Методическая статья

Точный и поддающийся количественной оценке метод сбора гемолимфы у мелких членистоногих

DOI:

10.3791/65250

⸱

28 апреля 2023 г.

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2CAS Center for Excellence in Biotic Interactions, University of Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем метод эффективного сбора поддающейся количественной оценке гемолимфы у мелких членистоногих для последующего анализа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Известно, что членистоногие передают через свою гемолимфу различные вирусы, имеющие медицинское и сельскохозяйственное значение, что необходимо для передачи вируса. Сбор гемолимфы является базовой технологией изучения вирусно-векторных взаимодействий. Здесь мы описываем новый и простой метод количественного сбора гемолимфы у мелких членистоногих с использованием Laodelphax striatellus (маленький коричневый кузнечик, SBPH) в качестве исследовательской модели, поскольку это членистоногое является основным переносчиком вируса рисовой полосы (RSV). В этом протоколе процесс начинается с осторожного отщипывания одной ноги замороженного членистоногого пинцетом с тонким наконечником и выдавливания гемолимфы из раны. Затем простая микропипетка, состоящая из капилляра и колбы пипетки, используется для забора транссудативной гемолимфы из раны по принципу капиллярных сил. Наконец, собранная гемолимфа может быть растворена в определенном буфере для дальнейшего изучения. Этот новый метод сбора гемолимфы у мелких членистоногих является полезным и эффективным инструментом для дальнейших исследований арбовирусов и векторно-вирусных взаимодействий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как животные, так и растительные вирусы могут передаваться членистоногими, и эти вирусы представляют серьезную угрозу для здоровья человека и наносят огромные экономические потери в сельском хозяйстве 1,2,3. Важно отметить, что членистоногая гемолимфа, которая служит кровеносной системой и жизненно важным элементом иммунной системы у членистоногих, играет важную роль в регуляции арбовирусной передачи. Вирусы, приобретенные через кишечник членистоногих, транспортируются в другие ткани только после успешного выхода из неблагоприятной среды гемолимфы 4,5,....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выращивание насекомых

  1. Поднимите SBPH, используемые в этом эксперименте, на проростках риса (Oryza sativa cv. Nipponbare). Посадите 20 саженцев риса в инкубатор (65 мм x 200 мм) и выращивайте при температуре 25 °C при 16-часовом светлом / 8-часовом темном фотопериоде.

2. Вскрытие SBPH для забора гемолимфы

  1. Поместите SBPH в центрифужную пробирку и поместите их на ледяную баню на 10-30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не помещайте SBPH в ледяную ванну менее чем на 10 минут, иначе насекомые могут оживиться.
  2. Поместите замороженный SBPH на предметное стекло (см. Таблицу....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модель микропипетки и коллекция гемолимф
Мы разработали простую микропипетку, действие которой основано на капиллярных силах капиллярной трубки. Микропипетка состоит из капиллярной трубки и колбы пипетки (рис. 1А). Капиллярные трубки доступны в различных объемных размерах от 1 мкл до 20 мкл, а объемы капиллярных трубок выбираются в соответствии с требованиями. Капиллярные трубки с меньшими объемами не рекомендуются, потому что сверхтонкие отверстия трубок меньшего объема .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гемолимфа является средой кровеносной системы у членистоногих, и арбовирусы могут проникать в другие ткани членистоногих только в том случае, если они способны выжить во враждебной среде гемолимфы. Сбор высококачественного образца гемолимфы является первым шагом в изучении векторно-вирусных взаимодействий, происходящих в гемолимфе. Сообщалось, что гемолимфа насекомого может быть получена из нескольких участков на теле насекомого, включая рану на передней ноге, незначительный разрез в области головы или слезную рану на жи.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (No 2022YFD1401700) и Национальным научным фондом Китая (No 32090013 и No 32072385).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% SDS-PAGE протеиновый гельBio-rad4561035Разделение и обнаружение белка
4% параформальдегидSolarbioP1110Для фиксации клеток или тканей...
Реактив красителя BradfordBio-rad5000205Определение концентрации белка
КапиллярHirschmann9000101Для сбора гемолимфы
Камера для подсчета клетокACMECAYA0810Подсчет гемоцитов
Предметное стеклоGitoglas10127105AДля удержания насекомых
Стеклянное стекло с покрытием силаномSigmaS4651-72EAДля хранения образцов микроскопа
Золотой реагент против выцветания с DAPIInvitrogenP36935Окрашивание ядра
Крышка микроскопаGitoglas10212424CДля микроскопического наблюдения
ПипеткаPirschmann9000101Для сбора гемолимфы
Prism 8.0 Программное обеспечениеGraphPad Software/Statistical analyses
Стереомикроскоп MoticSMZ-168Для препарирования насекомых
ПинцетTianldP5622Для препарирования насекомых
Инвертированный микроскоп ZeissZeiss ZeissObserver Z1Наблюдение за гемоцитами

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  2. Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SDS PAGE

Похожие статьи