Методическая статья

Псевдоостровковая система человека для синхронной оценки динамики флуоресцентных биосенсоров и секреторных профилей гормонов

DOI:

10.3791/65259

⸱

3 ноября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 2Division of Diabetes, Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 4VA Tennessee Valley Healthcare System

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описан метод синхронного сбора и совместной регистрации внутриклеточных сигнальных событий и секреции инсулина и глюкагона первичными псевдоостровками человека с использованием аденовирусной доставки циклического биосенсора аденозинмонофосфата (цАМФ), детектора разности цАМФ in situ (cADDis) и микроперифузионной системы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Островки поджелудочной железы Лангерганса, представляющие собой небольшие 3D-скопления специализированных эндокринных и поддерживающих клеток, разбросанных по всей поджелудочной железе, играют центральную роль в контроле гомеостаза глюкозы через секрецию инсулина бета-клетками, что снижает уровень глюкозы в крови, и глюкагона альфа-клетками, что повышает уровень глюкозы в крови. Внутриклеточные сигнальные пути, в том числе опосредованные цАМФ, являются ключевыми для регулируемой секреции альфа- и бета-клеточных гормонов. Трехмерная структура островков, хотя и имеет важное значение для скоординированной функции островков, представляет собой экспериментальную проблему для механистических исследований внутриклеточных сигнальных путей в первичных островковых клетках человека. Для преодоления этих проблем и ограничений в данном протоколе описывается интегрированная визуализация живых клеток и микрофлюидная платформа с использованием первичных псевдоостровков человека, полученных от доноров без диабета, которые по своей морфологии, составу и функциям напоминают нативные островки. Размер этих псевдоостровков контролируется с помощью процесса диспергирования и реагрегации первичных островковых клеток человека. В дисперсном состоянии можно манипулировать экспрессией генов островковых клеток; Например, могут быть введены такие биосенсоры, как генетически кодируемый биосенсор цАМФ, cADDis. После образования псевдоостровки, экспрессирующие генетически кодируемый биосенсор, в сочетании с конфокальной микроскопией и микроперифузионной платформой позволяют синхронно оценивать динамику флуоресцентных биосенсоров и секреторные профили альфа- и бета-клеточных гормонов, чтобы обеспечить более глубокое понимание клеточных процессов и функций.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Островки Лангерганса – это мини-органы, разбросанные по всей поджелудочной железе, функция которых имеет решающее значение для поддержания гомеостаза глюкозы. Инсулин секретируется из бета-клеток вслед за метаболизмом глюкозы, увеличением соотношения АТФ/АДФ, закрытием АТФ-чувствительных калиевых каналов, деполяризацией плазматической мембраны и притоком внеклеточного кальция1. Секреция глюкагона альфа-клетками менее изучена, но было постулировано, что внутриклеточные и паракринные пути способствуют экзоцитозу глюкагоновых гранул 2,3,4. Диабет 1 и 2 типа связаны с дисфункцией островковых клеток 5,6,7. Таким образом, выяснение внутриклеточных сигнальных путей, опосредующих секрецию островкового гормона, имеет важное значение для понимания физиологических и патологических механизмов островков поджелудочной железы.

Сферическая архитектура островков представляет определенные препятствия для экспериментов. Эти проблемы включают в себя изменчивость размеров островков и 3D-природу островков, которая снижает вирусную трансдукцию в ядре островка 8,9. Для преодоления этих проблем была разработана система псевдоостровков, в которой первичные островки человека рассредоточены по отдельным клеткам, аденовиридно трансдуцированы с помощью конструкций, кодирующих интересующие нас мишени, и реагрегированы с образованием островковых структур с контролируемым размером, называемых псевдоостровками7. По сравнению с нативными островками того же донора, которые культивировались параллельно, эти псевдоостровки сходны по морфологии, составу эндокринных клеток и секреции гормонов7. Этот метод позволяет экспрессировать конструкты по всему псевдоостровку, что означает, что он преодолевает предыдущий барьер для единообразных генетических манипуляций первичными человеческими островками 7,8,9.

В этом протоколе система псевдоостровков интегрирована с микрофлюидным устройством для экспрессии биосенсоров в первичных островковых клетках человека и получения временного разрешения секреции гормона псевдоостровков во время динамической перифузии10,11,12. Псевдоостровки помещают в микрочип и подвергают постоянному потоку различных секретагогов через перистальтический насос12. Микрочип имеет прозрачное стеклянное дно и устанавливается на конфокальный микроскоп для регистрации динамики внутриклеточной сигнализации через изменение интенсивности флуоресценции биосенсора. Биосенсорная визуализация синхронизируется со сбором микроперифузионных стоков для последующего анализа секреции инсулина и глюкагона7. По сравнению с макроперифузией, этот микроперифузионный подход позволяет использовать меньшее количество псевдоостровков из-за меньшего объема микрофлюидного устройства по сравнению с макроперифузионной камерой7.

Чтобы использовать полезность этой системы, биосенсор циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) дифференциальный детектор in situ (cADDis) был экспрессирован в псевдоостровках человека для оценки динамики цАМФ и секреции гормонов. Биосенсор cADDis состоит из циркулярно перестановленного зеленого флуоресцентного белка (cpGFP), расположенного в шарнирной области обменного белка, активируемого цАМФ2 (EPAC2), соединяя его регуляторную и каталитическую области. Связывание цАМФ с регуляторной областью EPAC2 вызывает конформационное изменение в шарнирной области, которое увеличивает флуоресценцию от cpGFP13. Внутриклеточные мессенджеры, такие как цАМФ, вызывают секрецию инсулина и глюкагона после активации рецепторов, связанных с G-белком14. Визуализация живых клеток в сочетании с микроперифузией помогает связать внутриклеточную динамику цАМФ с секрецией островкового гормона. В частности, в этом протоколе генерируются псевдоостровки, экспрессирующие cADDis, для мониторинга ответов цАМФ в альфа- и бета-клетках на различные стимулы: низкий уровень глюкозы (2 мМ глюкозы; G 2), высокое содержание глюкозы в сочетании с изобутилметилксантином (IBMX; 20 мМ глюкозы + 100 мкМ IBMX; G 20 + IBMX) и низкий уровень глюкозы плюс адреналин (Epi; 2 мМ глюкозы + 1 мкМ Epi; Г2 + Эпи). Этот рабочий процесс лечения позволяет оценить внутриклеточную динамику цАМФ непосредственно с помощью : 1) IBMX-опосредованного ингибирования фосфодиэстеразы, которое повышает внутриклеточный уровень цАМФ, предотвращая его деградацию, и 2) адреналина, известного цАМФ-зависимого стимулятора секреции альфа-клеточного глюкагона, опосредованного активацией β-адренергических рецепторов. Ниже подробно описаны этапы настройки микроперифузионного аппарата для экспериментов по визуализации живых клеток, загрузка псевдоостровков в микрочип, синхронная визуализация живых клеток и микроперифузия, а также анализ следов биосенсора и секреции гормонов с помощью гормональных анализов на основе микропланшетов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Островки человека (N = 4 препарата) были получены благодаря партнерству с Комплексной программой распределения островков, Программой анализа поджелудочной железы человека, Prodo Laboratories, Inc. и Imagine Pharma. Институциональный наблюдательный совет Университета Вандербильта не рассматривает обезличенные образцы поджелудочной железы человека в качестве исследования на людях. Эта работа была бы невозможна без доноров органов, их семей и организаций, занимающихся закупкой органов. Демографическая информация о донорах приведена в таблице 1 . Островки человека от доноров поджелудочной железы без диабета были выделены менее чем за 15 ч времени холодной ишемии.

1. Образование псевдоостровков (подробно описано в Walker et al.7)

  1. С помощью пипетки P200 и настольного микроскопа получают и вручную отбирают первичные островки человека, обращая особое внимание на то, чтобы не загрязнить наконечник пипетки на каких-либо поверхностях за пределами островковой питательной среды (10% FBS, стрептомицин 100 мкг/мл, пенициллин 100 ед/мл, L-глютамин 2 мМ в CMRL 1066).
  2. Перенесите первичные островки в пробирку объемом 15 мл и выполните все следующие этапы формирования псевдоостровков под колпаком для культуры тканей, чтобы предотвратить контаминацию. Медленно диссоциируют первичные островки в течение 7 мин при комнатной температуре пипеткой P1000 с 0,025% трипсином. Раствор станет непрозрачным, когда островки начнут распадаться.
    1. Для этих исследований 200-300 отобранных вручную первичных островков диаметром около 200 мкм, диспергированных в 500 мкл 0,025% трипсина, дают от одного до двух 96-луночных планшетов псевдоостровков; Точное количество может варьироваться в зависимости от среднего размера островка и жизнеспособности. Для >500 первичных островков увеличьте объем 0,025% трипсина, используемого в соотношении 1:1 (например, 600 мкл 0,025% трипсина для 600 островков, отобранных вручную).
  3. Погасите дисперсию, добавив объем псевдоостровковой среды Вандербильта (VPM), эквивалентный объему используемого трипсина. Затем промойте два раза 1 мл VPM. Для промывки центрифугируют дисперсные ячейки при 485 x g в течение 2-3 мин при 4 °C в настольной центрифуге. Ресуспендируйте клетки в определенном объеме VPM (обычно 1 мл) для подсчета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Генерация псевдоостровков и состав VPM подробно описаны в предыдущей публикации7. Вкратце, VPM содержит равные объемы обогащенных CMRL-сред (20% FBS, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ЕД/мл пенициллина, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глутамакса, 2 мМ HEPES в CMRL 1066) и iEC-среды (VEGF Medium Complete Kit минус FBS + 1 флакон добавки Endothelial Cells Medium Supplement). Сводная схема генерации псевдоостровков приведена на рисунке 1A.
  4. Определите количество клеток и их жизнеспособность с помощью автоматического счетчика клеток, смешав 10 мкл трипанового синего с 10 мкл клеточной суспензии. Хорошо перемешайте клеточную суспензию, чтобы обеспечить точное количество клеток.
  5. Рассчитайте объем клеточной суспензии, вируса и ВПМ, необходимый для нужного количества псевдоостровков. Основывайте все вычисления на количестве живых клеток, полученных на шаге 1.4.
    1. Для этих исследований трансдуцируют дисперсные островковые клетки человека при MOI 500 (N = 1) или 1000 (N = 2) с Ad-CMV-cADDis в общем объеме 500 мкл. Одна пластина трансдуцированных псевдоостровков (2000 клеток/псевдоостровок) дает три технических репликата на донора (32 псевдоостровка на эксперимент). Аденовирус был коммерчески получен в этой работе.
  6. Смешайте рассчитанное количество клеточной суспензии, вируса и VPM в пробирку объемом 1,5 мл. Аккуратно перемешайте содержимое, пипетируя вверх и вниз.
  7. Во время трансдукции инкубируют пробирки с открытыми крышками и накрывают их стерильной чашкой Петри в течение 2 ч в инкубаторе для тканевых культур при 37 °С и 5% СО2/95% воздуха.
  8. Добавьте 500 мкл VPM в каждую пробирку и промойте ячейки, центрифугируя их при 500 x g в течение 3 минут при 4 °C. Выполните еще две стирки, в общей сложности три стирки. Отсасывайте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл ВПМ.
  9. Рассчитайте общий объем засева клеток (200 мкл/псевдоостровок). Добавьте VPM (расчетный объем посева клеток минус 2 мл) в коническую пробирку соответствующего размера. Добавьте суспензию трансдуцированных клеток из шага 1.7 в коническую трубку. Держите коническую трубку слегка закрытой, но не плотно закрытой, чтобы обеспечить воздухообмен для ячеек.
  10. Промойте пробирку объемом 1,5 мл (начиная с шага 1.7) 1 мл VPM и перелейте содержимое в коническую пробирку, после чего коническая пробирка должна содержать общий объем затравки клеток.
  11. Хорошо перемешайте содержимое конической пробирки, пипетируя вверх и вниз с помощью моторизованной серологической пипетки, а затем перенесите содержимое в стерильный резервуар для реагентов. Если резервуар не вмещает весь объем семян клеток, выполняйте последовательные переносы и следите за тем, чтобы суспензия хорошо перемешивалась на каждом этапе.
  12. Используя многоканальную пипетку P200, пропиточную суспензию клеток в резервуаре с реагентом вверх и вниз 3-4 раза для обеспечения однородности, а затем влить 200 мкл клеточной суспензии в каждую лунку планшетов микролунок.
  13. Инкубируют псевдоостровки в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 °C и 5% CO2/95% воздуха в течение 6 дней без изменений среды. К 6-му дню псевдоостровки должны быть полностью сформированы и готовы к экспериментам (рис. 1B-D).

2. Подготовка к визуализации живых клеток и микроперифузии (за 1 день до эксперимента)

ПРИМЕЧАНИЕ: Информацию о приготовлении микроперифузионной среды можно найти в ресурсе protocols.io (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).

  1. Собирают псевдоостровки с помощью многоканальной пипетки, перенося их из 96-луночного планшета в стерильную чашку Петри. Затем вручную соберите псевдоостровки и переложите их в другую стерильную чашку Петри, содержащую свежий VPM. Дайте псевдоостровкам инкубироваться в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 °C и 5% CO2/95% воздуха в течение ночи.
  2. Приготовьте 1 л ДМЭМ, добавив 1 г БСА (радиоиммунного анализа), 0,11 г пирувата натрия, 0,58 г L-глютамина, 3,2 г бикарбоната натрия, 1,11 г HEPES и 1 флакон ДМЭМ в 1 л ультраочищенной воды. Приготовьте 1 М раствор глюкозы в DMEM. Оставьте оба раствора при температуре 4 °C в течение ночи.
  3. Проверьте поток микроперифузионной системы за день до эксперимента. Подсоедините все трубки к чипхолдеру, содержащему пустой микрочип, как показано на рисунке 2A-B. Используйте сверхочищенную воду в качестве стока для подтверждения расхода 100 мкл/мин в фракционном коллекторе.

3. Добавление секретагогов в DMEM (день эксперимента)

  1. Добавьте 0,07 мг/мл аскорбата в DMEM и приготовьте секретагоги в DMEM + буфер аскорбата, используя 1 М глюкозный запас для глюкозосодержащих буферов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аскорбат используется для стабилизации адреналина, предотвращая его окисление. Если адреналин не используется, аскорбат может быть исключен из DMEM.
  2. Дважды отфильтруйте секретагоги через пористый фильтр 0,22 мкм, каждый раз используя новый фильтр. Подогрейте растворы до 37 °C и измерьте глюкозу с помощью глюкометра, чтобы подтвердить желаемую концентрацию.

4. Настройка микроперифузионного аппарата

  1. Нагрейте климатическую камеру конфокального лазерного сканирующего микроскопа до 37 °C, убедившись, что все дверцы закрыты, а в камере поддерживается стабильная температура. Поместите чипхолдер с микрочипом в камеру для прогрева. Проверьте температуру чипа с помощью инфракрасной пушки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае климатическая камера устанавливается на 38,5 °C, что позволяет чипу достичь 37 °C.
  2. Подсоедините все трубки к чипхолдеру (как показано на рисунке 2A-B). Промывка с базовым секретагогом в течение 5 мин. В этом исследовании линия промывалась глюкозой 2 мМ (G2). Меняйте мембрану пузырьковой ловушки депузырька каждые 8-10 экспериментов.

5. Загрузка псевдоостровков в микрочип

  1. Перед загрузкой микрочипа сделайте светлопольное и темнопольное изображение (10-кратное увеличение) псевдоостровков, которое будет использоваться в эксперименте для последующей количественной оценки островковых эквивалентов (IEQ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: IEQ используется для нормализации секреции гормонов в зависимости от количества островков в экспериментах. Этот шаг также можно сделать за день до эксперимента.
  2. Откачайте лишнюю жидкость из нижней и верхней половин микрочипа. Верхняя половина микрочипа содержит прокладки, которые обеспечивают надлежащую герметизацию каждой лунки, в то время как нижняя половина микрочипа содержит лунки с прикрепленным стеклянным покровным стеклом. Предварительно смочите одну лунку в микрочипе 5 мкл DMEM. Обязательно протрите пипеткой внешние края колодца, чтобы намочить щели.
  3. С помощью предварительно смоченной пипетки соберите 30-32 псевдоостровка в объеме 23 мкл и медленно распределите псевдоостровки в центр лунки в нижней части микрочипа. Проверьте кончик пипетки на наличие ложных островков, которые могли быть прикреплены.
  4. Используйте гелевую насадку, чтобы аккуратно переместить псевдоостровки в центр колодца. Это гарантирует, что в поле зрения будет захвачено максимальное количество псевдоостровков.
  5. Сделайте снимок псевдоостровков в микрочипе на стереоскопе. Это количество будет использоваться для корректировки рассчитанного IEQ для любых потерь псевдоостровков во время этого процесса.
    1. Если все псевдоостровки из шага 5.3 не загружены в микросхему, отрегулируйте IEQ соответствующим образом. Например, если сейчас визуализировано 30 псевдоостровков, но 32 были визуализированы на шаге 5.1, вычислите IEQ для изображений из шага 5.1, а затем умножьте на 30/32.
  6. Поместите нижнюю часть микрочипа в держатель микрочипа. Осторожно поместите верхнюю часть микрочипа зеленой прокладкой вниз.
  7. Удерживая микрочип на месте, осторожно закройте держатель микрочипа, чтобы зафиксировать микрочип. Старайтесь не оказывать чрезмерного давления на микрочип во время этого процесса, так как это приведет к вытеснению жидкости, содержащейся в лунке, и может привести к потере псевдоостровков. Избегайте попадания пузырьков воздуха в лунку.

6. Синхронная визуализация живых клеток и микроперифузия

  1. Переместите секретагоги, насос и микрочип в держателе в камеру для окружающей среды, установленную на конфокальном микроскопе. Направьте дренажную трубку из камеры в сборник фракции.
    1. Поместите буферы в конические пробирки объемом 15 мл с отверстиями в крышках. Эти отверстия предотвращают выход сборной трубки из трубки.
    2. При ввинчивании трубки в дебарболер отделите гайку и наконечник, а затем вкрутите в дебарболер. Это предотвращает перекручивание лески.
  2. Настройте сборщик дробей на вращение каждые 2 минуты. Загрузите соответствующее количество пробирок в сборник фракций с учетом промывок и экспериментальных фракций. Для этих экспериментов использовали 15 промывочных пробирок (30 мин общей промывки) и 28 пробирок для сбора фракций.
  3. Запустите насос для подачи исходной среды (содержащей базовую концентрацию глюкозы) со скоростью 100 мкл/мин (сбор в течение 2 минут при скорости потока 100 мкл/мин приводит к 200 мкл стока на каждую фракционную пробирку). Такая скорость потока была выбрана для того, чтобы ограничить нагрузку на псевдоостровки и предотвратить значительное смещение псевдоостровков во время визуализации в реальном времени.
    1. Пока жидкость проходит через устройство, следите за следующим:
      1. Следите за каплями на конце носика сборника фракций, которые указывают на поток через систему.
      2. Следите за уменьшением оттока из системы; если в сборных пробирках содержится <200 мкл, это указывает на то, что в системе может быть засорение или утечка. В таблице 2 приведен список потенциальных причин уменьшения объема сточных вод, способы их устранения и советы по профилактике.
  4. После того, как из трубки для отвода жидкости будет устойчивый поток среды, поверните головку сборника фракций для дозирования в трубки и запустите сборник фракций. Соберите первые 15 фракций (30 минут) в качестве промывки, чтобы псевдоостровки уравновесились. Используйте эти первые 15 фракций, чтобы обеспечить непрерывный и точный поток среды через систему. После этого выбросьте эти дроби.
  5. Во время 30-минутной промывки настройте микроскоп для визуализации живых клеток в соответствии со следующими параметрами: объектив: U Plan Fluorite 20x с 1-кратным зумом; флуоресцентные каналы: EGFP (излучение = 510 нм, длина волны лазера = 488, длина волны детектирования = 500-600 нм); временные ряды: изображение, получаемое каждые 2 с в течение всего эксперимента (т.е. 56 минут); Скорость дискретизации: 2 мкс/пиксель.
    1. Определите нижнюю часть псевдоостровков в поле зрения и отрегулируйте фокальную плоскость на 15 мкм выше этого положения. Это кадр, который будет использоваться на протяжении всего эксперимента по визуализации.
  6. После завершения 30-минутной промывки приступайте к сбору фракций и получению изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо приложить все усилия для выявления и устранения любых проблем до этого шага. Как только начинается сбор данных, любые паузы в эксперименте или чрезмерное воздействие секретагогов могут отрицательно сказаться на результатах.
  7. Продолжайте пропитывать псевдоостровки исходной средой в течение всего первого базового сбора, собирая стоки в пробирки по 1,5 мл. Переключите трубку с базового буфера вручную на новую буферную пробирку для стимулов, когда наступит подходящее для эксперимента время.
    1. Стандартная последовательность микроперифузии приведена в таблице 3.
    2. После сбора ~10 фракций поместите все фракции в холодильник с температурой 4 °C до конца эксперимента, чтобы предотвратить деградацию гормонов, особенно глюкагона.
    3. Продолжайте следить за потоком в системе на протяжении всего эксперимента, проверяя объем сточных вод в каждой трубке.
  8. Когда эксперимент будет завершен, переключитесь обратно на исходную среду и дайте насосу продолжать работать в течение 5 минут, чтобы смыть стимул исходной средой (в данном случае 2 мМ глюкозы).
  9. Остановите насос и отсоедините трубку держателя микрочипа на депузырьте и сборнике фракций, чтобы извлечь держатель микрочипа из климатической камеры. После снятия микрочипа закройте все дверцы для поддержания температуры.
  10. Хранят перифузаты при температуре −80 °C для последующего анализа на гормоны.

7. Кислотная экстракции этанола псевдоостровков

  1. Осторожно откройте держатель микрочипа и снимите верхнюю часть микрочипа. Используйте пипетку и настольный микроскоп, чтобы извлечь псевдоостровки из лунки и переложить их в пробирку объемом 1,5 мл. При необходимости обеспечьте сбор всех псевдоостровков с помощью настольного микроскопа.
    1. Сделайте окончательный снимок псевдоостровков в микрочипе перед извлечением из скважины, чтобы отрегулировать IEQ экстракта островков, аналогично шагу 5.5.
  2. Промойте два раза 500 мкл PBS. Откручивайте псевдоостровки в течение 1 мин при 94 x g между каждой стиркой и отсасывайте надосадочную жидкость.
  3. После удаления последней промывки добавьте 200 мкл кислого этанола (5,5 мл 95% этанола + 50 мкл 12 Н HCl). Хранить при температуре 4 °C в течение ночи.
  4. На следующий день отжим экстракты в течение 10 минут при температуре 15 989 x g и 4 °C. Аликвоту 45 мкл в три новые пробирки. Хранить при температуре −80 °C для анализа содержания гормонов. В качестве альтернативы нормализации секреции гормонов по IEQ, секреция гормона также может быть нормализована до содержания псевдоостровкового гормона, измеренного в экстрактах.

8. Дополнительные эксперименты и очистка

  1. Повторите шаги 5-7 с последующими группами псевдоостровков, чтобы получить дополнительные технические реплики.
  2. После завершения всех экспериментов с микроперифузией пропустите 10% отбеливатель через микрочип и трубку в течение 5 минут, а затем ультраочищенную воду в течение 30 минут для дезинфекции трубки.

9. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализацию живых клеток проводили с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Изображения были проанализированы с помощью пакета программного обеспечения для визуализации, связанного с микроскопом. Ниже приведены общие рекомендации, которые могут отличаться в зависимости от производителя микроскопа и программного обеспечения для получения изображений.

  1. Определение общего количества эквивалентов островков (IEQ) для нормализации данных
    1. Откройте программу и нажмите на вкладку «Сбор» в правом верхнем углу окна. Выполните пакетную загрузку всех изображений темных полей, выбрав функцию Пакетная запись в Диспетчере макросов (Окна > инструментов > Диспетчер макросов).
      1. Чтобы записать несколько изображений одновременно, нажмите кнопку « Переключить пакетный режим » перед нажатием кнопки «Выполнить » в диспетчере макросов. Следуйте инструкциям на экране, чтобы выбрать исходное и целевое место для записанных изображений. В качестве типа файла изображения выберите Tagged Imagine File Format (*.tif)).
    2. Для измерения IEQ откройте записанную версию 10-кратного изображения темного поля, полученного на шаге 5.1. Нажмите на вкладку « Подсчет и измерение » вверху и нажмите кнопку «Пороговое значение ВПГ вручную » слева.
      1. Используйте функцию пипетки для добавления/удаления положительной области (красного цвета) до тех пор, пока каждый псевдоостровок не будет выделен красным цветом, не выходя за границу псевдоостровка. Нажмите « Считать и измерять».
    3. Используйте функции автоматического разделения или ручного разделения для разделения псевдоостровков, которые были соединены вместе.
      1. Чтобы разделить псевдоостровки вручную, выберите функцию ручного разделения, щелкните левой кнопкой мыши, чтобы нарисовать линию, разделяющую псевдоостровки, а затем щелкните правой кнопкой мыши, чтобы завершить линию. Для автоматического разделения выберите функцию автоматического разделения и нажмите на сгруппированные псевдоостровки, которые вас интересуют. После этого подтвердите правильность автоматического разделения.
    4. На пакетных изображениях масштабная линейка и текст увеличения могут быть помечены как положительные. Удалите эти объекты для точного подсчета, выделив текст и масштабную линейку с помощью мыши и нажав клавишу Delete .
    5. Включите или выключите фильтр, чтобы убедиться, что все псевдоостровки подсчитываются. Файл также может быть открыт вне программы для перекрестных ссылок. Когда закончите, нажмите « Экспорт в Excel».
    6. Откройте электронную таблицу и измените ее следующим образом.
      1. Удалите информацию о количестве, среднем значении и сортировке внизу. Отсортируйте объекты по их среднему диаметру. Вставьте столбец после среднего диаметра и назовите столбец "Pseudoislet count".
      2. Количество островков определяется числом псевдоостровков со средним диаметром, которые попадают в каждый индекс ниже. Умножьте количество псевдоостровков на индекс на соответствующий коэффициент преобразования IEQ и просуммируйте эти значения, чтобы определить общий IEQ. Выполняйте вычисления IEQ на изображениях, полученных перед каждым экспериментом. Используйте следующие индексы и коэффициенты пересчета IEQ:
        1-49 мкм: × 0,167
        50-100 мкм: × 0,667
        101-150 мкм: × 1.685
        151-200 мкм: × 3.500
        201-300 мкм: × 6.315
        301-350 мкм: × 10.352
      3. Пример электронной таблицы для определения количества IEQ см. в дополнительном файле 1.
  2. Количественная оценка изображений живых клеток в программном обеспечении
    1. Откройте нужный файл (.oir) в cellSens.
    2. Обозначьте области интереса (ROI) следующим образом.
      1. Используйте инструменты рисования, чтобы обозначить ROI (т.е. каждый псевдоостровок). При рисовании от руки щелкните правой кнопкой мыши, чтобы замкнуть фигуру.
      2. Выделите все ROI с помощью стрелки и перетащите ее, чтобы охватить все ROI на изображении. Выделив все ROI, щелкните правой кнопкой мыши и выберите Преобразовать в динамическую рентабельность инвестиций с течением времени
      3. Воспроизведите файл XYT, чтобы убедиться в том, что рентабельность инвестиций является точной с течением времени. Если рентабельность инвестиций неточна в определенный период, скорректируйте ее размер/местоположение в этот период. Программное обеспечение будет постепенно корректировать размер/местоположение ROI с течением времени в соответствии с этими изменениями. Повторяйте эти шаги до тех пор, пока окупаемость инвестиций не станет точной на протяжении всего эксперимента по визуализации.
    3. Выполните измерения интенсивности для каждого ROI следующим образом.
      1. На панели инструментов нажмите Measure Intensity Profile. Выделите ROI для анализа; используйте Shift + щелчок, чтобы выбрать несколько ROI.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что в программном обеспечении может быть открыто несколько файлов одновременно, анализируйте ROI только из одного файла за раз.
      2. Чтобы учесть фоновый шум, выберите постоянное значение для вычитания из каждого значения интенсивности или назначьте один ROI в качестве фона. Нажмите « Выполнить».
      3. На панели инструментов Профиль интенсивности (Intensity Profile ) нажмите кнопку Экспорт в Excel (Export to Excel ), чтобы экспортировать данные.
      4. Нормализуйте все точки данных к среднему значению интенсивностей, измеренных в течение 7-8 мин (т.е. последней мин первой исходной перифузии среды). Эти нормализованные значения в каждый момент времени определяются как относительная интенсивность cADDis. Пример электронной таблицы анализа и нормализации данных визуализации см. в дополнительном файле 2.
  3. Измерьте секрецию гормона в каждой фракции и экстракте островков. В этих экспериментах концентрацию инсулина и глюкагона измеряли методом ИФА. Нормализуют секрецию гормонов в каждой фракции до объема псевдоостровков, используя измерения IEQ, определенные на шаге 9.1, или по содержанию гормона экстракта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Псевдоостровки человека, экспрессирующие биосенсоры, были созданы путем аденовирусной доставки конструкций, кодирующих биосенсор цАМФ cADDis (рис. 1А). На рисунке 1B показана реагрегация трансдуцированных островковых клеток человека с течением времени, при этом полностью сформированные псевдоостровки наблюдаются через 6 дней культивирования. Клетки начали проявлять видимую флуоресценцию cADDis в течение 48 ч, а к концу периода культивирования в трансдуц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интеграция микроперифузионной системы, псевдоостровков, экспрессирующих биосенсоры, и лазерно-сканирующей конфокальной микроскопии позволяет синхронно оценивать внутриклеточные сигнальные события и динамические секреторные профили гормонов. Динамическая микроперифузионная система может доставлять серию четко определенных стимулов к псевдоостровкам и позволяет собирать сточные воды, в которых концентрации инсулина и глюкагона могут быть измерены с помощью коммерчески доступного ИФА. В то же время, визуализация псевдоостро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Доноры органов и их семьи высоко ценятся за их бесценные пожертвования, а Международный институт организаций по закупке органов, развитию медицины (IIAM) и Национальный обмен исследованиями заболеваний (NDRI) получают признание за их партнерство в обеспечении доступности тканей поджелудочной железы человека для исследований. Эта работа была поддержана Исследовательской сетью островков человека (RRID:SCR_014393), Программой анализа поджелудочной железы человека (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 и DK20593 (Научно-исследовательский и учебный центр диабета Вандербильта), Благотворительным фондом Леоны М. и Гарри Б. Хелмсли, JDRF, Министерством по делам ветеранов США (BX000666), NIGMS Национальных институтов здравоохранения (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 и Национальный научный фонд (National Science Foundation Graduate Research Fellowship) (1937963).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ad-CMV-cADDisWelgenНе применимо
  0.01" Трубка FEPIDEX1527L
1 м HEPESGibco15630-080Обогащенный CMRL Компонент среды
1,5 мл и конические трубкиAnyAny
10 μ m Фильтр из ПТФЭCole-ParmerSK-21940-41Менять каждые 8-10 прогонов
100 мМ Пируват натрияThermo Scientific11360070Обогащенный-CMRL Медиа Компонент
190 пруф ЭтанолDecon labs2816Кислотный этанол Компонент
200 мМ GlutaMAX-I ДобавкаGibco35050061обогащенный CMRL Медиа компонент
АскорбатСигмаA5960DMEM Компонент перифузионного буфера
Бычья сыворотка АльбуминСигмаA7888DMEM Компонент перифузионного буфера
Пузырьковая ловушка Omnifit006BT
CellCarrier ULA  96-луночные микропланшетыPerkin Elmer6055330
программное обеспечение для анализа cellSensOlympusv3.1Программное обеспечение для анализа данных
CMRL 1066MediaTech 15-110-CVОбогащенный CMRL конический
адаптер (IDEX, P-794)IDEXP-794
D-(+)-глюкозныйбуферный компонентSigmaG7528
DMEM SigmaD5030DMEM Перифузионный буферный компонент
Экологическая камераokolabIX83
Эпинеферин (Эпи)SigmaE4250Стимулирующий буферный компонент Фетальная
бычья сыворотка (FBS), термоинактивированнаяSigma12306CОбогащенный CMRL медиакомпонент
Глюкагон ELISAMercodia10-1281-01
Набор глюкагона HTRFCisbio62CGLPEH
HCl (12N)Любаякислота Этаноловый компонент
HEPESSigmaH7523DMEM Перифузионный буферный компонент
iCell эндотелиальные клетки Средняя добавкаклеточная динамикаM1019iEC Медиа компонент
Idex Derlin орех и наконечник 1/4-24Cole-ParmerEW-00414-LW
Инсулин ИФАMercodia10-1113-01
Изобутилметилонин (IBMX)SigmaI5879Стимулирующий буферный компонент
Лазерный сканирующий конфокальный микроскопOlympusFV3000
L-глутаминSigmaG8540DMEM Перифузионный буферный компонент
Микрочип (Университет Майами, FP-3W)Университет МайамиFP-3W
Держатель микрочипов Micronit MicrofluidicsFC_PRO_CH4525
Модель 2110 Коллектор фракцийBiorad7318122
пипетками и наконечниками P10, P200 и P1000Любой
пенициллин/стрептомицинGibco15140-122Обогащенный компонент среды CMRL
Перистальтический насос InstechP720
Фосфат Буферный ФизрастворGibco14190-144Промыть островки
Сарстедт Посуда Сарстедтзависит от диаметра
Бикарбонат натрияSigmaS6014DMEM Перифузионный буферный компонент
Пируват натрияSigmaP2256  DMEM Перифузионный буферный компонентный
стереоскопOlympusSZX12
Steriflip Filter (0,22 μ m)MilliporeSCGP00525Фильтрация всех буферов дважды
VascuLife VEGF Medium Complete KitLifeLine Cell TechnologyLL-0003iEC Медиа Компонент
посуды

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
  2. Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
  3. Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
  4. Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
  5. Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
  6. Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
  7. Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990(2020).
  8. Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
  9. Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
  10. Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
  11. Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
  12. Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
  13. Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
  14. Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
  15. Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи