В этом исследовании описывается оптимизированный протокол создания первичных фибробластов из келоидных тканей, которые могут эффективно и стабильно обеспечивать чистые и жизнеспособные фибробласты.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение, культивирование и характеристика первичных дермальных фибробластов из келоидной ткани человека
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фибробласты, основной тип клеток в келоидной ткани, играют важную роль в образовании и развитии келоидов. Выделение и культивирование первичных фибробластов, полученных из келоидной ткани, являются основой для дальнейших исследований биологической функции и молекулярных механизмов келоидов, а также новых терапевтических стратегий их лечения. Традиционный метод получения первичных фибробластов имеет ограничения, такие как плохое клеточное состояние, смешивание с другими типами клеток и восприимчивость к контаминации. В этой статье описывается оптимизированный и легко воспроизводимый протокол, который может уменьшить возникновение возможных проблем при получении фибробластов. В этом протоколе фибробласты можно наблюдать через 5 дней после выделения и достигать почти 80% слияния после 10 дней культивирования. Затем фибробласты пассируют и верифицируют с помощью антител к PDGFRα и виментину для иммунофлуоресцентного анализа и антител к CD90 для проточной цитометрии. В заключение, фибробласты из келоидной ткани могут быть легко получены с помощью этого протокола, что может обеспечить обильный и стабильный источник клеток в лаборатории для исследования келоидов.
Введение
Келоид, фибропролиферативное заболевание, проявляется в виде непрерывного роста бляшек, которые часто вторгаются в окружающую нормальную кожу без самоограничения и вызывают зуд, боль, а также косметические и психологические нагрузки для пациентов1. Фибробласты, первичные клетки, участвующие в келоидах, играют важную роль в формировании и развитии этого заболевания из-за чрезмерной пролиферации, избыточной продукции внеклеточного матрикса и дезорганизованных коллагенов 2,3. Тем не менее, основной патогенез остается неясным, и эффективный метод лечения келоида до сих пор отсутствует; Поэт....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Это исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом Дерматологической больницы Южного медицинского университета (2020081). Информированное согласие пациента было получено до того, как у пациентов были взяты ткани.
1. Подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры должны выполняться в стерильной среде под шкафом биологической безопасности.
- Готовят полную питательную среду, добавляя 10% фетальную бычью сыворотку (FBS) и 1% раствор пенициллина-стрептомицина-амфотерицина B (ПСА) в модифицированную среду Eagle (DMEM) с высоким содержанием глюкозы Dulbecco.
- Приготовь....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Временная шкала протокола представлена на рисунке 1A. Некоторые репрезентативные изображения процесса изоляции показаны на рисунке 2; эпидермис и жировые слои осторожно удаляли, а слой дермы разделяли на мелкие фрагменты по 3-4мм2, которые засевали в чашки Петри.
Как показано на рисунке 3А, через 5 суток после обработки под микроскопом наблюдалось несколько фибробластов кусочков ткани. Как .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Получение первичных фибробластов из келоидных тканей является важнейшей основой для дальнейших исследований. До сих пор существовало два метода получения первичных фибробластов: ферментное расщепление и эксплант-культура11,12,13,14. Однако оба традиционных метода имеют ограничения, такие как восприимчивость к контаминации, смешивание с другими типами клеток, длительный период культивирования и .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликт интересов, о котором можно было бы заявлять, отсутствует.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке грантов Национального фонда естественных наук Китая (гранты No 81903189 и 82073418) и Научно-технического фонда Гуанчжоу (грант No 202102020025).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,5 мл стерильная центрифужная пробирка | JETBIOFIL | CFT002015 | |
| 15 мл стерильная центрифужная пробирка | JETBIOFIL | 8076 | |
| 4% полиформальдегид | Beyotime Biotechnology | P0099 | Фиксация клеток |
| 50 мл стерильная центрифужная пробирка | JETBIOFIL | 8081 | Положить келоидную ткань |
| Alexa Fluor-555 козья антикроличья IgG | Абкам | Алекса Фтор 555 | Второе антитело для иммунофлуоресцентного окрашивания |
| Античеловеческий CD90 | BioLegend | B301002 | Определение чистоты фибробластов |
| Антитела разбавитель | Beyotime Biotechnology | P0262 | |
| Шкаф биологической безопасности | Thermo Scientific | 1300 series A2 | Выделение и культивирование клеток |
| Бычий сывороточный альбумин | аладдин | B265993 | Блокирование для иммунофлуоресцентного окрашивания |
| Инкубатор углекислого газа | ESCO | CCL-170B-8 | Использование для культивирования клеток |
| Клеточные криопробирки | Corning | 43513 | Хранение клеток в низкотемпературной |
| центробежной машине | Thermo Fisher | ST 16R | Выброс надосадочной жидкости |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | Окрашивание клеточного ядра |
| DMSO | MP Biomedicals | 196055 | Использование для сохранения клеток |
| модифицированная орлиная среда Dulbecco | Gibco | C11995500BT | Питательная среда |
| раствор Фетальная бычья сыворотка | BI | 04-001-1A | |
| Проточный цитометр | BD | BD FACSКелеста | Наблюдение идентичность клеток |
| замороженного бокса | Thermo Scientific | 5100-0050 | |
| Инвертированный микроскоп | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Лазерный конфокальный микроскоп | Nikon | AIR-HD25 | Наблюдение за иммунофлуоресцентным окрашиванием |
| PDGFR-α антитело | CST | 3174T | Первое антитело для иммунофлуоресцентного окрашивания |
| Пенициллин-стрептомицин-Ам раствор Solarbio | P1410 | Добавляйте в питательную среду раствор для предотвращения загрязнения | |
| чашки Петри | JETBIOFIL | 7556 | Культуральные фибробласты |
| Фосфатный буферный солевой раствор | Gibco | C10010500BT | Раствор питательной среды |
| Кролик (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE) | Технология клеточной сигнализации | 5742S | В качестве контроля для проточной цитометрии |
| Круглый покровный стекло | Biosharp | 801007 | Клеточная культура |
| Triton X 100 | Solarbio | T8200 | Пробивка отверстий в клеточной мембране |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Используется для пропускания клеток |
| антитело к виментину | Abcam | ab8978 | Первое антитело для иммунофлуоресцентного окрашивания |
Ссылки
- Zhu, Y. Q., et al. Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes. Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).
- Feng, F., et al. Biomechanical regulatory factors and th....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
