трансплантации.
    1. Поместите оплодотворенные яйца белого леггорна (Gallus domesticus) горизонтально на держатель (рис. 1A; День 0), отмечая карандашом середину обращенной вверх стороны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве держателей для инкубации яиц можно использовать как изготовленные на заказ пластиковые держатели, так и картонные коробки для яиц.
    2. Поместите держатель с яйцами в увлажненный инкубатор при температуре 38 ± 1 ºC (рис. 1A; День 0).
    3. Инкубируйте яйца в течение 3 дней, поддерживая таз с водой в инкубаторе заполненным.
  2. Создайте окно в яичной скорлупе на 3-й день инкубации.
    1. На 3-й день инкубации поместите небольшой кусочек (~1 см х 0,5 см) прозрачной ленты на заостренный кончик яйца (маленький конец). Сделайте небольшое отверстие в яичной скорлупе посередине прозрачной ленты, постукивая по ней острым концом рассекающих ножниц.
    2. Вставьте иглу 19 г на шприце объемом 5 мл в отверстие под углом 45 °, избегая повреждения желточного мешка, и аспирируйте 2-3 мл белка из яйца, чтобы опустить эмбрион внутрь яйца. Запечатайте отверстие вторым куском (~1 см x 0,5 см) прозрачной ленты.
    3. Положите большой кусок (~ 5 см x 5 см) прозрачной ленты на отмеченную карандашом сторону яйца, обращенную вверх. Сделайте отверстие в яичной скорлупе посередине прозрачной ленты, постукивая по ней острым концом рассекающих ножниц (рис. 1А; День 3).
    4. Начиная с этого отверстия, вырежьте небольшое круглое окошко в яичной скорлупе с помощью изогнутых рассекающих ножниц. Посмотрите в это окно, чтобы найти эмбрион, затем увеличьте окно, чтобы оптимизировать доступ к эмбриону (рис. 1A; День 3).
    5. Удалите все большие куски яичной скорлупы, которые могли упасть на эмбрион, с помощью щипцов. Удалите более мелкие кусочки, поместив несколько капель DPBS с кальцием и магнием (DPBS +/+) на эмбрион с помощью пластиковой пипетки для переноса, а затем аспирировав DPBS + / + с яичной скорлупой в пипетку.
    6. Добавьте в яйцо три капли DPBS+/+ с добавлением 0,5% пенициллина/стрептомицина с помощью пластиковой пипетки для переноса.
    7. Тщательно закройте окно большим куском (~ 5 см x 5 см) прозрачной ленты, прежде чем помещать яйцо обратно в инкубатор до 4-го дня инкубации, когда эмбрион находится на стадии Гамбургера-Гамильтона 23-24 (HH 23-24)32.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Герметизация окна очень важна, чтобы избежать обезвоживания и гибели эмбриона.
    8. Ежедневно проверяйте эмбрионы на жизнеспособность, глядя на них через ленту (не снимайте ленту, чтобы избежать обезвоживания). В течение первых дней инкубации цвет яичного желтка меняется с яркого на матово-желтый после гибели эмбриона. Откажитесь от умерших эмбрионов.
    9. Держите таз с водой в инкубаторе заполненным.

3. Интрасиломическая трансплантация на 4-й день инкубации

  1. Получение доступа к поломической полости
    1. Отрежьте ленту от окна изогнутыми рассекающими ножницами.
    2. Поместите яйцо под препарирующий микроскоп на резиновый держатель или картонную коробку для яиц.
    3. Куриный эмбрион теперь находится в HH 23-24 и лежит на левом боку, а правый бок обращен к зрителю (рис. 1А; День 4). Найдите правую почку крыла и ноги эмбриона, так как между этими двумя почками конечностей будет доступ к целому. В области между правым крылом и почкой ноги последовательно создайте отверстие в вителлиновой мембране, хорионе и амнионе, удерживая их двумя парами рассекающих щипцов и осторожно потянув их в противоположных направлениях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вителлиновая мембрана является первой мембраной, которая встречается после вскрытия яйца, а в некоторых случаях уже повреждена после того, как она сделала окно на 3-й день. Если эмбрион повернут, лежа на правом боку левым боком лицом к зрителю (рис. 1А; День 4), необходимо перевернуть его, чтобы сделать возможной пересадку. Для этого делают большое отверстие в вителлине и оболочке хориона, после чего аккуратно переворачивают эмбрион с помощью щипцов.
    4. Проверьте, нет ли беспрепятственного доступа к селомической полости: аккуратно возьмитесь за край стенки тела между крылом и почкой конечности парой рассекающих щипцов и слегка потяните его к зрителю. Целомическая полость должна быть хорошо видна. Осторожно вставьте тупой, но тонкий инструмент (например, тупую вольфрамовую проволоку в держателе микроскальпеля) в полость живота.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если введение тупого инструмента в полость живота невозможно, это означает, что одна или несколько мембран не были должным образом открыты.
  2. Пересадка
    1. Поместите половину органоида внутрь яйца поверх аллантоиса с помощью диссектора твердой мозговой оболочки.
    2. С помощью рассекающих щипцов осторожно возьмитесь за край стенки тела и слегка потяните его к зрителю, чтобы было видно отверстие в цоколь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повреждения кровеносных сосудов в стенке тела.
    3. Осторожно переместите органоид к отверстию в стенке тела и через него в целом желобе с помощью тупой вольфрамовой проволоки в держателе микроскальпеля. Слегка подтолкните органоид к черепу, чтобы поместить его внутрь целома. Теперь он виден сразу за почкой крыла (рис. 1А; День 4).
    4. Добавьте три капли DPBS+/+ в яйцо с помощью пластиковой пипетки для переноса.
    5. Аккуратно заклейте окно большим куском (~5 см х 5 см) прозрачной ленты, прежде чем поместить яйцо обратно в инкубатор до 12-го дня инкубации (8 дней после пересадки).
    6. Продолжайте ежедневно проверять эмбрионы на жизнеспособность, глядя на них через ленту (не снимайте ленту, чтобы избежать обезвоживания). Откажитесь от умерших эмбрионов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По мере роста эмбрионов и их хориоаллантоисных оболочек они становятся более отчетливо видимыми через ленту. Отсутствие движения эмбриона и разрушенные или редкие кровеносные сосуды являются признаком гибели эмбриона.
    7. Ежедневно проверяйте резервуар с водой в инкубаторе и держите его заполненным.

4. Инъекция флуоресцентно меченного лектина

  1. Подготовка к инъекции
    1. Сделайте стеклянные иглы для микроинъекций, вытягивая стеклянные микрокапилляры в съемнике микропипеток со следующими настройками: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Глядя в рассекающий микроскоп, осторожно отломите кончики игл для микроинъекций с помощью рассекающих щипцов, чтобы создать отверстие.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимые настройки съемника микропипеток могут отличаться в зависимости от устройства.
    2. Соберите систему впрыска. Возьмите два куска силиконовой трубки диаметром 38 см и соедините их друг с другом, поместив между ними фильтр 0,2 мкм. Вставьте мундштук в конец трубки, который соединен с выпускным отверстием фильтра (силиконовая трубка 1), и разъем на конец трубки, который соединен с входным отверстием фильтра (силиконовая трубка 2). Наконец, вставьте иглу для микроинъекций в разъем (рис. 1B).
    3. Разбавьте флуоресцентно меченый агглютинин хрусталика culinaris (LCA) с DPBS-/- до концентрации 2,5 мг мл-1 в пробирке 0,5 мл и вращайте вниз в течение ~ 30 с в микроцентрифуге, чтобы переместить агрегаты на дно пробирки.
    4. Пипетка 20 мкл LCA на кусок парапленки.
    5. Аспирируйте 20 мкл LCA из парапленки в микрокапиллярную иглу собранной инъекционной системы.
  2. Инъекция
    1. Отрежьте ленту от окна изогнутыми рассекающими ножницами. Поместите яйцо под препарирующий микроскоп в резиновый держатель.
    2. Оцените сосудистую сеть и найдите вены, которые можно отличить от артерий по их немного более яркому красному цвету (рис. 1А; День 12). Чтобы улучшить доступ к сосудистой сети, аккуратно увеличьте окно, разрезав изогнутыми рассекающими ножницами. Выбирайте вену для инъекции исходя из доступности и размера.
    3. Вставьте кончик микрокапиллярной иглы в выбранную вену под углом 0°-20º. Убедитесь, что игла находится в вене, осторожно перемещая кончик из стороны в сторону. Осторожно и неуклонно подуйте в систему впрыска, чтобы впрыснуть LCA (рис. 1A; День 12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла в вене находится в правильном положении, она должна оставаться в границах вены.
    4. Поместите яйцо обратно в инкубатор на 10 минут, чтобы дать LCA циркулировать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени не нужно заклеивать яйцо скотчем.

5. Сбор пересаженных органоидов на 12-й день инкубации

  1. Принесение в жертву куриного эмбриона
    1. Поместите яйцо в резиновый держатель на скамейке. Отрежьте ленту от окна изогнутыми рассекающими ножницами. Затем прорежьте мембраны, окружающие эмбрион, изогнутыми препарирующими ножницами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага не требуется препарирующий микроскоп.
    2. Зачерпните эмбрион из яйца перфорированной ложкой и сразу же обезглавьте эмбрион с помощью ножниц. Поместите тело эмбриона в чашку Петри под диссекционным микроскопом.
  2. Поиск и сбор органоидов
    1. Поместите эмбрион на спину в чашку Петри и раздвиньте конечности.
    2. Аккуратно вскрывают брюшную стенку эмбриона по продольной оси с помощью щипцов.
    3. Найдите органоид внутри зародыша. Органоид чаще всего прикрепляется к правой доле печени либо на каудальном кончике, либо краниально чуть ниже грудной клетки (рис. 1А; День 12). Поэтому рекомендуется начать с поиска в этих местах.
    4. Как только органоид будет найден, удалите его из эмбриона, разрезав его микроножницами. Поместите органоид и куриную ткань, которая неизбежно прикрепляется к нему, в чашку Петри под препарирующим микроскопом. Удалите как можно больше куриной ткани лезвием бритвы из нержавеющей стали с двумя лезвиями.
    5. Обрабатывают органоид в зависимости от желаемого анализа.

6. Цельное иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. Поместите пересаженный органоид в 24-луночную пластину и зафиксируйте в 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) при 4 ° C в течение 24 часов. Стирайте 3 раза с DPBS-/-.
  2. Пермеабилизируют и блокируют органоид в 300 мкл блокирующего раствора (0,3% Triton-X в DPBS-/- , содержащем 10% ослиной сыворотки) в течение 2 ч при комнатной температуре.
  3. Приготовьте смесь первичных антител: для одного органоида разбавьте первичные антитела NPHS1 (овца α человек, разведение 1:100), CD31 (мышь α человек, разведение 1:100) и LTL (биотин-конъюгированный, разведение 1:300) в 300 мкл блокирующего раствора. Добавьте смесь антител к органоиду и инкубируйте в течение 72 ч при 4 °C.
  4. Стирайте 3 раза с 0,3% TritonX в DPBS-/-.
  5. Приготовьте смесь вторичных антител: для одного органоида разбавьте вторичные антитела осела α овец Alexa Fluor 647 (разведение 1:500), ослиного α мыши Alexa Fluor 488 (разведение 1:500) и стрептавидина Alexa Fluor 405 (разведение 1:200) в 300 мкл блокирующего раствора. Добавьте смесь вторичных антител к органоиду и инкубируйте в течение 2-4 ч при комнатной температуре. Накройте алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия вторичных антител на свет.
  6. Стирайте 3 раза с DPBS-/-.
  7. Поместите органоид в ~ 30 мкл монтажной среды в чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм и дайте высохнуть в течение ночи при комнатной температуре, накрыв алюминиевой фольгой. Хранить при температуре 4 °C.
  8. Изображение с помощью конфокального микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод и сроки дифференциации hiPSC в органоиды почек, инкубации оплодотворенных куриных яиц, трансплантации органоидов почек, инъекции LCA и сбора органоидов обобщены на рисунке 1A. Важно согласовывать сроки дифференцировки органоидов и инкубации куриных яиц, начиная дифференциацию за 15 дней до инкубации. Действия на 0, 3, 4 и 12 день инкубации проиллюстрированы фотографиями под временной шкалой. Органоиды пересаживают на 7 + 12 день дифференцировки в куриные эмбрионы 4-го дня (HH 23-24). L...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи демонстрируется протокол интрасиломической трансплантации органоидов почек, полученных из hiPSC, у куриных эмбрионов. При трансплантации органоиды васкуляризируются перфузированными кровеносными сосудами, которые состоят из комбинации ЭК, полученных из органоидов человека и курицы. Они распространяются по всему органоиду и проникают в клубочковые структуры, обеспечивая взаимодействие между ЭК и подоцитами. Ранее было показано, что это приводит к усиленному созреванию органоидных клубочковых и трубчатых ст...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Джорджа Галариса (LUMC, Лейден, Нидерланды) за помощь с инъекцией куриных эмбрионов. Мы выражаем благодарность за поддержку Саскии ван дер Валь-Маас (Департамент анатомии и эмбриологии, LUMC, Лейден, Нидерланды), Конни ван Мюнстерен (Департамент анатомии и эмбриологии, LUMC, Лейден, Нидерланды), Манон Зуурмонд (LUMC, Лейден, Нидерланды) и Аннемари де Грааф (LUMC, Лейден, Нидерланды). М. Конинг поддерживается 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. Эта работа была частично поддержана Фондом Лейденского университета «Фонд профессора Яапа де Граффа-Линглинга Виядханрмы» GWF2019-02. Эта работа поддерживается партнерами Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) и Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health. К.В. ван ден Берг и Т.Д. Рабелинк поддерживаются Центром медицины стволовых клеток Фонда Ново Нордиск (reNEW), Центр медицины стволовых клеток Фонда Ново Нордиск поддерживается грантами Фонда Ново Нордиск (NNF21CC0073729).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 & микро; m фильтр: Whatman Puradisc 30 шприц фильтр 0,2 & микро; mВатман10462200
35 мм посуда со стеклянным дном MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
Аспираторные трубки в сборе для калиброванных микрокапиллярных пипетокSigma-AldrichA5177-5EAСодержит силиконовые трубки, мундштук и соединитель
Конфокальный микроскоп: Leica White Light Laser Confocal Microscope LeicaTCS SP8
Щипцы для рассечения, простого типа. Титановый, изогнутый, с тонкими острыми кончикамиHammacher KarlHAMMHTC091-10
Щипцы рассекающие, простого типа. Титан, прямой, с тонкими острыми кончикамиHammacher KarlHAMMHTC090-11
Диссекционный микроскоп Wild Heerbrugg355110
Ножницы для препарирования, изогнутые, OP-специальные, особо острые/острыеHammacher KarlHAMMHSB391-10
Сыворотка ослаSigma-AldrichD9663
Осел-альфа-мышь Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-212-02разведение 1:500
Осел-&альфа;-овца Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA-21448Разбавление 1:500
Лезвия для бритвы из нержавеющей сталиElectronic Microsopy Sciences72000
DPBS, кальций, магний (DPBS-/-)ThermoFisher Scientific14040133
DPBS, без кальция, без магния (DPBS+/+)ThermoFisher Scientific14190094
картонные коробки для яиц или держатели для яиц на заказ NA
Яйца белых леггорнов оплодотворенные (Gallus Gallus domesticus) Дрост Лосдрехт Б.В.NA
ИнкубаторElbanton BVET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) BiotinylatedVector LaboratoriesB-1325разведение 1:300
Микроножницы, прямые, острые/острые, длина реза 10 ммHammacher KarlHAMMHSB500-09
Микрокапилляры: Тонкостенные стеклянные капилляры 1,5 мм, филаментWorld Precision InstrumentsTW150F-3
Съемник микропипетокSutter Instrument CompanyМодель P-97Мы используем следующие настройки: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Держатель микроскальпеля: Castroviejo лезвие и держатель штифтов, 12 см, круглая ручка, конические губки 10 мм.EuronexiaL-120
Монтажный материал: Prolong Gold Antifade Mountant ThermoFisher ScientificP36930
Olivecrona dura dissector 18 см Реда41146-18
Парафильм Heathrow ScientificHS234526B
Пенициллин-стрептомицин 5 000 ЕД/млThermoFisher Scientific15070063
перфорированная ложка EuronexiaS-20-P Чашка
Петри 60 x 15 мм CELLSTAR628160
Пластиковые переводные пипетки ThermoFisher ScientificPP89SB
Очищенное мышиное антитело к человеку CD31BD Biosciences555444разведение 1:100
Родамин меченый Lens Culinaris Agglutinin (LCA)Vector LaboratoriesRL-1042Этот продукт недавно был снят с производства. Vectorlabs по-прежнему производит меченый LCA Dylight 649 (DL-1048-1) и меченый флуоресцеином LCA (FL-1041-5).
D systemsAF4269разведение 1:100
Стерильные иглы для подкожных инъекций, 19 гBD микроланс301500
Стрептавидин Alexa Fluor 405ThermoFisher ScientificS32351разведение 1:200
Шприц 5 млBD Изумруд307731
Прозрачная лента Tesa4124Доступен в большинстве хозяйственных магазинов
Triton XSigma-AldrichT9284
Вольфрамовая проволока, диаметр 0,25 мм;ThermoFisher Scientific010404.H2

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  2. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  3. Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
  4. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  5. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167(2018).
  6. Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943(2022).
  7. Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
  8. Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
  9. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715(2015).
  10. Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
  11. Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772(2022).
  12. Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866(2022).
  13. Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
  14. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  15. Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
  16. Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
  17. Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
  18. vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
  19. Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
  20. Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
  21. vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
  22. Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
  23. Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
  24. Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
  25. Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
  26. Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
  27. Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
  28. Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40(2022).
  29. Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
  30. Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
  31. Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
  32. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  33. Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
  34. ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , Available from: https://www.cpp.edu/research/research-compliance/iacuc/docs/iacuc-guidelines-on-euthanasia-of-chicken-and-embryos.pdf (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи