Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Педиатрическая животная модель экстракорпоральной сердечно-легочной реанимации после длительной остановки кровообращения

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65266

⸱

26 мая 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sant Joan de Déu Research Institute, 2Vanderbilt University School of Medicine, Vanderbilt University, 3Department of Pediatric Critical Care Medicine, Sant Joan de Déu Hospital, 4BCNatal-Barcelona Center for Maternal Fetal and Neonatal Medicine, Sant Joan de Déu Hospital, 5Department of Pediatric Cardiology, Sant Joan de Déu Hospital, 6Department of Critical Care Medicine, University of Pittsburgh

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описывается неонатальная модель искусственного кровообращения (ИКЛ) у свиней с остановкой кровообращения и сердца в качестве инструмента для изучения тяжелых повреждений головного мозга и других осложнений, вторичных по отношению к ИКЛ.

Аннотация

Врожденный порок сердца (ВПС) является наиболее распространенным врожденным пороком развития, ежегодно во всем мире рождается около миллиона детей. Для всестороннего исследования этого заболевания требуются соответствующие и проверенные модели на животных. Поросята обычно используются для трансляционных исследований из-за их аналогичной анатомии и физиологии. Целью данной работы было описать и валидировать модель искусственного кровообращения (ИКБ) у неонатального поросенка с остановкой кровообращения и сердца (КА) в качестве инструмента для изучения тяжелых повреждений головного мозга и других осложнений кардиохирургии. В дополнение к включению перечня материалов, эта работа предоставляет дорожную карту для других следователей для планирования и выполнения этого протокола. После того, как опытные практикующие врачи провели несколько испытаний, репрезентативные результаты модели продемонстрировали 92% успеха, при этом неудачи были связаны с маленьким размером поросенка и вариантом анатомии сосуда. Кроме того, модель позволяла практикующим врачам выбирать из широкого спектра экспериментальных условий, включая различное время КА, изменения температуры и фармакологические вмешательства. Таким образом, этот метод использует материалы, легко доступные в большинстве больниц, является надежным и воспроизводимым, а также может широко использоваться для улучшения трансляционных исследований у детей, перенесших операции на сердце.

Введение

Врожденный порок сердца (ВПС) является наиболее распространенным врожденным пороком развития, ежегодно во всем мире происходит около миллионародов. Несмотря на то, что современные достижения в области кардиоторакальной хирургии (КТС) и интенсивной терапии позволили снизить уровень смертности, сопутствующие заболевания остаются чрезвычайно распространенными 2,3,4,5. Аномалии развития нервной системы, включая когнитивные и двигательные нарушения, а также трудности в обучении, отмечаются примерно у 25-50% этих пациентов 6,7,8. Было продемонстрировано, что хирургическое вмешательство в первые дни жизни, особенно те, которые требуют остановки кровообращения и сердца (КА), увеличивает заболеваемость9. Гемодинамические изменения во время хирургического вмешательства могут оказать важное влияние на уязвимый развивающийся мозг новорожденного. Экспериментальные модели необходимы для лучшего понимания происхождения этих аномалий и изучения нейропротекторных стратегий для улучшения прогнозов этих пациентов.

Использование животных моделей для изучения этой популяции было широко задокументировано 5,10,11,12,13,14. Примечательно, что поросята представляют собой отличный вариант, учитывая близкое приближение в анатомии сердца (рис. 1), геноме и физиологии, а также их относительно большие размеры по сравнению с другими животными моделями15 (рис. 2). Ранее было описано использование моделей поросят для изучения эффектов как сердечно-легочного шунтирования (ИКБ), так и КА. Эти экспериментальные животные модели полезны для изучения гемодинамических изменений и связанных с ними осложнений со стороны органов-конечных тканей 14,16,17,18,19,20. Эти модели были разработаны для того, чтобы позволить исследователям изучать условия жизни человека в контролируемых условиях, с гибкостью для различных экспериментальных условий. В большинстве исследований сообщается об использовании центральной канюляции, метода, который требует передовых хирургических навыков, требует более эффективного использования ресурсов и затрудняет обеспечение долгосрочной выживаемости. Хотя предыдущие исследования документально подтвердили использование поросят в изучении CPB12,15, лишь немногие предложили технику периферической канюляции.

Этот новый метод периферической канюляции является более простым, менее агрессивным и более осуществимым по сравнению с другимиопубликованными исследованиями. Более того, валидация этого метода на новорожденных и мелких животных является новой и должна быть рассмотрена для использования всеми исследователями, заинтересованными в использовании животной модели для изучения ИБС и связанных с ней сопутствующих заболеваний. Это особенно подходит для лиц, имеющих доступ к лаборатории, оснащенной материалами, ресурсами и персоналом, имеющим опыт проведения экспериментов на животных моделях.

Таким образом, основной целью данного исследования является описание и валидация модели ИКЛ у неонатального поросенка с КА. Протокол направлен на изучение тяжелых повреждений головного мозга и других возможных осложнений хирургии искусственного кровообращения в контролируемых условиях с различными экспериментальными условиями. Этот метод обеспечивает обобщенную, надежную и высококачественную модель, которая может быть использована для широкого спектра экспериментальных протоколов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данная процедура была одобрена Комитетом по этике экспериментов на животных (CEEA) Центра сравнительной медицины и биоимиджа Каталонии (CEEA-CMCiB). Правительство Каталонии также санкционировало экспериментальный протокол (No 11652), идентификационный номер файла FUE-2022-02381434 и удостоверение личности QBXQ3RY3J. Все эксперименты проводили опытные практикующие врачи, в том числе сертифицированные ветеринарные врачи, обеспечивающие наблюдение и помощь. Для настоящего исследования использовали поросят (Sus scrofa domestica) в возрасте 4-6 дней, массой тела 2,5-3,5 кг. Была предпринята попытка сбалансировать гендерное распределение, чтобы избежать связанных с этим предубеждений.

1. Седация, интубация и доступ

  1. Начните введение седативного эффекта и обезболивания с помощью внутримышечного введения кетамина (20 мг/кг), дексмедетомидина (0,02 мг/кг) и мидазолама (0,3 мг/кг). После того, как животное будет глубоко усыплено (через 5 минут после введения премедикации), насытитесь кислородом со 100% О2 через маску для морды (2 л/мин). Далее вызывают анестезию внутривенно пропофолом (0,5 мг/кг) (см. Таблицу материалов).
  2. Расположите поросенка в положении спинного лежания. Выполняйте оротрахеальную интубацию с помощью эндотрахеальной трубки с манжетой диаметром 2,5 мм (см. Таблицу материалов), используя прямую визуализацию трахеи.
    1. Подтвердите правильную установку эндотрахеальной трубки путем прямой аускультации оснований легких.
  3. Установите искусственную вентиляцию легких таким образом, чтобы частота дыхания составляла 30 вдохов в минуту, дыхательный объем составлял 8-12 мл/кг, а давление в конце выдоха составляло 4 смH2O.
  4. Непрерывно контролируйте глубину анестезии во время протокола с помощью частоты сердечных сокращений (ЧСС), артериального давления (АД) и сатурации кислорода (spO2). При необходимости отрегулируйте параметры вентиляции и седации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальными значениями для жизненно важных показателей являются ЧСС 130-160 уд/мин, АД 75-95/60-70 и spO2 > 85.
  5. Поддерживать седативный эффект 1,5% севофлураном и фентанилом (25-200 мкг/кг/мин) (см. Таблицу материалов).
  6. Используйте прямую визуализацию для установки катетеров в бедренную артерию (3 Fr) и вену (4 Fr) (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти катетеры будут использоваться для введения лекарств и взятия образцов. Таким образом, важно поддерживать доступ.

2. Настройка цепи CPB и заливка

  1. Настройте и настройте цепь CPB, выполнив следующие действия (рис. 3):
    1. Укоротите трубку как можно больше, сохраняя при этом достаточное расстояние, чтобы добраться до животного из машины.
    2. Создайте и прикрепите трубчатый мост, который соединяет отток из мембранного оксигенатора (см. Таблицу материалов) с притоком в насос.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мост жизненно важен для того, чтобы кровь продолжала циркулировать по аппарату во время выполнения КА животного.
  2. После того, как все точки подключения будут запечатаны, заправьте цепь 300 мл гепариново-физиологического раствора (1000 ЕД гепарина, смешанного с 1 л физиологического раствора) и 300 мл свежей донорской крови свиньи, а затем 3,5 мг бикарбоната натрия, 350 ЕД гепарина и 450 мг глюконата кальция (см. Таблицу материалов).
    1. «Проверьте» контур, пропуская кровь, гепарин-физиологический раствор, бикарбонат натрия и смесь глюконата кальция по всему контуру в течение 2 минут со скоростью 0,3 л/мин.

3. Хирургическое вмешательство и начало искусственного кровообращения

ПРИМЕЧАНИЕ: На дополнительном рисунке 1 изображены хирургические материалы, необходимые для установки канюли.

  1. Обнажите левую внутреннюю яремную вену и правую сонную артерию, чтобы подготовиться к канюляции (Рисунок 4).
  2. Для канюляции используют метод Сельдингера или технику «over-the-wire»21.
    1. Сначала введите игольчатый катетер в левую внутреннюю яремную вену. Как только вспышка крови будет визуализирована, осторожно вставьте направляющую проволоку в сосуд и извлеките иглу, убедившись, что проволока остается на месте.
    2. Проденьте расширитель на проволоку и введите его в сосуд, затем снимите расширитель.
    3. Не снимая проволоку, проденьте венозную канюлю на 8 Fr и медленно продвигайте ее на ~4 см внутрь сосуда. Осторожно снимите провод, убедившись, что канюля остается на месте.
    4. Повторите технику проволоки Сельдингера с дилатацией, чтобы поместить детскую артериальную канюлю 6 Fr (см. Таблицу материалов) в правую сонную артерию.
    5. Во время артериальной канюляции введите болюсное внутривенное введение гепарина (50 МЕ/кг) через вновь установленную артериальную канюлю.
  3. Как только доступ будет достигнут, надежно зафиксируйте обе канюли на животном с помощью полирассасывающихся швов 3-0 и пластыря для предотвращения случайного удаления (Рисунок 5).
  4. Подключите канюли к цепи CPB, убедившись, что в точки подключения добавлен физиологический раствор с гепарином для предотвращения попадания воздуха в контур.
  5. Установите начальный расход на 80-85 мл/кг/мин и медленно увеличивайте его до предельного расхода 150 мл/кг/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животное может оставаться на КПБ столько, сколько требуется для проведения экспериментов. Схема шагов 1-3 изображена на дополнительном рисунке 2.

4. Остановка кровообращения и сердца (КА)

  1. Чтобы вызвать КА, введите 9 mEq KCl. Используйте жизненно важные показатели для оценки полного ареста и подтверждения с помощью эхокардиографии. При необходимости вводите дополнительный KCl.
  2. Как только сердце остановлено, изолируйте животное от цепи, чтобы вызвать остановку кровообращения.
  3. Поддерживайте поток в контуре CPB с помощью ранее описанного моста (шаг 3.5), циркулирующего со скоростью 1 500 об/мин.

5. Экстракорпоральная сердечно-легочная реанимация (ЭСЛР)

  1. Как только будет достигнуто соответствующее состояние КА (0 мин, 30 мин или 60 мин), начните реанимацию eCPR.
  2. Снова подключите поросенка к цепи CPB.
  3. Вводите 3 мл глюконата кальция (2,25 ммоль/10 мл, разбавленный 1:2) и 6 мл бикарбоната натрия (1 М, разбавленный 1:2) через периферический артериальный доступ, добавляя дозы по мере необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости можно использовать кардиоверсию или инотропные препараты (адреналин или допамин).

6. Послеоперационный уход

  1. После реанимации следите за жизненно важными показателями в течение 15 минут, чтобы обеспечить стабильность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальными параметрами в период интенсивной терапии являются: ЧСС 100-150 уд/мин, АД 75-95/60-70 и spO2 > 85.
  2. Переведите животных на магнитно-резонансную томографию (МРТ).
    Примечание: После визуализации животные так и не пришли в себя и были усыплены во время анестезии путем внутривенного введения пентобарбитала натрия для получения образцов мозга для гистологического анализа. График экспериментальной части процедуры, включая стратегию сбора образцов, можно посмотреть на дополнительном рисунке 3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В течение 6-месячного периода полный протокол был выполнен 12 раз междисциплинарной командой педиатров-реаниматологов, детских кардиологов, ветеринаров и техников (Дополнительный рисунок 2 и Дополнительный рисунок 3).

Рисунки 1 и 2 демонстрируют ожидаемую анатомию животных, используемых в этом протоколе. Включенные поросята были в среднем в возрасте 4,8 дней (4-6 дней) и весили в среднем 2 814 г (2 40...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сердечно-легочное шунтирование обычно используется во время кардиохирургии у взрослых, детей и новорожденных. Он основан на моторизованном экстракорпоральном контуре и мембранном оксигенаторе, которые работают вместе, насыщая кровь кислородом и обеспечивая легочную и сердечную стабилизацию. Предыдущие исследования показали, что ИКЛ может негативно влиять на многие системы органов (почечную, церебральную, легочную, сердечную, желудочно-кишечную) как у больных, так и у ранее здоровых пациентов 22,23,24.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Этот проект получил финансирование от программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 101017113, Instituto de Salud Carlos III (PI20/00298), Beca Carmen de Torres (Fundació Sant Joan de Déu) и Программы медицинских ученых Вандербильта. Мы благодарим всех сотрудников CMCiB, включая Хорди Грифолса, Марию дель Мар Аревало, Хуана Рикардо Гонсалеса, Сару Капдевилу, Хосепа Пуча и Джемму Кристину Монте Руби). Мы также выражаем особую благодарность Абрилю Кулеллу Кампруби и доктору Серхи Сезару Диасу за их помощь в создании анатомических рисунков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5% севофлуоранZoetis20070289
2,5 мм эндотрахеальная трубкаHenry Schein988-1782
3 Fr катетер для периферического артериального доступаProdimed3872.1
4 Fr катетер для периферического венозного доступаProdimed3872.13
6 French ECMO детская артериальная канюляМедтроник 77206
8 Французская ЭКМО детская венозная канюля Медтроник 68112
АдреналинB Braun469801-1119
Щипцы АдсонаAllgaier инструменты08-030-130Любая марка может быть заменена
на манжету BP Mindray
Бупренорфин (0,01 мг/кг)Richter Pharma#9004114000537
Глюконат кальция (2,25 ммоль/10 мл)B Braun570-12606194-1119
Дексмедетомидин (0,5-2,0 &; г/кг/мин)Орион фармаGTN 064321000017253
Долетолветохинол3605870004904
ДопаминхикмаA044098010
фентанил (25-200 &; г/кг/мин)Kern Pharma756650.2H
Свежая донорская свиная кровь типа OAny 
ТеплообменникMaquet Gmbh & CoMCP70107.2130
Гепарин (1350 UI)ROVI641641.1
Ирвин ретракторAesculapBV104RЛюбая марка может быть заменена
Кетамин (20 мг/кг)Смазка Richter Pharma#9004114000452
Любаяоротрахеальная смазка
Мидазолам (0,3 мг/кг)Serra Pamies619627.4
Щипцы от комаровAesculapBH109RЛюбая марка может быть заменена
Игольчатые щипцыAesculapBM016RЛюбая марка может быть заменена
Normal  физиологический раствор (0,9%)B Braun Fisiovet5/469827/0610Любая марка может быть
заменена Пластиковые зажимы для трубокAchim Schulz-LauterbachDBGMЛюбая марка может быть заменена
Хлорид калия (9 мг-экв)B Braun3545156
Пропофол (0,5 мг/кг)Zoetis579742.7
Квадроксный мембранный оксигенатор Maquet Gmbh & CoBE-HMOSD 300000
Ректальный термометрЛюбая
консольная система ЭКМО RotaFlow Maquet Gmbh & CoMCP00703177Неонатальная система ЭКМО
СкальпельAesculapBB074RЛюбая марка может быть заменена
Бикарбонат натрия (1 M)Fresenius Kabi634477.4 OH
Хирургические ножницыTalmed Inox112Любая марка может быть заменена
Шовный материал (3/0 поли рассасывающийся)B Braun Novosyn (R)0068030N1Любая марка может быть заменена
#

Ссылки

  1. vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: A systematic review and meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
  2. Claessens, N. H. P., et al. Amplitude-integrated electroencephalography for early recognition of brain injury in neonates with critical congenital heart disease. Journal of Pediatrics. 202, 199-205 (2018).
  3. Aly, S. A., et al. Cerebral tissue oxygenation index and lactate at 24 hours postoperative predict survival and neurodevelopmental outcome after neonatal cardiac surgery. Congenital Heart Disease. 12 (2), 188-195 (2017).
  4. Bouma, B. J., Mulder, B. J. M. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
  5. Jungwirth, B., de Lange, F. Animal models of cardiopulmonary bypass: development, applications, and impact. Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 14 (2), 136-140 (2010).
  6. Sarrechia, I., et al. Neurocognitive development and behaviour in school-aged children after surgery for univentricular or biventricular congenital heart disease. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 49 (1), 167-174 (2016).
  7. Schlosser, L., et al. Neurocognitive functioning in young adults with congenital heart disease: insights from a case-control study. Cardiology in the Young. 32 (5), 694-701 (2022).
  8. Miller, S. P., et al. Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease. The New England Journal of Medicine. 357 (19), 1928-1938 (2007).
  9. Fang, A., Allen, K. Y., Marino, B. S., Brady, K. M. Neurologic outcomes after heart surgery. Paediatric Anaesthesia. 29 (11), 1086-1093 (2019).
  10. Carr, B. D., et al. Inflammatory effects of blood-air interface in a porcine cardiopulmonary bypass model. ASAIO Journal. 66 (1), 72-78 (2020).
  11. Drabek, T., et al. Emergency preservation and delayed resuscitation allows normal recovery after exsanguination cardiac arrest in rats: A feasibility trial. Critical Care Medicine. 35 (2), 532-537 (2007).
  12. Sheikh, A. M., et al. Proteomics of cerebral injury in a neonatal model of cardiopulmonary bypass with deep hypothermic circulatory arrest. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 132 (4), 820-828 (2006).
  13. Khailova, L., et al. Tissue alkaline phosphatase activity and expression in an experimental infant swine model of cardiopulmonary bypass with deep hypothermic circulatory arrest. Journal of Inflammation. 17, 27(2020).
  14. Mavroudis, C. D., et al. Electroencephalographic response to deep hypothermic circulatory arrest in neonatal swine and humans. The Annals of Thoracic Surgery. 106 (6), 1841-1846 (2018).
  15. Gabriel, G. C., et al. Cardiovascular development and congenital heart disease modeling in the pig. Journal of the American Heart Association. 10 (14), 021631(2021).
  16. Dhari, Z., et al. Impact of cardiopulmonary bypass on neurogenesis and cortical maturation. Annals of Neurology. 90 (6), 913-926 (2021).
  17. Wittnich, C., Belanger, M. P., Wallen, W. J., Torrance, S. M., Juhasz, S. A Long-term stable normothermic cardiopulmonary bypass model in neonatal swine. The Journal of Surgery Research. 101 (2), 176-182 (2001).
  18. Lodge, A. J., et al. Regional blood flow during pulsatile cardiopulmonary bypass and after circulatory arrest in an infant model. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (5), 1243-1250 (1997).
  19. Davidson, J. A., et al. Alkaline phosphatase treatment of acute kidney injury in an infant piglet model of cardiopulmonary bypass with deep hypothermic circulatory arrest. Scientific Reports. 9 (1), 14175(2019).
  20. Wang, X., et al. Ulinastatin protects against acute kidney injury in infant piglets model undergoing surgery on hypothermic low-flow cardiopulmonary bypass. PLoS One. 10 (12), e0144516(2015).
  21. Tegtmeyer, K., Brady, G., Lai, S., Hodo, R., Braner, D. Videos in clinical medicine: placement of an arterial line. The New England Journal of Medicine. 354 (15), 13(2006).
  22. Nteliopoulos, G., et al. Lung injury following cardiopulmonary bypass: a clinical update. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 20 (11), 871-880 (2022).
  23. Jufar, A. H., et al. Renal and cerebral hypoxia and inflammation during cardiopulmonary bypass. Comprehensive Physiology. 12 (1), 2799-2834 (2021).
  24. Nollert, G., Reichart, B. Cardiopulmonary bypass and cerebral injury in adults. Shock. 16 (1), 16-19 (2001).
  25. Tóth, Z., Györimolnár, I., Abrahám, H., Hevesi, A. Cannulation and cardiopulmonary bypass produce selective brain lesions in pigs. Asian Cardiovascular & Thoracic Annals. 14 (4), 273-278 (2006).
  26. Senra, D. F., et al. A rat model of acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. Shock. 16 (3), 223-226 (2001).
  27. Liu, M. D., Luo, P., Wang, Z. J., Fei, Z. Changes of serum Tau, GFAP, TNF-α and malonaldehyde after blast-related traumatic brain injury. Chinese Journal of Traumatology. 17 (6), 317-322 (2014).
  28. Kim, W. G., Moon, H. J., Won, T. H., Chee, H. K. Rabbit model of cardiopulmonary bypass. Perfusion. 14 (2), 101-105 (1999).
  29. Mei, B., et al. Acute adrenal cortex injury during cardiopulmonary bypass in a canine model. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 156 (2), 696-706 (2018).
  30. Cameron, D., Tam, V., Cheng, W., Braxton, M. Studies in the physiology of cardiopulmonary bypass using a swine model. Swine as Models in Biomedical Research. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 187-197 (1992).
  31. Belanger, M., Wittnich, C., Torrance, S., Juhasz, S. Model of normothermic long-term cardiopulmonary bypass in swine weighing more than eighty kilograms. Comparative Medicine. 52 (2), 117-121 (2002).
  32. Münch, F., et al. Improved contractility with tepid modified full blood cardioplegia compared with cold crystalloid cardioplegia in a piglet model. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 48 (2), 236-243 (2015).
  33. Tirilomis, T., Paz, D., Nolte, L., Schoendube, F. A. Modified aortic cannulation for cardiopulmonary bypass in neonatal piglet model. Journal of Cardiac Surgery. 23 (5), 503-504 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Кардиопульмональный обходостановка сердцаэкстракорпоральная реанимацияврожденный порок сердцамодель на поросятахпериферическое канюлированиеповреждение головного мозгаискусственная вентиляция легкихдиффузионно-тензорная визуализация
Педиатрическая животная модель экстракорпоральной сердечно-легочной реанимации после длительной остановки кровообращения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.