Методическая статья

Клеточная электроимпедансная платформа для оценки ингибиторов вируса Зика в режиме реального времени

DOI:

10.3791/65149

⸱

24 марта 2023 г.

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Rega Institute for Medical Research, Laboratory of Virology and Chemotherapy, KU Leuven

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы демонстрируем использование клеточного электрического импеданса (CEI) в качестве очень простого и понятного метода изучения вирусной инфекции и репликации вируса Зика в клетках человека в режиме реального времени. Кроме того, анализ CEI полезен для оценки противовирусных соединений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Технология электрического импеданса на основе ячеек (CEI) измеряет изменения импеданса, вызванные растущим или манипулируемым монослоем адгезивной ячейки на лунках культуральной пластины, встроенных в электроды. Технология может быть использована для мониторинга последствий заражения вирусом Зика (ZIKV) и репликации адгезивных клеток в режиме реального времени, поскольку этот вирус обладает высокой цитопатогенностью. Это простой анализ, который не требует использования меток или инвазивных методов и имеет преимущество в предоставлении данных в режиме реального времени. Кинетика инфекции ZIKV сильно зависит от используемой клеточной линии, штамма вируса и множественности инфекции (MOI), которые не могут быть легко изучены с помощью обычных конечных анализов. Кроме того, анализ CEI также может быть использован для оценки и характеристики противовирусных соединений, которые также могут обладать динамическими ингибирующими свойствами в ходе инфекции. В этой статье о методах дается подробное объяснение практического выполнения анализа CEI и его потенциального применения в исследованиях ZIKV и противовирусных исследованиях в целом.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вспышки вируса Зика (ZIKV) связаны с серьезными осложнениями заболевания, такими как микроцефалия и синдром Гийена-Барре 1,2,3. Хотя будущие эпидемии вероятны из-за различных факторов риска, таких как распространение комаров-переносчиков и растущая урбанизация, на сегодняшний день ни одна вакцина или противовирусный препарат еще не вышли на рынок 3,4. Поэтому традиционные методы исследования ZIKV должны быть дополнены новыми инструментами для изучения этого вируса и его потенциальных противовирусных соединений. Противовирусные исследования часто основаны на фенотипических анализах, где конечной точкой является наличие определенного параметра, такого как появление вирус-индуцированного цитопатического эффекта (CPE) или продуцирование определенного вирус-индуцированного белка с помощью репортерного гена 5,6,7. Однако эти методы имеют считывание конечных точек, являются трудоемкими и могут потребовать сложного анализа. Таким образом, методы, основанные на импедансе, предлагают привлекательную альтернативу.

Электрический импеданс на основе ячеек (CEI) определяется как сопротивление току, протекающему от одного электрода к другому, вызванное адгезивным слоем ячейки, засеянным в колодцы, содержащие электроды. Установленная технология CEI, используемая в этой методологии, представляет собой датчик импеданса электрического элемента и подложки (ECIS), первоначально разработанный Giaever и Keese 8,9. Это используется в широкой области биологических исследований, таких как метастазирование рака, токсикология и заживление ран10,11,12. Его принцип основан на электрическом поле, которое генерируется непрерывным распределением напряжений переменного тока (AC) в диапазоне частот13. Клетки подвергаются воздействию этих неинвазивных электрических полей, и через заданные промежутки времени измеряются изменения импеданса, вызванные ростом клеток или изменениями клеточной адгезии или морфологии14. Кроме того, изменение жизнеспособности клеток также приводит к изменениям импеданса, что делает технологию полезным инструментом для мониторинга инфекции цитопатогенными вирусами15,16,17. Поскольку морфологические изменения клеточного слоя будут обнаружены в наноразмерном диапазоне, технология предлагает высокочувствительный инструмент обнаружения. Анализ CEI, описанный в этой статье, представляет собой простой, неинвазивный, не требующий меток метод в режиме реального времени для измерения изменений импеданса клеточного слоя с течением времени.

Хотя CEI не использовался для оценки течения инфекции ZIKV или ее потенциальных противовирусных препаратов, его использование в качестве диагностического инструмента было исследовано до18 года. В недавнем исследовании впервые было подтверждено использование анализа CEI для определения противовирусной активности нескольких ингибиторов ZIKV в клетках A54919. В этой статье о методах более подробно описывается этот анализ CEI и распространяется на различные адгезивные клеточные линии, а также на различные штаммы ZIKV при различных кратностях инфекции (MOI). Таким образом, показано многостороннее использование этого метода в противовирусных исследованиях флавивирусов. Метод имеет решающее преимущество мониторинга клеток в режиме реального времени, что позволяет обнаруживать важные моменты времени инфекции и динамическую ингибирующую активность потенциальных противовирусных соединений. Взятые вместе, технология CEI предлагает мощный и ценный инструмент, дополняющий текущий спектр противовирусных методологий.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все описанные этапы проводятся в стерильных условиях в ламинарном шкафу лаборатории 2 уровня биобезопасности. Все использованные вирусы были получены и использованы в соответствии с правилами бельгийского институционального наблюдательного совета (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, протокол SBB 219 2011/0011) и Комитета по биобезопасности Лёвенского католического университета.

1. Уход за клеточными культурами

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол выполняется с выбором клеточных линий, но, конечно, может быть адаптирован к любой адгезивной клеточной линии, требуя только оптимизации плотности посева клеток.

  1. Выращивайте клеточную линию аденокарциномы легкого человека A549, клеточную линию злокачественной глиобластомы человека U87 и эмбриональные клетки фибробластов легких человека HEL 299 в колбах для культивирования T75 при 37 ° C и 5% CO2 в увлажненном инкубаторе.
  2. Субкультурируйте клетки при слиянии 80% -95%. Все реагенты должны быть при комнатной температуре (RT) перед культивированием клеток.
  3. Удалите кондиционированную питательную среду из клеток. Используйте 5 мл фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS), чтобы один раз промыть монослой клетки.
  4. Равномерно распределите 1 мл 0,25% трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) по монослою клетки. Затем инкубируйте до 3 минут при 37 ° C, пока клетки не начнут отделяться.
  5. Добавьте 9 мл свежей полноценной питательной среды (подробнее см. Таблицу материалов ). Пипетка осторожно вверх и вниз, чтобы ресуспендировать клетки.
  6. Перенесите желаемый объем клеточной суспензии в новую колбу для культивирования Т75 и добавьте соответствующий объем свежей питательной среды, чтобы получить общий объем 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные линии in vitro , используемые в этом протоколе, субкультивируются в разведении от 1:4 до 1:10, в зависимости от конкретной клеточной линии, чтобы обеспечить идеальные условия роста. Субкультуры проводятся каждые 3-4 дня, поэтому желаемый объем клеточной суспензии также может варьироваться в зависимости от количества инкубационных дней.

2. Подготовка плиты CEI

  1. Возьмите 96-луночную пластину с межпальцевыми электродами (см. Таблицу материалов) и заполните все лунки 100 мкл питательной среды.
  2. Заполните промежутки между лунками с помощью DPBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это сделано для уменьшения краевого эффекта из-за испарения, которое наблюдается при культивировании клеток в 96-луночных планшетах.
  3. Инкубировать планшет в течение 4 ч при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2.

3. Посев клеток

  1. Отделяют клетки от колбы для культивирования, как описано в разделе 1, и ресуспендируют их в свежей питательной среде в пробирке объемом 50 мл.
  2. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток, используя метод выбора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае ячеек А549 жизнеспособность обычно достигает ~ 100%. Для определения количества клеток мы используем автоматизированную систему анализа клеток, основанную на окрашивании акридином оранжевым/йодидом пропидия (см. Таблицу материалов). Другие методы подсчета клеток работают одинаково хорошо.
  3. Ресуспендируют клетки в свежей питательной среде, чтобы получить желаемую плотность клеток. В этом исследовании оптимальная плотность клеток A549 составляет 0,15 ×10 6 (жизнеспособных) клеток/мл.
  4. Достаньте из инкубатора 96-луночную пластину с межпальцевыми электродами и удалите среду с помощью многоканальной пипетки.
  5. Дозируйте 100 мкл клеточной суспензии (в данном случае это соответствует 15 × 10ячейкам 3 ) на лунку в 96-луночной пластине.
  6. Дайте клеткам уравновеситься в течение 15 минут при комнатной температуре, прежде чем помещать их в устройство CEI.

4. Настройка и проведение анализа CEI

  1. Поместите инкубатор, в котором находится держатель пластины устройства CEI, при температуре 37 °C и 5% CO2.
  2. Поместите 96-луночную пластину в устройство.
  3. Откройте программное обеспечение устройства и настройте новый эксперимент, нажав кнопку " Настройка " на панели "Сбор данных". Подождите, пока ноутбук подключится к устройству ECIS, и настройте пластину, проверив импедансы лунок. Проверьте, все ли лунки настроены правильно, на что указывает зеленый цвет. Если нет, повторяйте шаг 4.2, пока все лунки не станут зелеными.
  4. На панели Well Configuration (Конфигурация скважины) выберите тип массива в соответствии с используемым языком культуры.
  5. Выберите режим «Множественная частота/время».
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом режиме устройство измеряет изменения импеданса в диапазоне частот.
  6. Начните измерение, нажав кнопку Пуск.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Импеданс в режиме реального времени можно контролировать на интерфейсе программного обеспечения. Выберите желаемую частоту , которая будет отображаться. В этом примере выбрано значение 16 кГц.

5. Приготовление и инкубация компаунда

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера противовирусного соединения используется лабиринтопептин А1 (см. Таблицу материалов). Поскольку этот протокол можно обобщить на все соединения с потенциальной противовирусной активностью, мы называем его «соединением».

  1. Дайте полной среде для культивирования клеток без добавления эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (называемой «буфером для анализа») уравновеситься при ЛТ.
  2. Держите составы на льду.
  3. Приготовьте 10-кратное концентрированное разведение каждого соединения в анализирующей среде в полипропиленовых пробирках объемом 5 мл.
  4. Последовательно разбавляют соединения в анализной среде в полипропиленовых пробирках объемом 5 мл для получения желаемых 10-кратных концентраций.
  5. Приостановите устройство CEI, нажав кнопку Пауза на панели Настройка сбора данных. Дождитесь завершения текущего момента времени и выньте 96-луночную пластину.
  6. Проверяют адгезию и монослойное образование клеток под световым микроскопом.
  7. Удалите по 20 мкл из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки.
  8. Добавьте 20 мкл составного раствора или носителя в желаемые лунки. Подготовьте макет с конкретными условиями для правильного пипетирования.
  9. Инкубируйте пластину в течение 15 минут при 37 °C с 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа инкубации используется обычный клеточный инкубатор вместо устройства CEI. Контрольные скважины (CC) представляют собой скважины, обработанные транспортными средствами.

6. Подготовка и заражение вирусом

  1. Разморозьте флакон с запасом вируса. В данном примере используются ZIKV MR766 и ZIKV PRVABC59.
  2. Приготовьте вирусные разведения в желаемом MOI или разведения в анализирующей среде в полипропиленовой пробирке объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом репрезентативном примере используются MOI 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.005 и 0.00005.
  3. Добавьте 100 мкл разведения вируса в назначенные лунки 96-луночной пластины. Добавьте пробирную среду в лунки CC.
  4. Обеззаразьте использованные контейнеры с вирусами.
  5. Вставьте пластину обратно в устройство CEI и продолжайте измерения в течение 6 дней подряд, нажав «Возобновить эксперимент».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лунки для борьбы с вирусами (VC) представляют собой инфицированные клетки, обработанные транспортным средством, тогда как в лунках CC вместо разбавления вируса добавляется анализная среда. Если цитотоксичность соединений оценивается, добавьте 100 мкл буфера для анализа вместо разведения вируса.

7. Анализ данных

  1. Завершите эксперимент, нажав кнопку Готово и добавив необязательные сводные комментарии, например сведения о конкретных условиях эксперимента в появившемся окне. Нажмите кнопку ОК, когда сбор данных будет завершен.
  2. Выберите нужную частоту на панели «График », где измеряется наибольшая разница импедансов между CC и VC в конце эксперимента.
    1. Чтобы определить наилучшую частоту, проведите пилотный эксперимент с неинфицированными и инфицированными клетками и выберите частоту, которая в тот момент времени, когда импеданс инфицированных клеток упал до исходного уровня, приводит к наибольшей наблюдаемой разнице импедансов между неинфицированными и инфицированными клетками. В случае клеток A549, инфицированных ZIKV, это 16 кГц.
  3. Чтобы экспортировать все данные в формате электронной таблицы, убедитесь, что на панели «Конфигурация скважины» выбраны все скважины, и нажмите « Файл» | Экспорт данных | Данные графика.
  4. Нормализуйте данные, вычтя среднее значение импеданса VC, измеренное в конце эксперимента, из всех точек данных и разделив его на среднее значение импеданса CC последнего момента времени, измеренного перед заражением.
  5. Постройте нормализованные данные в функции времени, чтобы получить графики профиля CEI.
  6. Рассчитайте нормализованную площадь под кривой (AUCn) каждого состояния, чтобы определить такие параметры, как 50% ингибирующие концентрации (IC50).
  7. Рассчитайте другие полезные параметры, такие как CIT50, чтобы, например, сравнить заразность различных штаммов вируса.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье подробно описано использование анализа CEI в исследованиях ZIKV. Рабочий процесс этого анализа проиллюстрирован на рисунке 1. Мы демонстрируем удобство мониторинга инфекции ZIKV в режиме реального времени в желаемом типе клеток, а также оценки ингибирования инфекции противовирусным соединением. В качестве противовирусного примера мы используем хорошо описанный пептидный лабиринтопептин А1 (Лаби А1); Мы называем это «соединением», поскольку его специфические свойства выходят за рамки данной статьи о методах и обсуждаются в другом месте20,21. Следует отметить, что воспроизводимость метода не обсуждается в разделе результатов, поскольку мы хотим сосредоточиться на отдельных профилях импеданса, полученных с использованием методологии. Тем не менее, это было описано ранее19.

В первой серии экспериментов мы продемонстрировали важность оптимизации плотности клеток при проведении анализов на инфекцию CEI (рис. 2). Когда засеяно слишком много клеток, монослой клетки полностью вырастет и не сможет дальше распространяться по электродам CEI. Это приводит к меньшей разнице между CC и VC и, следовательно, к более низкому разрешению, уменьшая окно обнаружения противовирусной активности. Это хорошо проиллюстрировано на рисунке 2E. Для некоторых более крупных типов клеток, таких как клетки U87, слишком плотный посев клеток может даже привести к полному отслоению монослоя клетки при манипулировании пластиной, как показано здесь (рис. 2F). Это также наблюдается микроскопически.

На рисунке 2 также показано, что анализ очень полезен для проведения исследований чувствительности клеток. Из рисунка 2A,B ясно, что кинетика инфекции сильно зависит от типа клеток. Рисунок 2C показывает, что клетки U87 восприимчивы к инфекции ZIKV только при высоких MOI.

Во второй серии экспериментов подчеркивается универсальное использование анализа инфекции CEI с использованием различных штаммов ZIKV при разных MOI и в присутствии хорошо описанного противовирусного соединения (рис. 3). Эти эксперименты проводятся с клетками A549, моделью, обычно используемой в исследованиях флавивирусов22,23. Эта клеточная линия также использовалась в других исследованиях, которые продемонстрировали ее пригодность в анализах CEI24. Во-первых, кинетика инфекции репрезентативного штамма ZIKV африканской линии MR766 сравнивается с кинетикой инфекции азиатской линии PRVABC59. На рисунке 3A показано, что оба штамма имеют сопоставимые паттерны CEI, при этом PRVABC59 обладает несколько более медленными свойствами, индуцирующими CPE. Это также отражено в значениях CIT50 (рис. 3B). Этот интересный параметр был впервые введен Fang et al.16 и учитывает кинетику измерений CEI. Он определяется как время, необходимое для снижения импеданса на 50% по сравнению с управлением ячейкой.

Затем клетки инфицировали тремя различными MOI ZIKV MR766 или PRVABC59 в присутствии или отсутствии различных концентраций соединений, и профили импеданса контролировались. Как видно из рисунка 3C-H, определенные концентрации соединений ингибируют или задерживают падение импеданса, вызванное инфекцией ZIKV. Это также отражается при расчете значений AUC. Результаты анализа CEI также наглядно демонстрируют, что противовирусная активность зависит от MOI и от момента оценки потенции. Расчеты AUCn могут быть использованы для определения значений IC50, как показано на рисунке 3I. Наконец, на рисунке 3H показано, что значения CIT50 также можно использовать для определения и сравнения потенций соединений. Неактивные соединения или концентрации соединений характеризуются профилями CEI, значениями AUC и CIT50, сопоставимыми со значениями VC.

figure-results-1
Рисунок 1: Схематический обзор рабочего процесса анализа. Здесь показана временная шкала и различные этапы обработки и инкубации анализа CEI. Сокращения: CEI = электрический импеданс на основе ячеек; ZIKV = вирус Зика; D = дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Нормализованные профили CEI ZIKV-инфицированных клеток при разной плотности. (A, D) A549, (B, E) HEL 299 или (C, F) U87 клетки были засеяны в (A-C) 15 000-20 000 («оптимально») или (D-F) 75 000 («субоптимальных») клеток на лунку в 96-луночном планшете CEI. После 24 часов импедансного мониторинга клетки были инфицированы десятикратными разведениями MOI ZIKV MR766. Импеданс дополнительно контролировался в течение 5 дней подряд. Показаны профили CEI (среднее значение ± диапазоне двух технических повторений) репрезентативного эксперимента. Сокращения: CEI = электрический импеданс на основе ячеек; MOI = множественность заражения; ZIKV = вирус Зика; Норма = нормированная. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Нормализованные профили CEI клеток A549 после инфицирования двумя штаммами ZIKV и ингибирования противовирусным соединением. (A) Адгезивные клетки A549 были инфицированы различными MOI либо ZIKV MR766, либо ZIKV PRVABC59, и импеданс контролировался непрерывно. Показано среднее ± SD трех технических повторений репрезентативного эксперимента. (B) Значения CIT50 были рассчитаны на основе профиля CEI A и сопоставлены. Показано среднее ± SD трех выполненных технических реплик. (С-Н) Адгезивные клетки A549 обрабатывали различными концентрациями соединений и впоследствии инфицировали специфическим MOI либо ZIKV MR766 (C-E), либо ZIKV PRVABC59 (F-H). Импеданс постоянно контролировался. Показано среднее ± диапазоне двух технических повторений репрезентативного эксперимента. (I) Для сравнения ингибирования соединений с различными штаммами и разведениями ZIKV рассчитывали AUC n, а процент ингибирования определяли путем вычитания всех условий на CC AUC n и деления на VC AUCn. (J) Значения CIT50 эксперимента, показанные в C-H, были рассчитаны для сравнения различных штаммов ZIKV и MOI. Показано среднее ± диапазоне двух технических реплик. Сокращения: CEI = электрический импеданс на основе ячеек; MOI = множественность заражения; ZIKV = вирус Зика; Норма = нормированная; CIT 50 = время, в течение которого импеданс уменьшился на50% по сравнению с необработанным контролем; AUC = площадь под кривой; CC = управление ячейками; VC = вирусный контроль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается использование анализа CEI в противовирусных исследованиях ZIKV. Преимущество анализа заключается в мониторинге в режиме реального времени и, следовательно, может использоваться для оценки кинетики инфекции ZIKV и ингибирования противовирусных препаратов селективными соединениями. Данные, полученные с помощью этого метода, позволяют объективно и визуально наблюдать за вирус-индуцированным CPE и эффективностью потенциального противовирусного соединения.

Поскольку CEI является очень чувствительным методом, при проведении этого клеточного анализа необходимо соблюдать большую осторожность. Крайне важно, чтобы проводилось точное пипетирование, чтобы максимально избежать вариаций пипетирования. Кроме того, другие факторы, которые могут повлиять на результаты эксперимента, такие как количество клеток и используемый вирусный запас, должны оставаться постоянными между повторениями эксперимента. Это факторы, которые сильно влияют на кинетику роста и инфекции клеток и, следовательно, могут привести к изменению расчетных значений CIT50 и/или других параметров.

При выполнении анализа CEI в присутствии (потенциальных) противовирусных соединений важно определить, влияют ли они на импеданс клеток в отсутствие вируса. Этот метод настолько чувствителен, что изменения импеданса могут быть измерены значительно ниже цитотоксических концентрацийсоединения 19.

Хотя в этой статье показаны только данные ZIKV, анализ может быть легко применен к другим цитопатогенным (flavi) вирусам с минимальными усилиями по оптимизации, такими как определение оптимальной частоты мониторинга CEI. Адаптация анализа CEI была использована с различными вирусами человека и животных, такими как чикунгунья, грипп А, а также вирусы герпеса человека и лошадей25,26,27,28. Здесь он также используется в качестве простого метода для количественного определения титров вируса или для идентификации противовирусных соединений. В этих исследованиях использовался анализ клеток в реальном времени, альтернативный метод CEI.

Использование технологии CEI ограничено типами адгезивных ячеек, поскольку принцип анализа основан на свойствах адгезивных ячеек распространяться по лункам, встроенным в электроды. Поверхностные покрытия лунок, такие как фибронектин, могут быть использованы для улучшения прикрепления клеток29. У методики есть и другие недостатки, первый из которых связан с ее стоимостью. Помимо инвестиций в устройство мониторинга CEI и сопутствующее оборудование и программное обеспечение, расходные материалы также несколько дороги. Кроме того, поскольку протокол требует мониторинга вирусной инфекции в течение нескольких дней, можно оценить одну 96-луночную пластину в неделю. Вместе с высокой стоимостью это ограничивает использование настройками низкой и средней пропускной способности.

Из-за этих проблем с пропускной способностью технология не подходит для настроек антивирусного скрининга. Тем не менее, он очень привлекателен на начальных экспериментальных этапах, например, при оценке восприимчивости клеток для изучения инфекции ZIKV в определенных условиях, связанных с заболеванием. Технология также полезна с трансфицированными или нокаутированными клеточными линиями, чтобы легко наблюдать изменения в кинетике инфекции, например, при наличии или отсутствии определенных рецепторов входа. Это интересно при исследовании участия клеточных факторов в инфекции ZIKV. Кроме того, на более поздних доклинических этапах, когда был выбран определенный ведущий кандидат, анализ CEI может быть использован для дальнейшей углубленной характеристики выбранного соединения. Биосенсоры CEI также могут быть модифицированы путем иммобилизации определенных элементов биораспознавания, таких как вирус-специфические антитела, для обнаружения вирусов18. В целом это подчеркивает универсальное использование CEI в условиях вирусологии.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы подтверждают, что конфликт интересов отсутствует.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Клемана Хеймана и Горрита Луцма за корректуру рукописи. Исследование было поддержано внутренними грантами Лаборатории вирусологии и химиотерапии (Rega Institute, KU Leuven).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клетки A549American Type Culture Collection (ATCC)CCL-185Эти клетки культивируются в MEM Rega-3 с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 0,075% бикарбоната натрия.
Acridine Orange/Propidium Iodide StainLogos BiosystemsF23001Живые/мертвые красители
Cellstar полипропиленовые пробирки, 15 млGreiner bio-one1,88,271
Cellstar полипропиленовые пробирки, 50 млGreiner bio-one2,27,261
Модифицированная эфирная среда Dulbecco (DMEM)Gibco, Thermo Fisher Scientific41965-039Среда для клеточных культур U87 и клетки HEL 299
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-094
ECIS Культуральная посуда 96W20idfПрикладная биофизика96W20idf ПЭТПробирная пластина для устройства CEI
Электрическое измерение импеданса клетки-субстрата (ECIS) Станция Z-матрицыПрикладная биофизикаУстройство CEI, включая 96 скважинную станцию, внешний модуль управления и ноутбук с программным обеспечением для управления, сбора данных и отображения. Необходимое программное обеспечение устанавливается перед отправкой. ПРИМЕЧАНИЕ: данное устройство в настоящее время снято с производства и заменено на более совершенное устройство ECIS Z-Theta
Falcon полистирольные трубки, 5 млCorning352054
Фетальная бычья сыворотка (FBS)CytivaSV30160.03Клеточная культуральная среда для всех используемых клеток
HEL 299 клетокATCCCCL-137Эти клетки культивируются в DMEM с добавлением 10% FBS и 0,01 М HEPES.
Буфер HEPES, 1 MGibco, Thermo Fisher Scientific15630-056Добавка к клеточной культуре для клеток U87
Лабиринтоптин А1Подарок от профессора д-ра Родериха Sü ssmuth, Технический университетä В Он растворяется в ДМСО.
L-глютамин, 200 мМGibco, Thermo Fisher Scientific25030-024Добавка к клеточной культуре для клеток A549
Предметные стекла для подсчета клеток LunaLogos BiosystemsL12001
Luna-FL двойной счетчик флуоресцентных клетокLogos BiosystemsL20001Счетчик жизнеспособности клеток
Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3)Gibco, Thermo Fisher Scientific19993013Клеточная питательная среда для клеток А549
Бикарбонат натрия, 7,5%Gibco, Thermo Fisher Scientific25080-060Клеточная питательная среда добавка для клеток А549
Колба для культуры тканей T75TPPY9076
Трипсин-ЭДТА, 0,25%Gibco, Thermo Fisher Scientific25200-056Диссоциационный реагент
U87 клеткиATCCHTB-14Эти клетки культивируют в DMEM с добавлением 10% FBS и 0,01 M HEPES.
  Virkon Rely+On таблеткиLanxess115-0020Дезинфицирующий раствор
вируса Зика (ZIKV) MR766ATCCVR-84ZIKV прототип штамма, выделенный от сторожевой макаки резус в Уганде в 1968
ZIKV PRVABC59ATCCVR-1843штамм ZIKV, выделенный у пациента в Пуэрто-Рико в 2015
качестве примера в данном протоколе используется противовирусное соединение. году году

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  2. Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
  3. Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
  4. Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
  5. Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725(2018).
  6. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  7. Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
  8. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
  9. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  10. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792(2011).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  12. Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309(2018).
  13. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  14. Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
  15. Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039(2017).
  16. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  17. McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
  18. Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922(2022).
  19. Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122(2022).
  20. Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471(2020).
  21. Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
  22. Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
  23. Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503(2020).
  24. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137(2012).
  25. Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
  26. Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133(2021).
  27. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  28. Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
  29. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126(2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

IC50

Похожие статьи