Описана процедура изучения динамики метаболизма митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках с использованием формата многолуночного планшета и автоматизированной иммунофлуоресцентной визуализации для обнаружения и количественной оценки синтеза и распределения мтДНК. Это может быть дополнительно использовано для исследования влияния различных ингибиторов, клеточных стрессов и подавления генов на метаболизм мтДНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Подавляющее большинство клеточных процессов требует непрерывного снабжения энергией, наиболее распространенным переносчиком которой является молекула АТФ. Эукариотические клетки производят большую часть своего АТФ в митохондриях путем окислительного фосфорилирования. Митохондрии являются уникальными органеллами, потому что у них есть собственный геном, который реплицируется и передается следующему поколению клеток. В отличие от ядерного генома, в клетке есть несколько копий митохондриального генома. Детальное изучение механизмов, ответственных за репликацию, восстановление и поддержание митохондриального генома, имеет важное значение для понимания правильного функционирования митохондрий и целых клеток как в нормальных, так и в болезненных условиях. Здесь представлен метод, позволяющий с высокой пропускной способностью количественно определять синтез и распределение митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках человека, культивируемых in vitro . Этот подход основан на иммунофлуоресцентном обнаружении активно синтезируемых молекул ДНК, меченных включением 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU), и одновременном обнаружении всех молекул мтДНК с анти-ДНК-антителами. Кроме того, митохондрии визуализируются с помощью специфических красителей или антител. Культивирование клеток в многолуночном формате и использование автоматизированного флуоресцентного микроскопа облегчают изучение динамики мтДНК и морфологии митохондрий в различных экспериментальных условиях за относительно короткое время.
Введение
Для большинства эукариотических клеток митохондрии являются важными органеллами, поскольку они играют решающую роль во многих клеточных процессах. Прежде всего, митохондрии являются ключевыми поставщиками энергии для клеток1. Митохондрии также участвуют в регуляции клеточного гомеостаза (например, внутриклеточный окислительно-восстановительныйпотенциал 2 и кальциевый баланс3), клеточной сигнализации 4,5, апоптозе6, синтезе различных биохимических соединений 7,8 и врожд....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Приготовление смеси миРНК
- За день до начала эксперимента семенные клетки (например, HeLa) помещают в чашку диаметром 100 мм так, чтобы на следующий день они достигли слияния 70%-90%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции должны проводиться в стерильных условиях в ламинарной проточной камере. - Приготовьте соответствующее количество миРНК, разбавленной до концентрации 140 нМ в среде Opti-MEM (см. Таблицу материалов). В качестве резервуара можно использовать 96-луночную плиту.
- Добавьте 5 мкл раствора миРНК (или среды Opti-MEM для контрольных образцов) в каждую лунку черной 384-луночной микропланшетки для клеточной к....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Схема процедуры высокопроизводительного исследования динамики синтеза и распределения мтДНК представлена на рисунке 1. Использование многолуночного формата планшета позволяет одновременно анализировать множество различных экспериментальных условий, таких как сайленсинг различных генов с использованием библиотеки миРНК. Условия, используемые для мечения вновь синтезированных молекул ДНК BrdU, позволяют обнаруживать меченную BrdU ДНК в митохондриях клеток HeLa (рис. 2A
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Исторически сложилось так, что маркировка ДНК путем включения BrdU и обнаружения антител использовалась в репликации ядерной ДНК и исследованиях клеточного цикла 14,27,28. До сих пор все протоколы для обнаружения ДНК, меченной BrdU, включали стадию денатурации ДНК (кислую или термическую) или ферментное расщепление (ДНКазу или протеиназу) для обеспечения воздействия эпитопов и облегчения проникновения антител. Эти протоколы были.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным научным центром, Польша (номер гранта/премии: 2018/31/D/NZ2/03901).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2′,3′-Дидезоксицитидин (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, черный | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-дезоксиуридин (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Растворите порошок BrdU в воде до 20 мМ исходного раствора и аликвоты. Используйте 20 &микро; Решение M BrdU для маркировки. |
| Клейкая герметизирующая пленка | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 коза против мыши IgG1 вторичное антитело | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 козье антимышиное IgM вторичное антитело | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS микропластина шайба | Agilent | ||
| бычья сыворотка альбумин (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Камера для подсчета клеток Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Модифицированная среда Dulbecco's Eagle (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Раствор формальдегида | Sigma-Aldrich | F1635 | Формальдегид токсичен; пожалуйста, внимательно прочтите паспорт безопасности. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 мышиный моноклональный анти-BrdU (IIB5) первичный антитело | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM мышиный моноклональный анти-ДНК (AC-30-10) первичное антитело | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Реагент для трансфекции Thermo | Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Краситель для слежения за митохондриями |
| Многокапельный комбинированный дозатор реагентов | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD камера | Hamamatsu | ||
| Пенициллин-стрептомицин | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR праймер Fw B2M (референс) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| праймер для количественной ПЦР Fw GPI (референсный ген) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| праймер для количественной ПЦР Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| праймер для количественной ПЦР Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| праймер для количественной ПЦР FW TCAM | GATGAGTTGCCTGCTTTAT | ||
| праймер для количественной ПЦР Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| праймер для количественной ПЦР Rev B2M (референс) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| праймер для количественной ПЦР Rev GPI (референсный ген) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| праймер для количественной ПЦР Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| праймер для количественной ПЦР Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| праймер для количественной ПЦР праймер Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| праймер для количественной ПЦР праймер Rev TWNK | AACATTGTGTGCTTCCTGGC | ||
| Микроскоп ScanR | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| миРНК TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Аспиратор | NeoLab | 2-9335 | Аспиратор для клеточной культуры |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA объективный | Олимп |
Ссылки
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
