В естественных условиях Визуализация всего мозга личинок рыбок данио-рерио с использованием трехмерной флуоресцентной микроскопии

Рыбки данио-рерио (Danio rerio) широко используются в качестве образцовых позвоночных животных в неврологии благодаря своей оптической прозрачности на личиночной стадии, быстрому развитию, низким затратам на техническое обслуживание и наличию разнообразных генетических инструментов 1,2,3,4. В частности, оптическая прозрачность личинок в сочетании с генетически кодируемыми флуоресцентными репортерами биологических событий 5,6,7,8,9 дает уникальную возможность визуализировать как активность нейронов, так и структуру на уровне всего мозга 10,11,12,13,14 . Однако даже при использовании микроскопа, поддерживающего клеточное разрешение, полученные изображения не обязательно сохраняют информацию на уровне отдельных клеток; Качество оптического изображения может быть ухудшено из-за аберрации, вносимой агарозным гелем, используемым для монтажа образца, рыба может быть установлена под углом, таким образом, области интереса не полностью содержатся в поле зрения микроскопа, и рыба может двигаться во время записи, вызывая артефакты движения на изображениях или препятствуя точному извлечению сигнала из изображений.

Таким образом, необходим эффективный и воспроизводимый протокол для получения высококачественных данных изображения с минимальным шумом и движением. К сожалению, общедоступные протоколы визуализации всего мозга личинок рыбок данио-рерио in vivo 15,16,17,18,19 лишь кратко описывают процедуру, оставляя существенные части деталей, таких как затвердевание агарозы, точные методы монтажа и позиционирование образца с помощью щипцов^, на усмотрение каждого экспериментатора. Кроме того, несоответствия в методах концентрации агарозы и иммобилизации 10,11,14,15,16,17,18,19 могут привести к проблемам^, возникающим при движении рыбы в процессе визуализации.

Здесь представлен подробный протокол визуализации всего мозга личинок рыбок данио-рерио с использованием трехмерной флуоресцентной микроскопии. На рисунке 1 представлен графический обзор протокола: подготовка и иммобилизация образцов, встраивание образцов, получение изображений и визуализация после визуализации. Структурная и функциональная визуализация мозга личинок рыбок данио-рерио in vivo демонстрируется с использованием коммерческого конфокального микроскопа и специально разработанного флуоресцентного микроскопа. Этот протокол может быть адаптирован практиками для визуализации мозга с определенными сенсорными стимулами или контекстами поведения в зависимости от экспериментальных потребностей и дизайна.

Все эксперименты с рыбками данио-рерио были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) KAIST (KA2021-125). Всего 12 взрослых рыбок данио-рерио с паннейрональной экспрессией индикатора кальция GCaMP7a [Tg(huc:GAL4); Для разведения использовались Tg(UAS:GCaMP7a)] на фоне каспера [mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)]. Эта группа состояла из восьми самок и четырех самцов в возрасте от 3 до 12 месяцев. Эксперименты с визуализацией были проведены на личинках рыбок данио-рерио через 3-4 дня после оплодотворения (d.p.f.), стадии, в течение которой их пол не может быть определен.

1. Подготовка образцов рыбок данио-рерио

1. Собирают эмбрионы после разведения взрослых рыб желаемой трансгенной линии, таких как Tg (huc: GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)^20,21,22, в чашке Петри, наполненной яичной водой (см. Таблицу материалов). Поместите эмбрионы в инкубатор при температуре 28 °C и вырастите их до 3-4 д..ф. личинок^23,24,25.
   1. Если фон рыбок данио-рерио не альбинос, чтобы подавить образование пигментации, перенесите эмбрионы через 24 ч после оплодотворения (h.p.f.) в чашку Петри, наполненную яичной водой, содержащей 200 мкМ 1-фенил-2-тиомочевины (PTU; см. Таблицу материалов)^25,26. Каждые 24 часа перекладывайте рыбу в новую посуду со свежей яичной водой, содержащей 200 мкМ ПТУ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рыбки данио-рерио содержатся в стандартных условиях при 28 ° C и 14:10 ч светлый: темный. Известно, что лечение PTU влияет на поведение и функцию щитовидной железы личинок рыбок данио-рерио^27,28. Поэтому важно использовать PTU с осторожностью и тщательно контролировать потенциальные мешающие факторы в любых экспериментах.
2. Чтобы найти образец, экспрессирующий интересующие флуоресцентные белки (например, паннейрональный GCaMP7a), проведите скрининг образца под эпифлуоресцентным микроскопом и выберите образец с яркой экспрессией.
3. Подготовьте отобранный образец рыбок данио-рерио 3-4 д..ф. в чашке Петри, наполненной яичной водой (рис. 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для регистрации спонтанной активности нейронов рекомендуется использовать образцы в возрасте от 80 до 100 л.с., так как уровень спонтанной активности низок до 80 л.с., а развитие пигментации, даже на фоне Каспера, может ухудшить качество изображения после 100 л.с.
4. Приготовьте 0,25 мг/мл раствора бромида панкурония 14,19,29,30,31, добавив 1 мл исходного раствора ^2,5 мг/мл (см. Таблицу материалов) к ¹⁰ мл яичной воды. Аликвотируйте раствор бромида панкурония в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
5. Перенесите предварительно просеянный образец в чашку Петри с помощью трансферной пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Постарайтесь взять с собой минимальный объем яичной воды.
6. Перенесите 0,1 мл раствора бромида панкурония в чашку Петри для паралича.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бромид панкурония оказывает потенциальное демпфирующее действие на нейронную активность личинок рыбок^{данио-рерио 32}. Важно тщательно учитывать концентрацию и продолжительность воздействия бромида панкурония.

2. Приготовление 2% (мас./об.) агарозного геля

1. Включите тепловой блок и установите целевую температуру на 37 °C. Подождите, пока устройство нагреется и уравновесится при заданной температуре.
2. Растворите 0,2 г порошка агарозы с низкой температурой плавления (см. Таблицу материалов) в 10 мл яичной воды.
3. Нагрейте раствор агарозы в микроволновой печи и перемешайте его, встряхивая и взбалтывая, пока агароза полностью не растворится.
4. Аликвотируйте агарозный гель в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и храните микроцентрифужные пробирки на тепловом блоке (рис. 2B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, не исчезли ли пузырьки в агарозном геле.

3. Монтаж и позиционирование образца

1. Проверьте образец под стереомикроскопом, чтобы убедиться, что движение личинок прекратилось, и визуально оценить здоровье образца, проверив его сердцебиение (рис. 2C). Если сердцебиение слишком медленное, выбросьте образец.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если сердцебиение рыбы, получающей изображение, слишком медленное (например, ниже 60 ударов в минуту), может оказаться невозможным выполнить долгосрочную визуализацию. Чтобы оценить самочувствие рыбы, частоту сердечных сокращений можно визуально проверить, сравнив ее с другими рыбами в той же чашке Петри. Это поможет убедиться, что рыба, которую визуализируют, здорова и достаточно стабильна для процедуры визуализации.
2. Используя пипетку для переноса, поместите одну личинку рыбки данио-рерио в агарозный гель в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл (рис. 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно выбросьте пипетку после переноса образца.
3. Налейте агарозный гель в чашку Петри, чтобы получился слой толщиной 1-2 мм. Перенесите образец из микроцентрифужных пробирок в чашку Петри с помощью пипетки для переноса так, чтобы личинка была помещена в центр чашки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если в агарозном геле есть пыль и пузырьки, удалите их с помощью пипетки для переноса.
4. Используйте щипцы, чтобы расположить образец в желаемой ориентации так, чтобы голова и хвост были плоскими (рис. 2E).
5. Поверните образец с помощью щипцов так, чтобы оба глаза были на одном уровне (рис. 2F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры выравнивания (положение и вращение) должны быть завершены до того, как агарозный гель начнет затвердевать.
6. После выравнивания подождите, пока агарозный гель застынет (рис. 2G, H).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время ожидания затвердевания агарозного геля может составлять от 5 до 10 минут, в зависимости от объема и размера геля.
7. После застывания агарозного геля наполните чашку Петри яичной водой и поместите чашку Петри со встроенным образцом на столик микроскопа (рис. 2I).

4. Получение изображения

1. Включите систему микроскопа (например, лазеры, конфокальные контроллеры, микроскоп и компьютер; см. Таблицу материалов) и убедитесь, что вся система работает.
2. Выберите объектив с малым увеличением и расположите образец в центре поля зрения.
3. Выберите объектив с погружением в воду или погружение в воду с правильным увеличением (например, объектив с числовой апертурой 16x 0,8 (NA); см. Таблицу материалов). Внесите точные коррективы в поле зрения.
4. Установите параметры изображения (например, размер изображения, мощность лазера, время экспозиции, количество кадров) с помощью программного обеспечения для получения изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Установите параметры визуализации для достижения наилучших возможных результатов для конкретных нужд (см. настройку для получения изображений в разделе репрезентативных результатов). Если изображение насыщенное, уменьшите мощность лазера.
5. Найдите мозг образца, перемещая предметный столик, и определите его толщину в режиме просмотра в реальном времени в программном обеспечении, изменяя фокальные плоскости вручную вверх и вниз. Установите нижнюю и верхнюю границы громкости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что весь мозг находится в поле зрения как в боковом, так и в осевом направлениях.
6. Установите размер шага z, учитывая осевое разрешение микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный размер z-шага для визуализации мозга личинок рыбок данио-рерио зависит от метода визуализации и разрешения микроскопа. В качестве примера был использован z-шаг размером 5 мкм с учетом толщины легкого листа и среднего диаметра тел^{клеток 10}.
7. Продолжите получение изображения для заданного поля зрения.
   1. Для объемной структурной визуализации получите 3-D изображение (x, y, z) всего мозга, изменив фокальные плоскости и получив 2-D изображения каждой z-плоскости последовательно.
   2. Для функциональной визуализации одной z-плоскости получите изображения временных рядов (x, y, t) нейронной активности мозга на определенной глубине.
   3. Для объемной функциональной визуализации получите 4-D изображение (x, y, z, t) активности нейронов во всем мозге путем последовательного получения 3-D изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите количество кадров с учетом доступного объема памяти компьютера. Рекомендуется время приобретения менее 1 ч из-за продолжительности действия бромида панкурония.
8. После получения изображений сохраните результаты и запишите параметры изображения (например, размер пикселя, размер z-шага, частоту кадров, мощность лазера) для анализа изображений.
9. Экспортируйте изображения в соответствующий формат для рендеринга данных и анализа изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется экспортировать изображения в формате файла изображения с тегами (TIF). TIF поддерживает сжатие изображений без потерь и совместим с большинством программ для обработки изображений и языков программирования. Кроме того, формат TIF поддерживает включение метаданных, таких как параметры съемки, разрешение изображения и другую соответствующую информацию, которая может помочь в интерпретации и воспроизводимости данных.

5. Настройка визуализаций с помощью napari

ПРИМЕЧАНИЕ: napari — это программа для просмотра многомерных изображений с открытым исходным кодом в среде Python с рендерингом³³ на основе графического процессора (GPU). Плагин napari-animation обеспечивает программное создание фильмов. Использование Fiji, программы обработки изображений с открытым исходным кодом, рекомендуется для обработки изображений общего назначения, такой как фильтрация и геометрическое преобразование (см. Таблицу материалов). Исходный код, используемый для визуализации с помощью napari, доступен на GitHub (https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization).

1. Установите napari и napari-animation с помощью pip или conda. После установки создайте новый файл записной книжки jupyter.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать с записной книжкой jupyter, которая является интерактивным инструментом для Python, а не со скриптом Python.
2. Импорт napari и napari-animation.

6. Визуализация структур с помощью напари

1. Чтобы визуализировать изображения и создать видеоролики о мозге рыбок данио, загрузите 3D-изображение (x,y,z) и откройте окно napari. Подключите плагин napari-animation (рисунок 3A).
2. Задайте такие параметры, как размер вокселей, цветовая карта и пределы контрастности в элементах управления слоями.
3. Отрегулируйте параметры просмотра (например, перспективу, углы) на холсте.
4. Чтобы захватить визуализированное изображение, нажмите кнопку захвата в мастере анимации.
5. Чтобы создать видеоролики визуализированного объема, измените настройки средства просмотра и добавьте ключевые кадры (рис. 3B).
6. После добавления ключевых кадров задайте количество кадров (шагов) между ключевыми кадрами в мастере анимации. Сохраните визуализированную анимацию.

7. Обработка изображений и визуализация активности нейронов с помощью напари

ПРИМЕЧАНИЕ : Чтобы визуализировать изображения нейронной активности во временных рядах в виде наложенных изображений статического фона и активности, к необработанным изображениям должен быть применен алгоритм декомпозиции. Используйте реализацию алгоритма декомпозиции MATLAB под названием BEAR²⁴. Версия MATLAB BEAR доступна на GitHub (https://github.com/NICALab/BEAR).

1. Чтобы разложить статический фон и активность нейронов, примените BEAR к необработанным изображениям временных рядов (x, y, t или x, y, z, t). После декомпозиции сохраните изображения фона и активности нейронов в виде файлов TIF (рис. 3C).
2. Загрузите фоновые изображения и изображения нейронной активности и откройте окно напари. Подключите плагин napari-animation.
3. Используйте серую цветовую карту для фоновых изображений и горячую цветовую карту для изображений нейронной активности (рис. 3C).
4. Задайте такие параметры, как пределы непрозрачности и контрастности в элементах управления слоями.
5. Чтобы создать видеоролики с активностью нейронов, измените настройки средства просмотра и добавьте ключевые кадры для рендеринга анимации.
6. После добавления ключевых кадров задайте количество кадров (шагов) между ключевыми кадрами в мастере анимации. Сохраните визуализированную анимацию.

Структура и нейрональная активность мозга личинок рыбок данио, экспрессирующих индикатор кальция GCaMP7a (Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a))20,21,22 с фоном Каспера (mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9))34 был изображен на 3-4 d.p.f. в соответствии с описанным протоколом.

Для объемной структурной визуализации образец был изображен с использованием коммерческой системы точечной сканирующей конфокальной микроскопии, оснащенной линзой для погружения в воду 16x 0,8 NA. Лазер возбуждения с длиной волны 488 нм использовался как для структурной, так и для функциональной визуализации. Частота кадров, разрешение изображения, размер пикселя и размер осевого шага составляли 0,25 Гц, 2048 x 2048, 0,34 мкм и 1,225 мкм соответственно. Получение изображения заняло примерно 1 час 20 минут. Объемное поле зрения полученного изображения охватывало области переднего, среднего и заднего мозгов (рис. 4А). Тела нейрональных клеток продолговатого мозга, мозжечковой пластинки, тектума зрительного нерва, габенулы и дорсального головного мозга во всем мозге личинок рыбок данио-рерио 4 d.p.f. были хорошо видны на изображениях конфокальной микроскопии (рис. 4B). 3D-рендеринг изображений конфокальной микроскопии был выполнен с использованием napari27 в соответствии с вышеупомянутым протоколом (рис. 4C и видео 1).

Для функциональной визуализации в 2-D образец был визуализирован с использованием той же системы конфокальной микроскопии, оснащенной линзой объектива 16x 0,8 NA, погружающейся в воду. Частота кадров, разрешение изображения и размер пикселя составляли 2 Гц, 512 x 256 и 1,5 мкм соответственно. Тела нейрональных клеток были хорошо видны как на заднем плане, так и на наложенной нейронной активности (рис. 5A, B).

Для 3-D функциональной визуализации была использована специально разработанная система 3-D микроскопии18 , которая была способна in vivo визуализировать нейронную активность всего мозга личинок рыбок данио-рерио с полем зрения 1040 мкм × 400 мкм × 235 мкм и боковым и осевым разрешениями 1,7 мкм и 5,4 мкм соответственно. Скорость визуализации составила до 4,2 объема в секунду. Подобно рендерингу данных структурной визуализации, напари использовался для 3D-рендеринга данных визуализации кальция всего мозга (рис. 5C и видео 2).

Рисунок 1: Обзор экспериментальной процедуры. Подготовка проб и парализация рыбок данио-рерио (шаг 1). Препарат 2% (мас./об.) агарозного геля (стадия 2). Монтаж и позиционирование образца (шаг 3). Получение изображения (шаг 4). Обработка изображений и визуализация структуры и активности нейронов (шаг 5-7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Экспериментальная процедура подготовки визуализации всего мозга . (A) Скрининговый образец рыбок данио, экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a, в чашке Петри, наполненной яичной водой. (B) Оборудование и материалы, необходимые для монтажа и позиционирования образца. (1) Тепловой блок при 37 °C; (2) 2% (мас./об.) агарозный гель; (3) микроцентрифужная пробирка объемом 1,5 мл; (4) яичная вода; 5) 0,25 мг/мл раствора бромида панкурония; (6) чашка Петри; (7) щипцы; (8) Пипетка для переноса. (C) Стереомикроскопическое изображение парализованного образца. Черная стрелка указывает на сердце образца. (D) Образец в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл переносится с помощью пипетки. На врезке показан увеличенный вид коробочной области. (E) Образец (черная стрелка) помещают в центр чашки Петри с помощью щипцов. (F) Образец выравнивается с помощью щипцов. (G) Пример смещенного внедренного образца. (H) Пример выровненного встроенного образца. (I) Образец помещают на столик микроскопа под линзой объектива для получения изображения. Масштабная линейка: 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Визуализация изображений мозга личинок рыбок данио . (A) 3-D рендеринг конфокального микроскопического изображения личинок рыбок данио-рерио (4 d.p.f) мозга, экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a. Для рендеринга использовался napari, многомерный просмотрщик изображений с открытым исходным кодом в среде Python. Окно napari содержит элементы управления слоями (красное прямоугольнико), список слоев (желтое прямоугольнико), холст (синее прямоугольнико) и мастер анимации (зеленое прямоугольнико). (B) Для рендеринга анимации добавлены ключевые кадры с несколькими настройками просмотра. (C) Конфокальное микроскопическое изображение 2-D покадровой визуализации активности нейронов в мозге личинок рыбок данио. Изображение разлагается на фон (слева) и активность нейронов (посередине), затем накладывается (справа). Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Визуализация структуры мозга личинок рыбок данио. (A) Проекция максимальной интенсивности (MIP) изображения конфокальной микроскопии личинок рыбок данио-рерио (4 d.p.f.) мозга, экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a. Сверху: боковой MIP. Днище: осевой MIP. Каждая граница содержит передний мозг (красный), средний мозг (желтый) и задний мозг (синий). (B) В общей сложности 10 осевых срезов на разной глубине из объемного изображения мозга (при z = 25 мкм, 50 мкм, 75 мкм, 100 мкм, 125 мкм, 150 мкм, 175 мкм, 200 мкм, 225 мкм, 250 мкм, считанных сверху вниз; z = 0 мкм указывает на верхнюю поверхность мозга). Каждая белая коробка представляет область мозга (продолговатый мозг, мозжечковая пластинка, тектум зрительного нерва, габенула и дорсальный головной мозг). (C) Весь мозг визуализируется с помощью напари. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Визуализация нейронной активности мозга личинок рыбок данио . (A) Изображение конфокальной микроскопии активности нейронов в мозге личинок рыбок данио-рерио (4 d.p.f.), экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a. Масштабная линейка: 100 мкм. (B) Увеличенный вид коробочной области в А , показывающий активность нейронов в оптическом тектуме в несколько моментов времени. Масштабная линейка: 20 мкм. (C) 3D-визуализация активности нейронов всего мозга в мозге личинок рыбок данио, полученная с помощью специально разработанного микроскопа (слева: t = 133 с; справа: t = 901 с). Активность нейронов накладывается на статический фон. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Покадровая съемка с дрейфом образца и без него. (A) Покадровая визуализация мозга личинок рыбок данио, экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a с дрейфом образца. Яичную воду добавляли в образец перед затвердеванием агарозного геля (этап 3.6-3.7). Рыба двигалась в боковом и осевом направлениях. (B) Покадровая съемка мозга личинок рыбок данио-рерио без дрейфа образца. Яичную воду добавляли в образец после затвердевания агарозного геля (этап 3.6-3.7). Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: 3-D рендеринг структуры всего мозга личинки рыбки данио-рерио (4 d.p.f.), мозг экспрессирует паннейрональный GCaMP7a. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 2: 3D-рендеринг активности нейронов всего мозга в мозге личинок рыбок данио-рерио (4 d.p.f.), экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.