Method Article

Точный и поддающийся количественной оценке метод сбора гемолимфы у мелких членистоногих

DOI:

10.3791/65250

⸱

April 28th, 2023

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2CAS Center for Excellence in Biotic Interactions, University of Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем метод эффективного сбора поддающейся количественной оценке гемолимфы у мелких членистоногих для последующего анализа.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Известно, что членистоногие передают через свою гемолимфу различные вирусы, имеющие медицинское и сельскохозяйственное значение, что необходимо для передачи вируса. Сбор гемолимфы является базовой технологией изучения вирусно-векторных взаимодействий. Здесь мы описываем новый и простой метод количественного сбора гемолимфы у мелких членистоногих с использованием Laodelphax striatellus (маленький коричневый кузнечик, SBPH) в качестве исследовательской модели, поскольку это членистоногое является основным переносчиком вируса рисовой полосы (RSV). В этом протоколе процесс начинается с осторожного отщипывания одной ноги замороженного членистоногого пинцетом с тонким наконечником и выдавливания гемолимфы из раны. Затем простая микропипетка, состоящая из капилляра и колбы пипетки, используется для забора транссудативной гемолимфы из раны по принципу капиллярных сил. Наконец, собранная гемолимфа может быть растворена в определенном буфере для дальнейшего изучения. Этот новый метод сбора гемолимфы у мелких членистоногих является полезным и эффективным инструментом для дальнейших исследований арбовирусов и векторно-вирусных взаимодействий.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как животные, так и растительные вирусы могут передаваться членистоногими, и эти вирусы представляют серьезную угрозу для здоровья человека и наносят огромные экономические потери в сельском хозяйстве 1,2,3. Важно отметить, что членистоногая гемолимфа, которая служит кровеносной системой и жизненно важным элементом иммунной системы у членистоногих, играет важную роль в регуляции арбовирусной передачи. Вирусы, приобретенные через кишечник членистоногих, транспортируются в другие ткани только после успешного выхода из неблагоприятной среды гемолимфы 4,5,6,7. Жизненный цикл вирусов в гемолимфе членистоногих включает выживание вируса в жидкой плазме, проникновение в гемоцит и транспорт в другие ткани, а в гемолимфе 8,9,10,11,12 возникают различные механизмы взаимодействия вируса и вектора. Например, вертикальная передача RSV SBPH зависит от молекулярного взаимодействия между белком вителлогенина SBPH и белком капсида RSV (вирус рисовой полосы)13,14. Некоторые вирусы могут избегать иммунного ответа гемолимфы путем связывания специфических векторных факторов15,16,17,18. Таким образом, исследование трансмиссионно-вирусных взаимодействий в гемолимфе членистоногих важно для лучшего понимания передачи арбовирусов.

Гемолимфу некоторых мелких насекомых, таких как кузнечики, цикадки и некоторые комары, трудно собрать из-за их размера. Для решения этой проблемы было разработано несколько методов сбора гемолимфы, в том числе введение иглы шприца непосредственно в тело насекомого для извлечения микрообъема гемолимфы, сбор экссудата из места раны пинцетом с тонким наконечником и прямое центрифугирование. Эти методы позволили измерить относительные уровни экспрессии генов и титры вируса в пределах гемолимфы 19,20,21. Однако эффективный метод количественной оценки объема гемолимфы, который необходим для подсчета гемоцитов, количественного определения белка и анализа активности ферментов, в настоящее время недоступен для этих мелких насекомых.

SBPH (маленький коричневый кузнечик) - это тип мелкого насекомого-переносчика с длиной тела около 2-4 мм. SBPH способен передавать различные вирусы растений, включая RSV, вирус шероховатого карлика кукурузы и вирус карликового риса с черными полосами22,23,24. Взаимодействие между SBPH и RSV было глубоко изучено в течение последнего десятилетия. Чтобы облегчить работу с SBPH, мы разработали новый и простой метод сбора гемолимфы. Этот метод, основанный на принципе капиллярных сил, использует капилляр со шкалой для получения гемолимфы насекомого точным и поддающимся количественной оценке образом. Это позволяет эффективно собирать определенный объем гемолимфы из мелких насекомых и более детально изучать среду гемолимфы мелких переносчиков.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выращивание насекомых

  1. Поднимите SBPH, используемые в этом эксперименте, на проростках риса (Oryza sativa cv. Nipponbare). Посадите 20 саженцев риса в инкубатор (65 мм x 200 мм) и выращивайте при температуре 25 °C при 16-часовом светлом / 8-часовом темном фотопериоде.

2. Вскрытие SBPH для забора гемолимфы

  1. Поместите SBPH в центрифужную пробирку и поместите их на ледяную баню на 10-30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не помещайте SBPH в ледяную ванну менее чем на 10 минут, иначе насекомые могут оживиться.
  2. Поместите замороженный SBPH на предметное стекло (см. Таблицу материалов) под стереомикроскопом (см. Таблицу материалов) брюшком вверх. Отрегулируйте фокусировку на шести лапках насекомого.
  3. Подготовьте два высокоточных пинцета (см. Таблицу материалов) с ультратонкими наконечниками. Одним пинцетом надавите на тело насекомого, чтобы удержать его на месте, а другим осторожно оторвите одну из ног от насекомого.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для насекомых с твердым панцирем можно использовать офтальмологический скальпель для отсечения одной из ног.
  4. Аккуратно прижмите грудную клетку насекомого пинцетом, чтобы гемолимфа вытекла через ранку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гемолимфа представляет собой прозрачные капли без видимых белых пузырьков. Откажитесь от липидов, если есть какие-либо белые хлопья, которые представляют собой загрязнение жировых тел.

3. Забор гемолимфы с помощью микропипеток

  1. Подготовьте микропипетку. Поместите капиллярную трубку (см. Таблицу материалов) объемом 1 мкл в колбу пипетки (см. Таблицу материалов). Для точных измерений убедитесь, что линия шкалы видна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо небольшое отверстие в верхней части колбы пипетки.
  2. При заборе гемолимфы держите колбу микропипетки и поместите капиллярную трубку близко к ране насекомого. Собрать гемолимфу, выделяющуюся из раны, можно, просто прикоснувшись кончиком капилляра к гемолимфе.
  3. Слегка заблокируйте пальцем маленькое отверстие в верхней части колбы пипетки, чтобы остановить процесс впитывания, когда жидкость внутри капиллярной трубки достигнет желаемой линии шкалы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывно и быстро собирайте один образец из 1 мкл гемолимфы, чтобы избежать загрязнения липидами и закупоривания пробирок.
  4. Нажмите на колбу пипетки, чтобы выгрузить собранную гемолимфу в 100 мкл буфера PBS (137 ммоль / л NaCI, 2,7 ммоль / л KCI, 4,3 ммоль / л Na 2 HPO 4, 1,4 ммоль / л KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Капиллярная трубка вставляется в буфер PBS.
  5. Переход на новую капиллярную трубку при сборе еще 1 мкл образца гемолимфы.

4. Окрашивание Coomassie Blue

  1. Соберите 3 образца гемолимфы с одинаковым объемом (1 мкл) у личинок 3-й стадии в соответствии с протоколами, описанными на шаге 3, и выгрузите собранную гемолимфу в буфер PBS, чтобы получить общий объем 100 мкл.
  2. Добавьте 25 мкл 5-кратного буфера загрузки белка (250 ммоль / л трис-HCI [pH 6,8], 10% W/V SDS, 0,05% мас./об. бромфенолового синего, 50% мас./об. глицерина, 5% мас./об. β-меркаптоэтанола) в 100 мкл разбавленных образцов гемолимфы и нагрейте для денатурации белков.
  3. Загрузите 20 мкл кипяченых образцов в 10% белковый гель SDS-PAGE (см. Таблицу материалов) для разделения белков.
  4. Окрашивают гель в растворе Coomassie Blue (смешайте 1 г Coomassie Brilliant Blue R-250 с 250 мл изопропанола, 100 мл ледяной уксусной кислоты и 650 мл ddH2O и отфильтруйте любые частицы с помощью фильтровальной бумаги) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем обесцвечивайте гель в течение 1 ч обесцвечивающим раствором (100 мл уксусной кислоты, 400 мл метанола, 500 млddH2O).

5. Определение концентрации белка

  1. Разбавьте 10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) до 5 мг/мл, 2,5 мг/мл, 1,25 мг/мл, 0,625 мг/мл и 0,3125 мг/мл буфером PBS, используя метод двукратного разведения.
  2. Аспирируют 5 мкл буфера PBS и каждую концентрацию растворов BSA на этапе 5.1, добавляют 1 мл 1x реагента красителя Брэдфорда (см. Таблицу материалов) и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Используйте буфер PBS в реагенте красителя Брэдфорда в качестве контроля и ноль при OD = 595 нм. Измерьте значения поглощения каждой из оставшихся концентраций белка и составьте стандартную кривую.
  3. Добавьте 1 мкл гемолимфы из личиночных, женских или мужских SBPH в 100 мкл буфера PBS, а затем центрифуфицируйте образцы при 1000 x g в течение 10 мин при 4 ° C для удаления гемоцитов.
  4. Аспирируйте 90 мкл надосадочной жидкости в новую центрифужную пробирку и измерьте значения поглощения надосадочной жидкости в соответствии с инструкциями на шаге 5.2.
  5. Рассчитайте концентрации белка образцов гемолимфы в соответствии с уравнением регрессии стандартной кривой. Включите в эксперименты три биологические реплики с тремя техническими репликами.

6. Микроскопические обнаружения

  1. Используйте микропипетки для забора гемолимфы из 10-15 ДГПЖ на разных стадиях развития. Собранную гемолимфу добавить в пробирку, содержащую 20 мкл 4% раствора параформальдегида (см. Таблицу материалов). Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 30 минут для фиксации гемолимфы.
  2. Пипетка 20 мкл фиксированных гемоцитов на центр предметного стекла, покрытого силаном (см. Таблицу материалов).
  3. Высушите каплю в скользящей сушилке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерной сушки.
  4. Накройте образец золотым антибактериальным реагентом 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (см. Таблицу материалов) и осмотрите предметное стекло под инвертированным микроскопом (см. Таблицу материалов).

7. Количественная оценка клеток

  1. Соберите 1 мкл гемолимфы из SBPH с помощью микропипетки и растворите его в 20 мкл буфера PBS.
  2. Разбавьте образцы гемолимфы в пять раз буфером PBS.
  3. Пипеткой вводят 20 мкл раствора гемолимфы в центр камеры подсчета клеток (см. Таблицу материалов). Накройте каплю покровным стеклом (см. Таблицу материалов).
  4. Подсчитайте клетки в пяти квадратах в счетной камере (дополнительный рисунок 1) под перевернутым микроскопом (см. Таблицу материалов). Включите три биологические реплики с тремя техническими репликами в каждый из экспериментов.
    Ячейки/мкл = общее количество пяти средних квадратов × 5 × коэффициент разбавления × 104

8. Статистический анализ

  1. Выполните статистический анализ с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов). Создайте новый файл, выберите столбец, импортируйте данные и создайте точечную диаграмму с гистограммой.
  2. Рассчитайте среднее значение и SD для каждой группы данных с помощью статистики столбцов и используйте односторонний инструмент ANOVA для оценки значимости различий между группами. Определите среднее значение и SD из трех биологических реплик с помощью трех независимых экспериментов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модель микропипетки и коллекция гемолимф
Мы разработали простую микропипетку, действие которой основано на капиллярных силах капиллярной трубки. Микропипетка состоит из капиллярной трубки и колбы пипетки (рис. 1А). Капиллярные трубки доступны в различных объемных размерах от 1 мкл до 20 мкл, а объемы капиллярных трубок выбираются в соответствии с требованиями. Капиллярные трубки с меньшими объемами не рекомендуются, потому что сверхтонкие отверстия трубок меньшего объема ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гемолимфа является средой кровеносной системы у членистоногих, и арбовирусы могут проникать в другие ткани членистоногих только в том случае, если они способны выжить во враждебной среде гемолимфы. Сбор высококачественного образца гемолимфы является первым шагом в изучении векторно-вирусных взаимодействий, происходящих в гемолимфе. Сообщалось, что гемолимфа насекомого может быть получена из нескольких участков на теле насекомого, включая рану на передней ноге, незначительный разрез в области головы или слезную рану на жи...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (No 2022YFD1401700) и Национальным научным фондом Китая (No 32090013 и No 32072385).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% SDS-PAGE протеиновый гельBio-rad4561035Разделение и обнаружение белка
4% параформальдегидSolarbioP1110Для фиксации клеток или тканей...
Реактив красителя BradfordBio-rad5000205Определение концентрации белка
КапиллярHirschmann9000101Для сбора гемолимфы
Камера для подсчета клетокACMECAYA0810Подсчет гемоцитов
Предметное стеклоGitoglas10127105AДля удержания насекомых
Стеклянное стекло с покрытием силаномSigmaS4651-72EAДля хранения образцов микроскопа
Золотой реагент против выцветания с DAPIInvitrogenP36935Окрашивание ядра
Крышка микроскопаGitoglas10212424CДля микроскопического наблюдения
ПипеткаPirschmann9000101Для сбора гемолимфы
Prism 8.0 Программное обеспечениеGraphPad Software/Statistical analyses
Стереомикроскоп MoticSMZ-168Для препарирования насекомых
ПинцетTianldP5622Для препарирования насекомых
Инвертированный микроскоп ZeissZeiss ZeissObserver Z1Наблюдение за гемоцитами

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  2. Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).
  3. Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044(2020).
  4. Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
  5. Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
  6. Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
  7. Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
  8. Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600(2021).
  9. Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
  10. Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
  11. Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
  12. Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222(2022).
  13. Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949(2014).
  14. Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
  15. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
  16. Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
  17. Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
  18. Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860(2018).
  19. Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
  20. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909(2018).
  21. Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453(2020).
  22. Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
  23. Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
  24. Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576(2021).
  25. Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
  26. Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637(2020).
  27. Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493(2022).
  28. Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570(2022).
  29. Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894(2012).
  30. Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
  31. Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hemolymph CollectionSmall ArthropodsVirus Vector InteractionsArbovirus TransmissionCapillary MicropipetteSmall Brown PlanthopperStereo MicroscopeProtein QuantificationHemocyte AnalysisSDS PAGE

Related Articles