Методическая статья

Псевдоостровковая система человека для синхронной оценки динамики флуоресцентных биосенсоров и секреторных профилей гормонов

DOI:

10.3791/65259

⸱

3 ноября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 2Division of Diabetes, Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 4VA Tennessee Valley Healthcare System

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описан метод синхронного сбора и совместной регистрации внутриклеточных сигнальных событий и секреции инсулина и глюкагона первичными псевдоостровками человека с использованием аденовирусной доставки циклического биосенсора аденозинмонофосфата (цАМФ), детектора разности цАМФ in situ (cADDis) и микроперифузионной системы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Островки поджелудочной железы Лангерганса, представляющие собой небольшие 3D-скопления специализированных эндокринных и поддерживающих клеток, разбросанных по всей поджелудочной железе, играют центральную роль в контроле гомеостаза глюкозы через секрецию инсулина бета-клетками, что снижает уровень глюкозы в крови, и глюкагона альфа-клетками, что повышает уровень глюкозы в крови. Внутриклеточные сигнальные пути, в том числе опосредованные цАМФ, являются ключевыми для регулируемой секреции альфа- и бета-клеточных гормонов. Трехмерная структура островков, хотя и имеет важное значение для скоординированной функции островков, представляет собой экспериментальную проблему для механистических исследований внутриклеточных сигнальных путей в первичных островковых клетках человека. Для преодоления этих проблем и ограничений в данном протоколе описывается интегрированная визуализация живых клеток и микрофлюидная платформа с использованием первичных псевдоостровков человека, полученных от доноров без диабета, которые по своей морфологии, составу и функциям напоминают нативные островки. Размер этих псевдоостровков контролируется с помощью процесса диспергирования и реагрегации первичных островковых клеток человека. В дисперсном состоянии можно манипулировать экспрессией генов островковых клеток; Например, могут быть введены такие биосенсоры, как генетически кодируемый биосенсор цАМФ, cADDis. После образования псевдоостровки, экспрессирующие генетически кодируемый биосенсор, в сочетании с конфокальной микроскопией и микроперифузионной платформой позволяют синхронно оценивать динамику флуоресцентных биосенсоров и секреторные профили альфа- и бета-клеточных гормонов, чтобы обеспечить более глубокое понимание клеточных процессов и функций.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Островки Лангерганса – это мини-органы, разбросанные по всей поджелудочной железе, функция которых имеет решающее значение для поддержания гомеостаза глюкозы. Инсулин секретируется из бета-клеток вслед за метаболизмом глюкозы, увеличением соотношения АТФ/АДФ, закрытием АТФ-чувствительных калиевых каналов, деполяризацией плазматической мембраны и притоком внеклеточного кальция1. Секреция глюкагона альфа-клетками менее изучена, но было постулировано, что внутриклеточные и паракринные пути способствуют экзоцитозу глюкагоновых гранул 2,3,4. Диабет 1 и 2 ти....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Островки человека (N = 4 препарата) были получены благодаря партнерству с Комплексной программой распределения островков, Программой анализа поджелудочной железы человека, Prodo Laboratories, Inc. и Imagine Pharma. Институциональный наблюдательный совет Университета Вандербильта не рассматривает обезличенные образцы поджелудочной железы человека в качестве исследования на людях. Эта работа была бы невозможна без доноров органов, их семей и организаций, занимающихся закупкой органов. Демографическая информация о донорах приведена в таблице 1 . Островки человека от доноров поджелудочной железы без диабета были выделены менее чем за 15 ч времени холодной....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Псевдоостровки человека, экспрессирующие биосенсоры, были созданы путем аденовирусной доставки конструкций, кодирующих биосенсор цАМФ cADDis (рис. 1А). На рисунке 1B показана реагрегация трансдуцированных островковых клеток человека с течением времени, при этом полностью сформированные псевдоостровки наблюдаются через 6 дней культивирования. Клетки начали проявлять видимую флуоресценцию cADDis в течение 48 ч, а к концу периода культивирования в трансдуц.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интеграция микроперифузионной системы, псевдоостровков, экспрессирующих биосенсоры, и лазерно-сканирующей конфокальной микроскопии позволяет синхронно оценивать внутриклеточные сигнальные события и динамические секреторные профили гормонов. Динамическая микроперифузионная система может доставлять серию четко определенных стимулов к псевдоостровкам и позволяет собирать сточные воды, в которых концентрации инсулина и глюкагона могут быть измерены с помощью коммерчески доступного ИФА. В то же время, визуализация псевдоостро.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Доноры органов и их семьи высоко ценятся за их бесценные пожертвования, а Международный институт организаций по закупке органов, развитию медицины (IIAM) и Национальный обмен исследованиями заболеваний (NDRI) получают признание за их партнерство в обеспечении доступности тканей поджелудочной железы человека для исследований. Эта работа была поддержана Исследовательской сетью островков человека (RRID:SCR_014393), Программой анализа поджелудочной железы человека (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 и DK20593 (Научно-исследовательский и учебный центр диабета Вандербильта), Благотворительным ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ad-CMV-cADDisWelgenНе применимо
  0.01" Трубка FEPIDEX1527L
1 м HEPESGibco15630-080Обогащенный CMRL Компонент среды
1,5 мл и конические трубкиAnyAny
10 μ m Фильтр из ПТФЭCole-ParmerSK-21940-41Менять каждые 8-10 прогонов
100 мМ Пируват натрияThermo Scientific11360070Обогащенный-CMRL Медиа Компонент
190 пруф ЭтанолDecon labs2816Кислотный этанол Компонент
200 мМ GlutaMAX-I ДобавкаGibco35050061обогащенный CMRL Медиа компонент
АскорбатСигмаA5960DMEM Компонент перифузионного буфера
Бычья сыворотка АльбуминСигмаA7888DMEM Компонент перифузионного буфера
Пузырьковая ловушка Omnifit006BT
CellCarrier ULA  96-луночные микропланшетыPerkin Elmer6055330
программное обеспечение для анализа cellSensOlympusv3.1Программное обеспечение для анализа данных
CMRL 1066MediaTech 15-110-CVОбогащенный CMRL конический
адаптер (IDEX, P-794)IDEXP-794
D-(+)-глюкозныйбуферный компонентSigmaG7528
DMEM SigmaD5030DMEM Перифузионный буферный компонент
Экологическая камераokolabIX83
Эпинеферин (Эпи)SigmaE4250Стимулирующий буферный компонент Фетальная
бычья сыворотка (FBS), термоинактивированнаяSigma12306CОбогащенный CMRL медиакомпонент
Глюкагон ELISAMercodia10-1281-01
Набор глюкагона HTRFCisbio62CGLPEH
HCl (12N)Любаякислота Этаноловый компонент
HEPESSigmaH7523DMEM Перифузионный буферный компонент
iCell эндотелиальные клетки Средняя добавкаклеточная динамикаM1019iEC Медиа компонент
Idex Derlin орех и наконечник 1/4-24Cole-ParmerEW-00414-LW
Инсулин ИФАMercodia10-1113-01
Изобутилметилонин (IBMX)SigmaI5879Стимулирующий буферный компонент
Лазерный сканирующий конфокальный микроскопOlympusFV3000
L-глутаминSigmaG8540DMEM Перифузионный буферный компонент
Микрочип (Университет Майами, FP-3W)Университет МайамиFP-3W
Держатель микрочипов Micronit MicrofluidicsFC_PRO_CH4525
Модель 2110 Коллектор фракцийBiorad7318122
пипетками и наконечниками P10, P200 и P1000Любой
пенициллин/стрептомицинGibco15140-122Обогащенный компонент среды CMRL
Перистальтический насос InstechP720
Фосфат Буферный ФизрастворGibco14190-144Промыть островки
Сарстедт Посуда Сарстедтзависит от диаметра
Бикарбонат натрияSigmaS6014DMEM Перифузионный буферный компонент
Пируват натрияSigmaP2256  DMEM Перифузионный буферный компонентный
стереоскопOlympusSZX12
Steriflip Filter (0,22 μ m)MilliporeSCGP00525Фильтрация всех буферов дважды
VascuLife VEGF Medium Complete KitLifeLine Cell TechnologyLL-0003iEC Медиа Компонент
посуды

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
  2. Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alph....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи