Методическая статья

Моделирование опухолей головного мозга in vivo с использованием электропорационной доставки плазмидной ДНК, представляющей мутационные сигнатуры пациента

DOI:

10.3791/65286

⸱

23 июня 2023 г.

 , 
1Board of Governor’s Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Center for Neural Sciences in Medicine, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование иммунокомпетентной, аутохтонной модели опухоли, основанной на распространенных мутациях пациента, для доклинических испытаний имеет решающее значение для иммунотерапевтического тестирования. Этот протокол описывает метод создания мышиных моделей опухолей головного мозга с использованием электропорационной доставки плазмидной ДНК, которая представляет распространенные мутации пациента, что обеспечивает точную, воспроизводимую и согласованную модель мыши.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модели опухолей имеют решающее значение для доклинических испытаний опухолей головного мозга с точки зрения изучения новых, более эффективных методов лечения. При значительном интересе к иммунотерапии еще более важно иметь последовательную, клинически значимую, иммунокомпетентную мышиную модель для изучения популяций опухолевых и иммунных клеток в головном мозге и их реакции на лечение. В то время как большинство доклинических моделей используют ортотопическую трансплантацию установленных линий опухолевых клеток, представленная здесь система моделирования позволяет «персонализировать» представление специфических для пациента опухолевых мутаций в постепенном, но эффективном развитии из конструкций ДНК, вставленных в делящиеся нейральные клетки-предшественники (NPC) in vivo. Мозаичный анализ ДНК-конструкций осуществляется с помощью метода двойного рекомбиназно-опосредованного кассетного обмена (MADR), что позволяет осуществлять однокопийный соматический мутагенез драйверных мутаций. Используя новорожденных детенышей мышей в возрасте от рождения до 3 дней, NPC становятся мишенью, используя эти делящиеся клетки, выстилающие боковые желудочки. Микроинъекция плазмид ДНК (например, полученных из MADR, транспозонов, CRISPR-направленной sgRNA) в желудочки сопровождается электропорацией с помощью лопастей, которые окружают ростральную область головы. При электрической стимуляции ДНК поглощается делящимися клетками с возможностью интеграции в геном. Применение этого метода успешно продемонстрировано при развитии опухолей головного мозга как у детей, так и у взрослых, в том числе наиболее распространенной злокачественной опухоли головного мозга – глиобластомы. В данной статье обсуждаются и демонстрируются различные этапы разработки модели опухоли головного мозга с использованием этой методики, включая процедуру обезболивания молодых детенышей мышей до микроинъекции плазмидной смеси с последующей электропорацией. С помощью этой автохтонной, иммунокомпетентной мышиной модели исследователи получат возможность расширить подходы к доклиническому моделированию в усилиях по улучшению и изучению эффективного лечения рака.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модели опухолей головного мозга мышей имеют решающее значение для понимания механизмов образования и лечения опухолей головного мозга. Современные модели, как правило, включают в себя быструю подкожную или ортотопическую трансплантацию широко используемых линий опухолевых клеток, основанных на ограниченном числе драйверных мутаций или моделях ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, с использованием мышей с иммунодефицитом, которые препятствуют надлежащим исследованиям иммунотерапии 1,2,3,4. Кроме того, эти доклинические результаты могут приводить к ложноположительным результатам, поскольку такие модели могут демонстрировать драматические, часто лечебные эффекты в ответ на терапию, но это не переносится на клинику 2,5,6,7. Возможность быстро создавать генетически модифицированные доклинические модели мышей, которые в большей степени отражают мутационные сигнатуры пациентов, является обязательным условием для повышения достоверности доклинических результатов.

Доставка плазмид ДНК на основе электропорации (ЭП) для индуцирования мутаций с потерей функции (LOF) и усилением функции (GOF) позволяет создавать такие модели. Мы разработали метод для еще более точного представления мутаций драйверов GOF, называемый мозаичным анализом с двойным рекомбиназно-опосредованным кассетным обменом, или MADR8. Этот метод позволяет осуществлять экспрессию интересующего гена (или генов) контролируемым, локус-специфичным образом в соматических клетках8. В сочетании с другими молекулярными инструментами, такими как кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR), различные мутации пациентов могут быть объединены для разработки моделей опухолей головного мозга мышей. Этот метод был использован для различных опухолей головного мозга у детей, включая глиомы и эпендимомы8, а также для моделей опухолей головного мозга у взрослых, таких как глиобластома (ГБМ).

Несмотря на то, что ВП-метод моделирования опухолей не так распространен, как трансплантация, нижеследующее демонстрирует простоту и высокую воспроизводимость этой системы моделирования. Мышей mTmG используют для вставки MADR-плазмидной ДНК 8,9. Эта система позволяет осуществлять рекомбинацию сайтов-мишеней loxP и Flp-рекомбиназы (FRT), расположенных в локусе Rosa26, для последующей вставки плазмиды донорской ДНК (т.е. интересующего гена GOF)8,9. Следующий протокол демонстрирует прямолинейность этого метода после усердной практики и способность разрабатывать модели опухолей головного мозга мышей в автохтонной, последовательной манере.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, предусмотренные этим протоколом, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского центра Cedars Sinai. Гомозиготных мышей mTmG скрещивали с мышами C57BL/6J для получения пометов разнополых гетерозиготных мышей mTmG для использования в следующем протоколе. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Детеныши мышей подвергались электропорации между 0 и 3 днями построждения (P0-P3).

1. Хирургическая подготовка

  1. Распылите на операционный стол химическое дезинфицирующее средство (например, Vimoba) и протрите, затем 70% этанолом, и снова протрите.
  2. Положите на хирургический стол следующие инструменты/материалы: стеклянные капиллярные пипетки (см. ссылку10 о том, как вытаскивать пипетки), маленькие ножницы, небольшой контейнер для отходов биологически опасных острых предметов, микролитровый пипетка и наконечники для пипеток, 2 нарезанных квадратных кусочка парафиновой пленки, электродный гель, электроды, держатель для микроинъектора и смесь плазмид ДНК (см. Таблицу материалов и Дополнительный файл 1).
  3. При наличии показаний установите на оборудование на операционном столе или на полу следующие насадки: панель управления микроинжектором, держатель и заглушка, прикрепленные к аппарату, подставка для удержания держателя микроинжектора сбоку (вспомогательное средство для пайки), ножная педаль микроинжектора (на полу), электроды, прикрепленные к аппарату, и ножная педаль электрода (на полу) (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ножная педаль электрода была размещена справа от ножной педали микроинжектора в качестве напоминания о порядке использования.
  4. Включите панели управления микроинжектором и электродом.
    1. Проверьте правильность настроек на микроинжекторе для эксперимента: давление должно быть в пределах 220-450 гПа, в зависимости от того, как поглощается плазмидная смесь.
    2. Проверьте правильность настроек на панели электродов для эксперимента.
      Примечание: В текущем эксперименте (и в большинстве наших моделей опухолей головного мозга) используются пять импульсов напряжением 120 В (50 мс; с интервалом 950 мс).

2. Предоперационная подготовка

  1. Приготовьте плазмидную смесь в микроинъекторе.
    1. Извлеките одну стеклянную капиллярную пипетку и вставьте ее в держатель микроинъектора. Убедитесь, что наконечник завинчен и удерживается на месте.
    2. Держите держатель микроинжектора в одной руке, а маленькие ножницы в другой; Держите кончик пипетки над небольшим контейнером для острых предметов, представляющих биологическую опасность. Закрыв ножницы, слегка надавите на удлиненную стеклянную капиллярную пипетку. Вырежьте в том месте, где виден изгиб, примерно в 2 мм от отверстия. Если срез выглядит удачным, аккуратно отложите в сторону.
    3. Положите имеющуюся в продаже пробирку для смешивания плазмид на хирургический стол и откройте. Поместите коробку с наконечником для пипетки или другой предмет за нижнюю часть тюбика, чтобы он оставался устойчивым во время забора плазмидной смеси. Положите стеклянную пипетку, прикрепленную к линии микроинъектора, на стол и осторожно вставьте в пробирку с плазмидной смесью, убедившись, что наконечник находится в смеси у дна пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за естественной гравитации всасывание смеси плазмид начнется в стеклянной пипетке до активного втягивания.
    4. Когда кончик стеклянной пипетки находится в плазмидной смеси, используйте панель микроинжектора, чтобы увеличить количество втягиваемого препарата. Начиная с 0, поверните правую ручку и поверните регулятор в отрицательном направлении к -60 - это приведет смесь плазмид в стеклянную пипетку. Добавьте только ~1 дюйм смеси плазмид. Поверните ручку обратно в положение 0, а затем извлеките наконечник пипетки из смеси.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не вынимайте наконечник пипетки из смеси в отрицательном направлении, так как это приведет к выбросу смеси в микроинжектор и, возможно, в трубку.
    5. Проверьте количество смеси за одну инъекцию, впрыснув смесь на одну полоску парафиновой пленки. Используйте ножную педаль и нажмите один раз, чтобы впрыснуть смесь на парафиновую пленку. С помощью пипетки, установленной на 1 мкл, наберите смесь на парафиновую пленку, чтобы проверить, ровно ли она составляет 1 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если он немного меньше 1 мкл, давление микроинъектора можно увеличить. Если давление приближается к 450 гПа и по-прежнему меньше 1 мкл, отверстие стеклянной пипетки слишком маленькое и его необходимо обрезать больше. Перед обрезкой рекомендуется поместить плазмидную смесь обратно в пробирку. Несмотря на это, на ножницах все равно останется остаточная смесь, поэтому крайне важно тщательно очистить ножницы после этого с помощью ДНКазы, чтобы удалить оставшуюся смесь. Если объем инъекции превышает 1 мкл, необходимо использовать новую стеклянную пипетку и обрезать. Когда исследуемый объем составляет ровно 1 мкл, стеклянный наконечник пипетки имеет правильный размер.
    6. Повторите шаг 2.1.4, чтобы набрать дополнительную смесь плазмид для процедуры или примерно на 2-3 дюйма в вытянутую стеклянную пипетку. Следите за тем, чтобы смесь не проникала слишком далеко в микроинжектор, где не видно конца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При втягивании плазмидной смеси очень важно избегать пузырьков воздуха. Если пузырьки присутствуют, необходимо повторить этот шаг, удалив плазмидную смесь из вытянутой стеклянной пипетки и начав заново. Присутствующие пузырьки воздуха будут вредны для следующих этапов при инъекции в желудочек щенка.
    7. Когда плазмидная смесь готова в вытянутой стеклянной пипетке, отложите подготовленную пипетку в сторону на подставку для пайки и не мешайте, чтобы случайно не задеть ее.
  2. Подготовьте животных к эксперименту.
    1. Подготовьте ведерко со льдом для обезболивания щенков. Добавьте воду в ведерко со льдом, чтобы она растаяла, и помогите охладить держатель для анестезии (например, крышку коробки для пипетки).
    2. Положите крышку коробки на растаявший лед, чтобы он остыл.
    3. Осторожно выньте щенков из клетки и поместите их в остывшую крышку коробки, которая останется на льду. Наденьте еще одну верхнюю часть поверх нижней, чтобы помочь процессу охлаждения.
    4. Через 2-3 мин проверьте щенков. Отделите щенков друг от друга, оставаясь в положении лежа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Щенки будут извиваться, но это замедлится, когда начнется холодная анестезия. Верхнюю часть коробки можно опустить для удобства просмотра щенков.
    5. Чтобы проверить правильность анестезии, ущипните щенка за хвост и посмотрите на реакцию. Если есть реакция, повторите шаг 2.2.4. Если щенок не визжит или мало двигается, он готов к процедуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей не следует держать на льду в течение длительных периодов времени, так как это повлияет на их способность восстанавливаться после процедуры. Только то количество щенков, которым можно как вводить, так и электропорировать, пока они еще находятся под наркозом, должно быть положено на лед за один раз; Большее количество можно сделать с опытом.

3. Микроинъекция смеси плазмид ДНК в желудочек головного мозга

  1. Положите щенка на стол в брюшном положении.
  2. Слегка оттяните назад затылок, чтобы визуализировать швы черепа через кожу. Найдите лямбду на черепе. Место введения желудочка/инъекции будет находиться на полпути между лямбдой и глазом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лямбда - это место пересечения сагиттального и лямбдовидного швов. Идентификация лямбды на черепе мыши приведена в ссылке11 .
  3. Проткните кожу стеклянным наконечником пипетки под перпендикулярным углом (пипетка направлена прямо вверх к потолку). Обратите внимание на небольшое вогнутое углубление при надавливании на череп и начальное сопротивление. После прокалывания и протыкания стеклянного наконечника пипетки через вогнутое углубление достигается соответствующий уровень инъекции.
  4. Удерживая стеклянный наконечник пипетки на месте, нажмите на ножную педаль микроинъектора один раз, чтобы ввести 1 мкл плазмидной смеси.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Есть два способа убедиться в том, что инъекция прошла успешно. Во-первых, попросите другого сотрудника лаборатории наблюдать, как смесь плазмид опускается в стеклянную пипетку во время введения. Кроме того, при использовании быстрого зеленого или другого красителя в плазмидной смеси краситель будет заметно распространяться в желудочке под кожей после инъекции и будет легко виден, если поднести его к хирургической лампе.

4. Электропорация

  1. Положите на стол кусок парафиновой пленки (один квадрат) и выдавите электродный гель поверх пленки. Покройте электродные лопасти гелем для электродов, обильно нанеся его на каждую лопасть. Излишки геля, которые капают, можно смахнуть бумажным полотенцем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После первого EP не позволяйте гелю с каждой лопасти касаться другой стороны. Это передаст заряд, и при прикладывании к голове щенка может быть слышен шипящий звук. Это произойдет и в том случае, если гель на голове щенка с одного электрода соприкоснется с гелем с другого.
    ВНИМАНИЕ: Во время электропорации необходимо следить за тем, чтобы пальцы не касались лопастей.
  2. Держите тело щенка одной рукой (как правило, недоминантной рукой), держа пальцы за головой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы правша, проще всего держать щенка левой рукой, а электроды — правой. Если левша, сделайте наоборот.
  3. Поднесите электроды близко к голове щенка, чтобы убедиться, что они находятся в правильном положении, при этом положительный электрод находится на внешней стороне головы, на которую нацелен желудочек (например, если вы нацелены на левый желудочек, поместите положительный на левую сторону щенка, а отрицательный — на правую сторону щенка). При размещении электродов осторожно проведите пальцем (обычно большим пальцем) по тыльной стороне тела/шеи позади головы, чтобы помочь поднять голову в нужное положение.
  4. Проверьте глубину анестезии, зажав хвост, и приступайте к электропорации только в том случае, если щенок находится в соответствующей плоскости анестезии. Слегка сожмите лопасти электродов на ростральной части головки мыши, расположив их над глазами. Нажмите ножную педаль электрода один раз, чтобы начать электропорацию. В этом протоколе используются пять импульсов по 120 В (50 мс, разделенные 950 мс); Будет слышен каждый импульс.
    1. С каждым импульсом слегка поворачивайте лопасти электрода против часовой стрелки, чтобы положительная лопастик двигалась к верхней части головки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При правильной электропорации вы почувствуете/увидите, как тело детеныша мыши дергается с каждым импульсом.
  5. После последнего импульса снимите лопатки и отложите в сторону. Переместите щенка на чистое бумажное полотенце и попросите другого сотрудника лаборатории смыть гель с головы щенка и поместить под тепловую лампу на бумажное полотенце «лодочка».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что тепловая лампа не находится слишком близко к щенкам. Позаботьтесь о том, чтобы другой сотрудник лаборатории помог вам на этом этапе, и постоянно следите за щенками. Часто полезно держать щенков в руке под тепловой лампой, чтобы увеличить тепло для щенка. Легкий массаж живота щенка также может помочь в выздоровлении.
  6. Верните щенков в домашнюю клетку, как только их тела приобретут здоровый розоватый цвет и начнут писковать на легкое пощипывание хвоста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед тем, как поместить их обратно в клетку, возьмите небольшое количество подстилочного материала домашней клетки и слегка почистите им щенков для запаха клетки. Поместите щенков обратно в клетку под подстилку и вернитесь в помещение для хранения.

5. Послеоперационные этапы

  1. Верните неиспользованную смесь плазмид из стеклянной пипетки микроинжектора обратно в пробирку. Если смеси осталось достаточно, ее можно использовать в будущих процедурах. Хранить при температуре -20 °C.
  2. Сотрите гель с электродных лопастей бумажными полотенцами.
  3. Верните все детали оборудования на прежнее место.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если для разрезания стеклянного наконечника пипетки использовались ножницы после того, как плазмидная смесь была взята, оставьте ножницы для тщательной очистки раствором ДНКазы.
  4. Распылите на стол химическое дезинфицирующее средство, затем протрите, затем распылите 70% этанола, затем снова протрите.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный выше, был использован для успешной разработки как детских, так и взрослых моделей мышей с опухолями головного мозга, причем первая из них была подробно опубликована в Kim et al.8. При правильной технике и тщательном планировании плазмидного дизайна успех развития ВП опухолей обычно составляет 100%. Гистология является самым быстрым и простым способом проверки успешной вставки плазмиды ДНК при использовании репортерного белка. Этот протокол включает в себя шаги по разработке мод...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Доставка плазмидной ДНК с помощью электропорации позволяет in vivo использовать молекулярную биологию, аналогичную той, которая используется в генетически модифицированных моделях мышей, но со скоростью, локализацией и эффективностью вирусной трансдукции 8,13,14. Последнее, однако, связано с проблемами безопасности, а также с иммунными реакциями. В нашей моделирующей системе с использованием ВП-доставки плазмидной ДНК м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим Ги Бум Кима за иммунофлуоресцентное окрашивание и изображения. Мы также благодарим Эмили Хатанаку, Наоми Кобриц и Пола Линеша за полезные советы по протоколу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,1-2,5 & микро; L 1-канальный дозаторEppendorf3123000012
2 & микро; L наконечники для пипетокFisher Scientific02-707-442
20 & микро; L наконечники для пипетокFisher Scientific02-707-432
2-20 &; L 1-канальный пипеткаEppendorf3123000098
DNAZap PCR Растворы для деградации ДНКFisher ScientificAM9890
ECM 830 Square Porator ElectroporatorBTX45-0662
Электродный гельParker LabsPLI152CSZ
быстрым зеленым красителемSigma-AldrichF7258-25G
Helping Hands Вспомогательное средство для пайкиPro'sKit900-015
Микро-ножницы для препарирования, 4,5 дюйма Прямой острыйRobozRS-5916
Штамм мыши: C57BL/6JЛаборатория ДжексонаJAX: 000664
Штамм мыши: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/JЛаборатория Джексона  JAX: 007676
Parafilm Grainger16Y894
Плазмида: pCag-FlpO-2A-Cre EV Addgene129419
Платиновый пинцетрод, диаметр 7 мм BTX45-0488
Контейнер для острых предметов, 1 литрUlineS-15307
Стандартные стеклянные капилляры, 4 дюйма, 1 мм OD, 0,58 мм IDWorld Precision Instruments1B100F-4Капиллярные пипетки необходимо вытащить - подробности см. в ссылке 10.
Вертикальный съемник микропипетокSutter InstrumentsP-30Настройки нагрева: Нагрев #1 при 880, Нагрев #2 при 680; Вытягивание при 800. Более подробную информацию о вытягивании см. в ссылке 10.
Vimoba ТаблеткиQuip LaboratoriesVIMTAB
XenoWorks Цифровой микроинъекторSutter InstrumentsBRE
XenoWorks Держатель микропипеткиSutter InstrumentsBR-MH

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
  2. Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
  3. He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089(2021).
  4. Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
  5. Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137(2018).
  6. Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
  7. Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
  8. Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
  9. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  10. Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199(2020).
  11. White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579(2021).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
  14. Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
  15. Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311(2018).
  16. Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328(2021).
  17. Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093(2012).
  18. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103(2010).
  19. Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи