Method Article

Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений

DOI:

10.3791/65236

⸱

May 5th, 2023

 ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Institute of Genetics and Biotechnology, University of Warsaw, 2Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 3International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описана процедура изучения динамики метаболизма митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках с использованием формата многолуночного планшета и автоматизированной иммунофлуоресцентной визуализации для обнаружения и количественной оценки синтеза и распределения мтДНК. Это может быть дополнительно использовано для исследования влияния различных ингибиторов, клеточных стрессов и подавления генов на метаболизм мтДНК.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подавляющее большинство клеточных процессов требует непрерывного снабжения энергией, наиболее распространенным переносчиком которой является молекула АТФ. Эукариотические клетки производят большую часть своего АТФ в митохондриях путем окислительного фосфорилирования. Митохондрии являются уникальными органеллами, потому что у них есть собственный геном, который реплицируется и передается следующему поколению клеток. В отличие от ядерного генома, в клетке есть несколько копий митохондриального генома. Детальное изучение механизмов, ответственных за репликацию, восстановление и поддержание митохондриального генома, имеет важное значение для понимания правильного функционирования митохондрий и целых клеток как в нормальных, так и в болезненных условиях. Здесь представлен метод, позволяющий с высокой пропускной способностью количественно определять синтез и распределение митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках человека, культивируемых in vitro . Этот подход основан на иммунофлуоресцентном обнаружении активно синтезируемых молекул ДНК, меченных включением 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU), и одновременном обнаружении всех молекул мтДНК с анти-ДНК-антителами. Кроме того, митохондрии визуализируются с помощью специфических красителей или антител. Культивирование клеток в многолуночном формате и использование автоматизированного флуоресцентного микроскопа облегчают изучение динамики мтДНК и морфологии митохондрий в различных экспериментальных условиях за относительно короткое время.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для большинства эукариотических клеток митохондрии являются важными органеллами, поскольку они играют решающую роль во многих клеточных процессах. Прежде всего, митохондрии являются ключевыми поставщиками энергии для клеток1. Митохондрии также участвуют в регуляции клеточного гомеостаза (например, внутриклеточный окислительно-восстановительныйпотенциал 2 и кальциевый баланс3), клеточной сигнализации 4,5, апоптозе6, синтезе различных биохимических соединений 7,8 и врожденном иммунном ответе9. Митохондриальная дисфункция связана с различными патологическими состояниями и заболеваниями человека10.

Функционирование митохондрий зависит от генетической информации, расположенной в двух отдельных геномах: ядерном и митохондриальном геномах. Митохондриальный геном кодирует небольшое количество генов по сравнению с ядерным геномом, но все гены, кодируемые мтДНК, необходимы для жизни человека. Митохондриальный белковый механизм, необходимый для поддержания мтДНК, кодируется нДНК. Основные компоненты митохондриальной реплисомы, а также некоторые факторы митохондриального биогенеза уже идентифицированы (рассмотрено в предыдущих исследованиях11,12). Тем не менее, механизмы репликации и поддержания митохондриальной ДНК все еще далеки от понимания. В отличие от нДНК, митохондриальный геном существует в нескольких копиях, что обеспечивает дополнительный слой для регуляции экспрессии митохондриальных генов. В настоящее время гораздо меньше известно о распределении и сегрегации мтДНК внутри органелл, в какой степени эти процессы регулируются, и если да, то какие белки участвуют13. Модель сегрегации имеет решающее значение, когда клетки содержат смешанную популяцию мтДНК дикого типа и мутировавшей. Их неравномерное распределение может привести к образованию клеток с пагубным количеством мутировавшей мтДНК.

До сих пор белковые факторы, необходимые для поддержания мтДНК, были идентифицированы в основном биохимическими методами, биоинформационным анализом или исследованиями, связанными с заболеванием. В данной работе для обеспечения высокой вероятности выявления факторов, ранее избежавших идентификации, описана иная стратегия. Метод основан на мечении мтДНК во время репликации или репарации 5-бром-2'-дезоксиуридином (BrdU), нуклеозидным аналогом тимидина. BrdU легко включается в зарождающиеся нити ДНК во время синтеза ДНК и, как правило, используется для мониторинга репликации ядерной ДНК14. Однако разработанная здесь процедура была оптимизирована для обнаружения BrdU, включенного в мтДНК, с использованием иммунофлуоресценции антител против BrdU.

Этот подход позволяет проводить высокопроизводительную количественную оценку синтеза и распределения мтДНК в клетках человека, культивируемых in vitro. Для проведения испытаний в различных экспериментальных условиях за относительно короткое время необходима стратегия с высокой пропускной способностью; Поэтому в протоколе предлагается использовать многолуночный формат для культивирования клеток и автоматизированную флуоресцентную микроскопию для визуализации. Протокол включает трансфекцию клеток HeLa человека с библиотекой миРНК и последующий мониторинг репликации или репарации мтДНК с использованием метаболической маркировки вновь синтезированной ДНК с помощью BrdU. Такой подход сочетается с иммуноокрашиванием ДНК с помощью антиДНК-антител. Оба параметра анализируются с помощью количественной флуоресцентной микроскопии. Кроме того, митохондрии визуализируются с помощью специального красителя. Чтобы продемонстрировать специфичность протокола, окрашивание BrdU было протестировано на клетках, лишенных мтДНК (клетки rho0), на клетках HeLa при подавлении хорошо известных факторов поддержания мтДНК и на клетках HeLa после лечения ингибитором репликации мтДНК. Уровни мтДНК также измерялись независимым методом, а именно кПЦР.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление смеси миРНК

  1. За день до начала эксперимента семенные клетки (например, HeLa) помещают в чашку диаметром 100 мм так, чтобы на следующий день они достигли слияния 70%-90%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции должны проводиться в стерильных условиях в ламинарной проточной камере.
  2. Приготовьте соответствующее количество миРНК, разбавленной до концентрации 140 нМ в среде Opti-MEM (см. Таблицу материалов). В качестве резервуара можно использовать 96-луночную плиту.
  3. Добавьте 5 мкл раствора миРНК (или среды Opti-MEM для контрольных образцов) в каждую лунку черной 384-луночной микропланшетки для клеточной культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества тестируемых образцов миРНК можно использовать электронную или многоканальную пипетку.
  4. Приготовьте соответствующее количество раствора реагента для трансфекции RNAiMAX (см. Таблицу материалов) в среде Opti-MEM. Добавьте 1 мкл РНКиМАКС на каждые 100 мкл среды.
  5. Добавьте 10 мкл раствора реагента для трансфекции в каждую лунку 384-луночного планшета. Удобнее и быстрее всего это сделать с помощью дозатора реагентов.
  6. Инкубируют миРНК с реагентом для трансфекции в течение 30 мин при комнатной температуре.

2. Подготовка клеток к трансфекции

  1. Во время инкубации (этап 1.6) аспирируйте среду с помощью всасывающего устройства (см. Таблицу материалов) и промойте клетки 3 мл PBS.
  2. Добавьте 1,5 мл трипсина, разбавленного 1:2 в PBS, и инкубируйте клетки при 37 ° C в течение 10 мин.
  3. Проверьте, не отсоединились ли ячейки; если это так, добавьте 3 мл среды DMEM с 10% FBS. Тщательно суспендируйте клетки и перенесите их в пробирку объемом 15 мл. Возьмите не менее 150 мкл суспензии и подсчитайте клетки в камере для подсчета клеток (см. Таблицу материалов).
  4. Приготовьте клеточную суспензию в соответствующей концентрации (35 000 / мл для линии HeLa) в среде DMEM с 10% FBS, пенициллином и стрептомицином.

3. Трансфекция клеток

  1. Добавьте 20 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 384-луночной пластины с помощью дозатора реагентов. Это приведет к тому, что в лунку будет засеяно 700 клеток.
  2. Инкубируют клетки в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем помещают их в инкубатор на 72 ч (37 °C и 5%CO2).

4. Регистрация BrdU

  1. Приготовьте 90 мкМ раствор BrdU (см. Таблицу материалов) в среде DMEM с 10% FBS.
  2. Через 56 ч после трансфекции миРНК (за 16 ч до фиксации клетки) добавляют по 10 мкл 90 мкМ раствора BrdU в каждую лунку 384-луночного планшета (конечная концентрация BrdU составляет 20 мкМ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Действие должно быть выполнено как можно быстрее; Поэтому лучше всего использовать дозатор реагентов, электронную пипетку или дозатор с несколькими дозаторами. Не забудьте подготовить контрольные скважины без добавления BrdU.
  3. Инкубируют клетки в течение 16 ч (37 °C и 5%CO2).

5. Маркировка митохондрий

  1. Готовят 20 мкМ раствор BrdU в ДМЭМ с 10% FBS и добавляют к нему раствор митохондриального слежения за красителем (см. Таблицу материалов) до концентрации 1,1 мкМ.
  2. Через 15 ч после начала включения BrdU (за 1 ч до фиксации клетки) добавляют по 10 мкл раствора митохондриального следящего красителя (см. Таблицу материалов) в каждую лунку 384-луночной пластины (конечная концентрация красителя составляет 200 нМ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте дозатор реагентов, электронную дозатор или дозатор с несколькими дозаторами. Не забывайте сохранять контрольные лунки без добавления BrdU, но с добавлением красителя для отслеживания митохондрий.
  3. Инкубируют клетки в течение 1 ч (37 °C и 5%CO2).

6. Фиксация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все промывки удобнее всего проводить с помощью микропластинчатой шайбы, в то время как добавление реагентов наиболее быстро осуществляется с помощью дозатора реагентов.

  1. Используя микропланшетную мойку (см. Таблицу материалов), дважды промойте каждую лунку 100 мкл PBS. После второй промывки оставьте 25 мкл PBS в лунке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оставление PBS в лунке снижает вероятность отслоения клеток во время добавления жидкости на следующем этапе. Все стирки завершаются с оставленным PBS; следовательно, раствор, добавленный на следующем этапе, всегда следует готовить в 2-кратной концентрации, так как он будет добавлен в том же объеме, что и оставшийся PBS.
  2. Фиксируют клетки добавлением 25 мкл 8%-ного раствора формальдегида в PBS с 0,4% Triton X-100 и Hoechst 33342 в концентрации 4 мкг/мл (конечные концентрации отдельных реагентов составляют 4%, 0,2% и 2 мкг/мл соответственно) (см. Таблицу материалов).
  3. Выдерживают пластину в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин.

7. Блокировка

  1. Промойте каждую скважину четыре раза 100 мкл PBS. После последней промывки оставьте в лунке 25 мкл PBS.
  2. Добавьте 25 мкл 6% BSA в PBS (конечная концентрация BSA составляет 3%) в каждую лунку.
  3. Выдерживают пластину в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин.

8. Добавление первичных антител

  1. Аспирируйте BSA с помощью микропланшетной шайбы и оставьте 10 мкл раствора в лунке.
  2. Добавьте 10 мкл первичного раствора антитела, приготовленного в 3% БСА в PBS. Используйте анти-BrdU в дозе 0,8 мкг/мл и анти-ДНК в дозе 0,4 мкг/мл (конечные концентрации антител составляют 0,4 мкг/мл и 0,2 мкг/мл соответственно) (см. Таблицу материалов).
  3. Инкубируйте пластину в темноте при температуре 4 °C в течение ночи.

9. Добавление вторичных антител

  1. Промойте каждую скважину четыре раза 100 мкл PBS. После последней промывки оставьте 10 мкл PBS в лунке.
  2. Добавьте 10 мкл 4 мкг/мл раствора вторичных антител, приготовленного в 6% БСА в PBS (конечная концентрация составляет 2 мкг/мл). Используйте изотип-специфические антитела (антимышиный IgG1 и антимышиный IgM), конъюгированные с флуорохромами, такими как Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 555 (см. Таблицу материалов).
  3. Инкубируйте пластинку в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч.
  4. Промойте каждую скважину четыре раза 100 мкл PBS. После последней промывки оставьте в лунке 50 мкл PBS.
  5. Запечатайте пластину клейкой герметизирующей пленкой (см. Таблицу материалов) и храните в темноте при температуре 4 °C. Визуализация должна быть выполнена в течение 2 недель.

10. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация должна выполняться с помощью автоматизированного широкоугольного микроскопа; Микроскоп должен быть оснащен моторным столиком, снабженным элементами управления для автоматического изображения отдельных участков пластины.

  1. Проверьте настройки автофокуса в угловых областях пластины (лунки A1, A24, P24, P1) и в центре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации рекомендуется использовать объектив с 20-кратным коротким рабочим расстоянием (см. Таблицу материалов) с максимально возможной числовой апертурой.
  2. Основываясь на гистограммах интенсивности, генерируемых программным обеспечением для визуализации в режиме просмотра в реальном времени, выберите достаточно длительное время экспозиции для отдельных каналов флуоресценции, чтобы результирующее изображение не было перенасыщенным.
  3. Установите соответствующее количество плоскостей для визуализации по оси z.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поле зрения при 20-кратном увеличении достаточно велико, чтобы не все ячейки находились в одной плоскости фокуса, поэтому необходимо выполнить z-сечение, чтобы увидеть все ячейки в правильной плоскости фокуса. Обычно достаточно пяти самолетов. В зависимости от наличия дискового пространства могут быть сохранены отдельные z-стеки или только проекции максимальной интенсивности. Анализ изображений, показанный в разделе репрезентативных результатов, основан на проекциях максимальной интенсивности.
  4. Выберите соответствующее количество полей обзора для каждой скважины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от слияния в одном поле зрения можно получить изображение примерно 60-300 ячеек. Как правило, для клеток HeLa со слиянием 60-90% визуализация пяти полей зрения позволяет анализировать от 500 клеток до более чем 1000 клеток.
  5. Выберите лунки для визуализации и начните съемку.

11. Количественный анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Количественный анализ полученных изображений может быть выполнен с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом, такого как Cell Profiler15. Для настоящего исследования анализ проводился с использованием программного обеспечения ScanR 3.0.0 (см. Таблицу материалов).

  1. Начните анализ с выполнения коррекции фона для всех изображений из всех каналов флуоресценции. В зависимости от размера анализируемых объектов выберите подходящий размер фильтра: 80 пикселей для ядер клеток и 4 пикселя для пятен BrdU и мтДНК.
  2. Начните сегментацию изображения с создания маски основного объекта на основе отношения интенсивности флуоресцентного сигнала к фону для канала, соответствующего ядрам клетки.
  3. Создавайте маски для субобъектов, представляющих пятна BrdU и мтДНК соответственно, используя флуоресцентные каналы, подходящие для данных структур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый подобъект присваивается ближайшему основному объекту (ядру клетки).
  4. Установите параметры, которые будут измеряться во время анализа, и измерьте интенсивность отдельных пикселей в каждой маске для всех каналов флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также необходимо рассчитать количество подобъектов, назначенных данному ядру клетки, и площадь каждого подобъекта.
  5. Определите производные параметры, которые будут рассчитаны на основе полученных данных. Чтобы получить общую интенсивность флуоресценции для канала BrdU или мтДНК, суммируйте интенсивности всех субобъектов, назначенных данному ядру клетки. Чтобы получить среднюю интенсивность флуоресценции, разделите общую интенсивность флуоресценции на сумму площади подобъектов, присвоенных данному ядру клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что созданный субобъект (BrdU или пятно мтДНК) действительно находится в митохондриях, необходимо затворить их на основе интенсивности флуоресценции от красителя отслеживания митохондрий.
  6. Выполните дальнейший анализ данных, полученных с помощью программного обеспечения ScanR, с помощью статистического программного обеспечения R 4.2.216 вместе со следующими пакетами: dplyr17, data.table18, ggplot219 и ggpubr20. Этот шаг не является обязательным.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схема процедуры высокопроизводительного исследования динамики синтеза и распределения мтДНК представлена на рисунке 1. Использование многолуночного формата планшета позволяет одновременно анализировать множество различных экспериментальных условий, таких как сайленсинг различных генов с использованием библиотеки миРНК. Условия, используемые для мечения вновь синтезированных молекул ДНК BrdU, позволяют обнаруживать меченную BrdU ДНК в митохондриях клеток HeLa (рис. 2A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исторически сложилось так, что маркировка ДНК путем включения BrdU и обнаружения антител использовалась в репликации ядерной ДНК и исследованиях клеточного цикла 14,27,28. До сих пор все протоколы для обнаружения ДНК, меченной BrdU, включали стадию денатурации ДНК (кислую или термическую) или ферментное расщепление (ДНКазу или протеиназу) для обеспечения воздействия эпитопов и облегчения проникновения антител. Эти протоколы были...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным научным центром, Польша (номер гранта/премии: 2018/31/D/NZ2/03901).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2′,3′-Дидезоксицитидин (ddC)Sigma-AldrichD5782
384  Well Cell Culture Microplates, черныйGreiner Bio-One#781946
5-Bromo-2′-дезоксиуридин (BrdU)Sigma-AldrichB5002-1GРастворите порошок BrdU в воде до 20 мМ исходного раствора и аликвоты. Используйте 20 &микро; Решение M BrdU для маркировки.
Клейкая герметизирующая пленкаNerbe Plus04-095-0060
Alexa Fluor 488 коза против мыши IgG1 вторичное антителоThermo Fisher ScientificA-21121
Alexa Fluor 555 козье антимышиное IgM вторичное антителоThermo Fisher ScientificA-21426
BioTek 405 LS микропластина шайбаAgilent
бычья сыворотка альбумин (BSA)Sigma-AldrichA4503
Камера для подсчета клеток ThomaHeinz HerenzREF:1080339
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)CytivaSH30243.01
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965-062
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)Thermo Fisher Scientific10270-106
Раствор формальдегидаSigma-AldrichF1635Формальдегид токсичен; пожалуйста, внимательно прочтите паспорт безопасности.
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
IgG1 мышиный моноклональный анти-BrdU (IIB5) первичный антителоSanta Cruz Biotechnologysc-32323
IgM мышиный моноклональный анти-ДНК (AC-30-10) первичное антителоProgen#61014
LightCycler 480 SystemRoche
Lipofectamine RNAiMAX Реагент для трансфекции Thermo Fisher Scientific#13778150
MitoTracker Deep Red FMThermo Fisher ScientificM22426Краситель для слежения за митохондриями 
Многокапельный комбинированный дозатор реагентовThermo Fisher Scientific
Opti-MEMThermo Fisher Scientific51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD камераHamamatsu
Пенициллин-стрептомицин Sigma-AldrichP0781-100ML
Фосфатный буферный раствор (PBS)Sigma-AldrichP4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742
qPCR праймер Fw B2M (референс)CAGGTACTCCAAAGATTCAGG 
праймер для количественной ПЦР Fw GPI (референсный ген)GACCTTTACTACCCAGGAGA
праймер для количественной ПЦР Fw MT-ND1 TAGCAGAGACCAACCGAACC 
праймер для количественной ПЦР Fw POLGTGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
праймер для количественной ПЦР FW TCAMGATGAGTTGCCTGCTTTAT
праймер для количественной ПЦР Fw TWNKGCCATGTGACACTGGTCATT
праймер для количественной ПЦР Rev B2M (референс)GTCAACTTCAATGTCGGATGG 
праймер для количественной ПЦР Rev GPI (референсный ген)AGTAGACAGGGCAACAAAGT
праймер для количественной ПЦР Rev MT-ND1 ATGAAGAATAGGGCGAAGGG 
праймер для количественной ПЦР Rev POLGGGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
праймер для количественной ПЦР праймер Rev TFAMGGACTTCTGCCAGCATAATA
праймер для количественной ПЦР праймер Rev TWNKAACATTGTGTGCTTCCTGGC
Микроскоп ScanROlympus
siRNA CtrlDharmaconD-001810-10-5
siRNA POLGInvitrogenPOLGHSS108223
siRNA TFAMInvitrogenTFAMHSS144252
миРНК TWNKInvitrogenC10orf2HSS125597
АспираторNeoLab2-9335Аспиратор для клеточной культуры
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-500ML
TrypsinBiowestL0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA объективныйОлимп

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
  2. Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284(2019).
  3. Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102(2020).
  6. Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
  7. Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
  8. Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579(2020).
  9. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  10. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  11. Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
  12. Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
  13. Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
  14. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  15. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  16. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
  17. Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
  18. Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
  19. Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
  20. Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
  21. Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
  22. Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
  23. Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
  24. Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
  25. Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
  26. Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
  27. Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
  28. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
  29. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
  30. Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial DNADNA SynthesisHigh Throughput ImagingImage QuantificationImmunofluorescence DetectionBrdU IncorporationMitochondrial DistributionAutomated MicroscopysiRNA TransfectionFluorescence Microscopy

Related Articles