Методическая статья

Выделение и идентификация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани крыс породы Sprague Dawley

DOI:

10.3791/65172

⸱

7 апреля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI, Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations, Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается методология выделения и идентификации мезенхимальных стволовых клеток (МСК), полученных из жировой ткани, от крыс Sprague Dawley.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взрослые мезенхимальные клетки произвели революцию в молекулярной и клеточной биологии в последние десятилетия. Они могут дифференцироваться в различные специализированные типы клеток, в дополнение к их большой способности к самообновлению, миграции и пролиферации. Жировая ткань является одним из наименее инвазивных и наиболее доступных источников мезенхимальных клеток. Также сообщалось, что он имеет более высокие урожаи по сравнению с другими источниками, а также превосходные иммуномодулирующие свойства. В последнее время были опубликованы различные процедуры получения взрослых мезенхимальных клеток из разных источников тканей и видов животных. Оценив критерии некоторых авторов, мы стандартизировали методологию, которая применима к разным целям и легко воспроизводима. Пул стромально-васкулярной фракции (СВФ) из околопочечной и придатковой жировой ткани позволил разработать первичные культуры с оптимальной морфологией и функциональностью. Наблюдалось, что клетки прилипали к пластиковой поверхности в течение 24 часов и проявляли фибробластоподобную морфологию с удлинениями и тенденцией к образованию колоний. Методы проточной цитометрии (ФК) и иммунофлуоресценции (ИФ) использовались для оценки экспрессии мембранных маркеров CD105, CD9, CD63, CD31 и CD34. Способность стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ИСС), дифференцироваться в адипогенную линию также оценивалась с использованием коктейля факторов (инсулин 4 мкМ, 3-метил-изо-бутилксантин 0,5 мМ и дексаметазон 1 мкМ). Через 48 ч наблюдалась постепенная потеря морфологии фибробластоидов, а через 12 дней было подтверждено наличие липидных капель, положительных для окрашивания масла в красный цвет. Таким образом, предложена процедура получения оптимальных и функциональных культур ASC для применения в регенеративной медицине.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) оказали сильное влияние на регенеративную медицину из-за их высокой способности к самообновлению, пролиферации, миграции и дифференцировке в различные клеточные линии 1,2. В настоящее время большое количество исследований сосредоточено на их потенциале для лечения и диагностики различных заболеваний.

Существуют различные источники мезенхимальных клеток: костный мозг, скелетные мышцы, амниотическая жидкость, волосяные фолликулы, плацента и жировая ткань. Их получают от разных видов, включая людей, мышей, крыс, собак и лошадей3. МСК, полученные из костного мозга (BMSC), уже много лет используются в качестве основного источника стволовых клеток в регенеративной медицине и в качестве альтернативы использованию эмбриональных стволовых клеток4. Тем не менее, МСК, полученные из жировой ткани, или стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ASC), являются важной альтернативой с большими преимуществами из-за простоты их сбора и выделения, а также выхода клеток, полученных на грамм жировой ткани 5,6. Сообщалось, что урожайность ИСС, как правило, выше, чем у БМСК7. Первоначально было высказано предположение, что репаративная/регенеративная способность ИСС обусловлена их способностью дифференцироваться в другие клеточные линии8. Однако исследования последних лет подтвердили первостепенную роль паракринных факторов, выделяемых ИСС, в их репаративном потенциале 9,10.

Жировая ткань (АТ), помимо того, что является энергетическим резервом, взаимодействует с эндокринной, нервной и сердечно-сосудистой системами. Он также участвует в постнатальном росте и развитии, поддержании гомеостаза тканей, восстановлении и регенерации тканей. АТ состоит из адипоцитов, клеток гладких мышц сосудов, эндотелиальных клеток, фибробластов, моноцитов, макрофагов, лимфоцитов, преадипоцитов и ИСС. Последние играют важную роль в регенеративной медицине из-за их низкой иммуногенности11,12. ASC могут быть получены путем ферментативного расщепления и механической обработки или эксплантатами жировой ткани. Первичные культуры ИСС легко поддерживать, выращивать и расширять. Фенотипическая характеристика ИСС имеет важное значение для проверки идентичности клеток путем оценки экспрессии специфических мембранных маркеров с использованием таких методов, как иммунофлуоресценция и проточная цитометрия13. Международная федерация жировой терапии и науки (IFATS) и Международное общество клеточной терапии (ISCT) определили, что ASC экспрессируют CD73, CD90 и CD105, в то время как в них отсутствует экспрессия CD11b, CD14, CD19, CD45 и HLA-DR14. Таким образом, эти маркеры, как положительные, так и отрицательные, считаются надежными для характеристики ИСС.

Этот проект был сосредоточен на описании процедуры выделения и идентификации взрослых мезенхимальных клеток, извлеченных из АТ крыс, поскольку этот источник клеток не представляет этических проблем, в отличие от эмбриональных стволовых клеток. Это делает процедуру жизнеспособным вариантом из-за простоты доступа и минимально инвазивного метода по сравнению со стволовыми клетками, полученными из костного мозга.

Мезенхимальные клетки из этого тканевого источника играют важную роль в регенеративной медицине из-за их иммуномодулирующих способностей и низкого иммунного отторжения. Таким образом, настоящее исследование является фундаментальной частью будущих исследований их секретома и их применения в качестве регенеративной терапии при различных заболеваниях, включая метаболические заболевания, такие как диабет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с мексиканскими рекомендациями по уходу за животными, основанными на рекомендациях Международной ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico). Протокол был рассмотрен, одобрен и зарегистрирован Комитетом по этике исследований в области здравоохранения Мексиканского социального института (R-2021-785-092).

1. Удаление жировой ткани у крыс путем хирургической резекции

  1. Подготовьте две конические пробирки с 20 мл стерильного 1x фосфатного буферного физиологического раствора антибиотика (PBS-AA) (1x PBS, гентамицин [20 мкг / мл] и амфотерицин [0,5 мкг / мл]) и держите на льду.
  2. Выберите двух взрослых самцов крыс породы Sprague Dawley (R. norvegicus) в хорошем состоянии здоровья. Убедитесь, что крысы находятся в возрасте от 3 до 4 месяцев и имеют общий вес 350-450 г.
  3. Приступайте к седации 20 мг / кг гидрохлорида ксилазина, а через 5 минут введите анестетик в дозе 120 мг / кг гидрохлорида кетамина внутрибрюшинно. Смажьте оба глаза офтальмологической мазью, чтобы предотвратить высыхание. Затем подтвердите глубину анестезии с помощью отсутствия педального рефлекса.
  4. Побрейте и продезинфицируйте брюшную и паховую область раствором йода. Применяйте хирургические простыни для поддержания стерильности. Затем сделайте срединный продольный разрез от грудины до области яичек.
  5. Удалите жировую ткань, окружающую придаток яичка и почки, стерильными щипцами и поместите в 1x раствор PBS-AA. Храните образцы на льду.
  6. Зашивайте разрез, если это требуется в соответствии с руководящими принципами учреждения, и усыпляйте животных внутрисердечной дозой 40 мг / кг пентобарбитала натрия. Как только смерть будет подтверждена, утилизируйте тушу в соответствии с институциональной процедурой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смерть вызывает сигнальные механизмы, которые влияют на иммунофенотип, способность к дифференцировке и паракринный эффект мезенхимальных клеток. Следовательно, сбор тканей проводится перед эвтаназией. 

2. Выделение мезенхимальных клеток из жировой ткани

  1. Удалите жировую ткань стерильными щипцами в шкафу биобезопасности и поместите ее на стерильную фильтровальную бумагу в чашку Петри диаметром 100 мм, чтобы поглотить излишки PBS.
  2. Перенесите жировую ткань в другую чашку Петри и выполните три промывки в течение 5 минут каждое 10 мл 1x раствора PBS-AA с помощью пипетки объемом 10 мл.
  3. Механически разложите ткань на фрагменты примерно по 1 см2 с помощью ножниц и скальпеля.
  4. Приготовьте коллагеназу IV типа (0,075%) в 20 мл модифицированной среды Дульбекко (DMEM) без добавок. Фильтруйте через шприцевой фильтр 0,22 мкм и храните при температуре 37 °C.
  5. Добавьте раствор коллагеназы (20 мл), приготовленный на этапе 2.4, в кристаллический стакан с фрагментированной тканью и магнитным стержнем. Закройте контейнер и инкубируйте при медленном и непрерывном перемешивании при температуре 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментативное переваривание занимает около 90 минут (поддерживайте медленное перемешивание, чтобы сохранить целостность клеточных мембран).
  6. Отфильтруйте гомогенат через фильтр из нержавеющей стали 40 меш с апертурой 0,38 мм на чашке Петри диаметром 100 мм и соберите клеточную суспензию в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл.
  7. Добавьте 20 мл подогретого ДМЭМ (10% фетальная бычья сыворотка [FBS], 2 мМ глютамина, 2 мМ пирувата натрия, 100-кратный раствор заменимых аминокислот и 100-кратный антимикотический раствор антибиотика [АА]). Осторожно суспендировать стромально-васкулярную фракцию (СВЕ).
  8. Центрифугируйте клеточную суспензию при 290 x g в течение 10 мин, выбросьте надосадочную жидкость пипеткой объемом 25 мл и осторожно промойте клетки 40 мл среды DMEM без добавок.
  9. Повторите этот шаг. Используйте новую стерильную коническую трубку между шагами, чтобы протащить наименьшее количество клеточного детрита и жира.
  10. Суспендировать гранулы в 5 мл дополненного ДМЭМ с помощью пипетки объемом 5 мл и переложить во флакон Т-25 см2 . Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO2.
  11. На следующий день выполните три промывания 5 мл подогретого 1x PBS-AA и два промывания без добавок DMEM для удаления клеточного мусора и неадгезивных клеток. Добавьте 5 мл свежего, подогретого, дополненного ДМЭМ пипеткой объемом 5 мл и меняйте среду каждые 3-4 дня.

3. Сохранение и расширение первичных культур ИСС

  1. Как только клетки достигнут слияния 90%-100% (8 ± 2 дня), дважды промойте 5 мл ДМЭМ без добавок. Добавьте 1 мл подогретого 0,025% трипсина-2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и инкубируйте в течение 5-7 минут при 37 ° C.
  2. Когда клеточный монослой отслоится, добавьте 4 мл дополненного DMEM и аккуратно дезагрегируйте клеточную суспензию.
  3. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл, добавьте 5 мл нагретого дополненного DMEM и осторожно суспендируйте для гомогенизации.
  4. Центрифуга при 290 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и аккуратно смешайте гранулы с 1 мл добавленного ДМЭМ. Подсчитайте клетки в камере Нойбауэра после окрашивания трипановым синим.
  5. Наконец, высевают 2,5 x 103 ячейки / см2 с соотношением сторон 1: 4 в колбах Т-75. Этот этап обеспечивает образование колоний и высокую скорость пролиферации.

4. Морфологическая характеристика первичных культур ИСС

  1. Наблюдайте морфологию ИСС при инвертированной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед установкой для гистологии и идентификации ASC обработайте покровные стекла 1% раствором желатина. Облучать ультрафиолетом в течение 15 мин.
    1. Извлеките покровные стекла из 70% раствора этанола и дайте им высохнуть в течение 5 минут.
    2. Погрузите покровные стекла в стерильный 1% раствор желатина, слейте воду и высушите при комнатной температуре (RT).
    3. Поместите каждое покровное стекло в каждую лунку 6-луночной пластины и облучайте пластины ультрафиолетовым светом в течение 15 минут.
    4. Засейте каплю, содержащую 25 x 103 клеток, в центр лунки, подождите 1 минуту и добавьте 1 мл добавленной среды DMEM. Инкубировать в течение 96 ч при 37 °C и 5% CO2.
    5. Удалите среду и выполните три стирки 1x PBS-AA с помощью пипетки для переноса.
    6. Добавьте 1 мл 3,5% нейтрального формалина в каждую лунку и инкубируйте в течение 1 ч при RT. Осторожно удалите формалин и добавьте 1 мл холодного 70% этанола в каждую лунку.
    7. Запечатайте пластину парапленкой до использования, чтобы предотвратить высыхание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная морфология ИСС также оценивается путем окрашивания гематоксилин-эозином во время различных пассажей.
    8. Удалите 70% этанола из каждой лунки и гидратируйте клетки в течение 5 минут дистиллированной водой. Тем временем отфильтруйте окрашивающие растворы.
    9. Удалите воду и окрашивайте клетки при медленном перемешивании в течение 15 минут раствором гематоксилина Харриса.
    10. Удалите пятновыводящий раствор и выполните две стирки с 1x PBS.
    11. Окрашивают клетки раствором эозина при медленном перемешивании в течение 1 мин. Затем удалите раствор и выполните две стирки с 1x PBS.
    12. Осторожно снимите покровные стекла с каждой лунки и установите направляющие на каплю монтажного раствора PBS-глицерина (1:1 v/v).
    13. Нанесите линию лака для ногтей вокруг покровного стекла и понаблюдайте за гистологическими предметными стеклами под световым микроскопом.

5. Маркеры экспрессии ИСС методом иммунофлюоресценции

  1. Подготовьте буфер для стирки, содержащий 1x PBS-0,05% Tween 20. Выполняйте стирку при RT и медленном встряхивании. Вымойте пластины три раза с 2 мл буфера/лунки (выдерживайте в течение 3 минут при каждой стирке).
  2. Поместите 1 мл блокирующего реагента (1:10) и инкубируйте при медленном перемешивании в течение 20 минут.
  3. Добавьте 200 мкл (разведение 1:50) следующих первичных антител в каждую лунку: CD9 (моноклональная мышь), CD34 (поликлональный кролик) и анти-CD63 (поликлональная коза). Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
  4. Вымойте пластины еще раз три раза и инкубируйте с 200 мкл (разведение 1:50) следующих вторичных антител: конъюгированный козий IgG FITC против мыши, IgG DyeLight 550 против осла и IgG Cy3 против коз против кролика.
  5. Промойте три раза 1x PBS-0,05% Tween 20 и покрасьте ядра клеток 100 мкл DRAQ-7 (разведение: 17 мкл в 1 мл двойной дистиллированной воды) в течение 20 мин.
  6. Вымойте еще три раза и установите горки в соответствии с шагами 4.1.12-4.1.13. Храните образцы в защищенном от света и замороженном месте до использования.
  7. Визуализируйте образцы при эпифлуоресцентной конфокальной микроскопии, используя соответствующие настройки и программное обеспечение, рекомендованное для этого оборудования.

6. Маркеры экспрессии ИСС методом проточной цитометрии

  1. Отрегулируйте одноклеточную суспензию из трипсинизированных или размороженных клеток (субпассажи 3 или 4) в концентрации 1 x 106 клеток / мл 1x PBS-5% FBS. Aliquot 100 мкл со 100 000 клеток в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл. Используйте одну аликвоту без маркировки для контроля автофлуоресценции.
  2. Добавьте в остальное все необходимое количество Anti-CD105 AF-594 и Anti-CD31 AF-680 в соответствии с инструкциями производителя. Инкубировать в темноте 20 мин при 4 °C.
  3. Отмойте излишки пятна 1 мл 1x PBS-5% FBS центрифугированием при 250 x g в течение 5 мин и суспендируйте в 300 мкл 1% формалина.
  4. Выполните сбор образца на проточном цитометре. Стратегия стробирования ячеек основана на стробировании FSC-A против SSC-A, одиночные клетки закрыты с использованием SSC-H против SSC-A, за которыми следует FSC-A против FSC-H.
  5. Используйте детектор Y610-mCherry-A для CD105 AF-594 и детектор R660-APC-A для CD31 AF-680.

7. Дифференциация ИСС в адипогенную линию

  1. В 6-луночную пластину высевают 1 x 10 4 клеток (P-4) на см 2 и инкубируют при 37 ° C, 5% CO2, до слияния 60-80% (~ 72-96 ч). Индуцируют дифференцировку, применяя непосредственно к питательной среде: 4 мкМ инсулина, 1 мкМ дексаметазона 21-ацетата (Dxa) и 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (MIX). Меняйте дифференцированную среду каждые 2-3 дня.
  2. Приготовьте исходный раствор 800 мкМ инсулина в 2 мл стерильной сверхчистой воды (добавьте 20 мкл 1 N HCl для обеспечения полного растворения) и храните при -20 °C. Добавьте 10 мкл инсулина, предварительно разбавленного 1:100, и внесите 10 мкл в конечном объеме 2 мл на лунку.
  3. Приготовьте исходный раствор 1 мМ Dxa в 5 мл стерильной сверхчистой воды (обратите внимание, что полного растворения не происходит). Хранить при температуре 4 °C. Добавьте 40 мкл на лунку разбавления Dxa в соотношении 1:4.
  4. Приготовьте запас из 100 мМ MIX в 2,5 мл 0,1 N NaOH, вихревой и добавьте 40 мкл 1 N NaOH для полного растворения. Хранить при температуре -70 °C. Добавьте 10 мкл / лунку бульона MIX.
  5. Перед хранением отфильтруйте исходные растворы через стерильный шприцевой фильтр размером 0,22 мкм.
  6. На 12-й день трижды промойте клетки 1x PBS и инкубируйте с 500 мкл 4% формалина в течение 1 ч при ЛТ. Промойте каждую лунку дважды дистиллированной водой, затем 60% изопропанолом в течение 5 мин и дайте высохнуть.
  7. Добавьте 0,5% масляный красный O, разбавленный 60% изопропанолом (500 мкл / лунка), и инкубируйте в течение 20 мин при RT. Промойте 1 мл дистиллированной воды три раза и наблюдайте под перевернутым микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Информацию о необходимых реагентах, оборудовании и материалах см. в таблице материалов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Жировая ткань была получена от взрослых крыс Sprague Dawley в возрасте 3-4 месяцев и с массой тела 401 ± 41 г (среднее геометрическое ± SD). Среднее значение 3,8 г придатка яичка и околопочечной жировой ткани соответствовало анализу 15 экспериментальных экстракций. После 24 ч культивирования клеточные популяции оставались прилипшими к пластиковой поверхности и демонстрировали гетерогенную морфологию. Первый пассаж был реализован через 8 ± 2 дня с выходом 1,4 ± 0,6 х 106 клеток в общей сложности в восьми экспер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последние четыре десятилетия с момента открытия МСК несколько групп исследователей описали процедуры получения МСК из разных тканей и видов. Одним из преимуществ использования крыс в качестве животной модели является простота их содержания и быстрого развития, а также легкость получения МСК из жировой ткани. Для получения ИСС были описаны различные тканевые источники, такие как висцеральный, перипочечный, придатковый и подкожный жир 12,13,14,15,16.<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность Мексиканскому институту социального обеспечения (IMSS) и Детской больнице Мексики Федерико Гомесу (HIMFG) и сотрудникам Bioterio Исследовательской координации IMSS за поддержку, оказанную для реализации этого проекта. Мы благодарим Национальный совет по науке и технологиям за стипендию AOC (815290) и Антонио Дуарте Рейеса за техническую поддержку в аудиовизуальных материалах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Амфотерицин BHyCloneSV30078.01
Аналитические весыSartoriusAX224
Антитела против CD9 (C-4)Santa CruzSc-13118
Антитела против CD34 (C-18)Santa CruzSc-7045
Антитела против C63Santa CruzSc-5275
Антитела против Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa CruzSc-18838A594
Антитело против CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680Santa CruzSc-18916AF680
Антитело козье против рабитта IgG (H+L) Cy3 NovusNB 120-6939
Антитело Donkey против козы IgG (H+L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
Антитело против мыши IgG FITC конъюгированная коза F (ab´)РД Системс.No F103B
Бутылочный фильтр стерильныйCORNING10718003
колбы для клеточных и тканевых культурBIOFIL170718-312B
Счетчик клеток Bright-Line гемацитометр с камерой подсчета клетокSIGMA Aldrich Z359629
Клеточные лунки: 6 лунок с крышкойCORNING25810
Центрифуга конические пробиркиHeTTICHROTANA460R
Центрифуга Eppendorf TubesFischer ScientificM0018242_44797
Collagen IV WorthingtonLS004186
CryovialSPL Life Science43112
Культуральные пробиркиGreiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0Beckman CoulterБесплатная версия
Цитометр CytoFlex LXBeckman CoulterFLOW-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSO SIGMAAldrich 67-68-5
DraQ7 DyeThermo Sc. D15106
ЭДТАСИГМА Олдрич60-00-4
Эозин желтоватыйHycel300
Этанол 96%Baker64-17-5
Пробирки Falcon 15 млGreiner Bio-One 188271
Falcon пробирки 50 млGreiner Bio-One 227261
фетальной сывороткой крупного рогатого скота CORNING35-010-CV
ЖелатинSIGMA Aldrich128111163
гентамицинGIBCO15750045
глицерин-высокой чистотыHerschi Trading 56-81-5
ГематоксилинAMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 инкубатор Thermo Sc.
Кетамин Пэт (Кетамин Клоридрат)АрандаSV057430
L-глютамин GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
LSM программное обеспечение Zen 2009 V5.5Бесплатная версия
Кабинет биологической безопасности класса IINuAire12082100801
Эпифлуоресцентный микроскоп Zeiss Axiovert 100M21.0028.001
Инвертированный микроскоп Olympus CK40CK40-G100
Заменимые аминокислоты 100XGIBCO11140050
Микропробирки 2 мл Sarstedt 72695400
Микропробирки 1,5 млSarstedt 72706400
Микропипетки 0,2-2 LFinnpipetteE97743
Микропипетки 2-20 μ LFinnpipetteF54167
Микропипетки 20-200 μ LFinnpipetteG32419
Микропипетки 100-1000 LFinnpipetteFJ39895
Азотный бак жидкийTaylor-Wharton681-021-06
ПараформальдегидSIGMA AldrichSLBC3029V
Пенициллин/Стрептомицин GIBCO/ Thermo Sc.
Чашка Петри Клеточная культураCORNING Inc480167
Pipet TipsAxygen Scientific301-03-201
Пизабентал (пентобарбитал натрия)PISA AgropecuariaQ-7833-215
Хлорид калия J.T.Baker7447-40-7
Фосфат калия двухконтурныйJ.T Baker2139900
S1 Наполнители для пипетокThermo Sc9531
Серологическая пипетка 5 млPYREXL010005
Серологическая пипетка 10 млPYREXL010010
Бикарбонат натрияJ.T Baker144-55-8
Хлорид натрия J.T.Baker15368426
Диосновной фосфат натрия БезводныйJ.T Baker7558-79-4
Пируват натрияGIBCO BRL11840-048
Шприцевой фильтр стерильныйCORNING431222
СпектрофотометрPerkinElmer Lambda 25L6020060
Титровая пластинашейкер LAB-LINE1250
Перенос пипетокSamco/Thermo Sc728NL
Трипан синий окрашиваниеGIBCO1198566
трипсин из поджелудочной железы свиньиSIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-64-5
универсальный блокирующий реагент 10xBioGenexHK085-GP
Xilapet 2% (ксилазина гидрохлорид)Pet' s PharmaQ-7972-025
5011604715140122

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
  2. Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
  3. González, M. Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , Universidad de León. PhD thesis, http://hdl.handle.net/10612/3600 (2014).
  4. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  5. Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419(2019).
  6. Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
  7. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68(2019).
  8. Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221(2013).
  9. Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
  10. Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
  11. Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
  12. Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
  13. Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
  14. Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765(2019).
  15. Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126(2021).
  16. Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
  17. Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
  18. Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615(2011).
  19. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  20. Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
  21. Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
  22. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
  23. Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
  24. Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
  25. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).
  26. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  27. Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
  28. Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
  29. He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи