Здесь представлен эффективный протокол быстрой перфузии крови для подготовки образцов тканей африканских когтистых лягушек для исследований транскриптомики и протеомики.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эффективная быстрая перфузия крови у Xenopus
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Xenopus были мощными модельными организмами для понимания развития позвоночных и болезней на протяжении более 100 лет. Здесь определяется протокол быстрой перфузии крови в Xenopus, направленный на последовательное и резкое сокращение крови во всех тканях. Перфузия осуществляется путем введения иглы непосредственно в желудочек сердца и перекачивания гепаринизированного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) через сосудистую систему. Процедура может быть завершена примерно за 10 минут на животное. В крови преобладают несколько очень распространенных белков и типов клеток, что создает многочисленные проблемы, поскольку эти белки маскируют большинство других молекул и типов клеток, представляющих интерес. Воспроизводимая характеристика тканей взрослого Xenopus с помощью количественной протеомики и одноклеточной транскриптомики выиграет от применения этого протокола до отбора проб органов. Протоколы отбора проб тканей определены в сопроводительных документах. Эти процедуры направлены на стандартизацию практики Xenopus разного пола, возраста и состояния здоровья, в частности X. laevis и X. tropicalis.
Введение
Перфузия всего тела амфибий обычно завершается с целью сохранения и фиксации 1,2,3,4,5,6. Однако эти процедуры происходят со скоростью, которая ограничивает количество свежих образцов, которые могут быть взяты на одно животное. Целью данной работы является разработка эффективного протокола перфузии крови в Xenopus, отдавая приоритет скорости техники. Протокол занимает менее 10 минут на животное для X. tropicalis и менее 15 минут на животное X. laevis. Второстепенными приоритетами являются простота репликации и использование легко приобретаемого оборудования, чтобы высококачественные образцы могли широко использоваться лабораториями Xenopus.
Лягушки Xenopus широко используются в биомедицинских исследованиях для изучения фундаментальных биологических и патологических процессов, сохраняющихся у разных видов. Этот четвероногий имеет более тесные эволюционные отношения с млекопитающими, чем другие водные модели, имея легкие, трехкамерное сердце и конечности с пальцами. Международное сообщество эффективно использует Xenopus для более глубокого понимания болезней человека посредством углубленного моделирования заболеваний и молекулярного анализа функции генов, связанных с болезнью. Многочисленные преимущества Xenopus в качестве животной модели делают их бесценными инструментами для изучения молекулярных основ развития и болезней человека; К таким преимуществам относятся: большой размер ооцитов и эмбрионов, высокая плодовитость, легкость размещения, быстрое внешнее развитие и простота геномных манипуляций. По оценкам, Xenopus разделяют ~ 80% идентифицированных генов болезней человека7.
По сравнению с популярными моделями млекопитающих, Xenopus является быстрой и экономически эффективной моделью, с легкостью нокдауна морфолино и наличием эффективных трансгенов и целевых мутаций генов с использованием CRISPR8. Количественная масс-спектрометрия и одноклеточная транскриптомика были успешно применены к эмбрионам Xenopus 9,10, но недавний клеточный атлас Xenopus laevis показывает, что в составе большинства тканей преобладают типы клеток крови11. Благодаря разработке метода, который обескровливает ткани с высокой скоростью и с использованием охлажденных сред, перфузия минимально влияет на свежесть образца. Это особенно важно для приложений, где цель состоит в том, чтобы профилировать физиологически невозмущенную экспрессию мРНК или белка.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты проводились в соответствии с правилами и положениями Гарвардской медицинской школы IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя основной метод эвтаназии, описанный Американской ветеринарной медицинской ассоциацией, считается приемлемым методом эвтаназии12, не было обнаружено, что он приводит к прекращению сердцебиения13. Даже часто используемый вторичный метод двойной порки не предотвращает этого, равно как и удаление сердца у животного. Обескровливание животных, находящихся под наркозом, считается гуманным и эффективным методом успешной эвтаназии12. Поскольку поддержание свежих тканей посредством эвтаназии является целью этого протокола, полезно, чтобы сердце продолжало биться во время первичной эвтаназии с MS-222, и что перфузия сама по себе является методом вторичной эвтаназии путем обескровливания.
1. Подготовка
- Убедитесь, что научно-исследовательское учреждение одобрило метод эвтаназии и перфузии, описанный в этом протоколе.
- Приготовьте раствор из 5 г/л MS-222 (трикаинметансульфоната) и 5 г/л бикарбоната натрия. Объем должен быть больше, чем объем, необходимый для полного покрытия усыпляемых животных. Проверьте рН, чтобы убедиться, что он составляет ≥7.
- Приготовьте 500 мкл 180 ЕД/мл гепарина в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) на X . laevis или 200 мкл на X. tropicalis.
- Проведите первичную эвтаназию, поместив Xenopus в этот раствор (из шага 1.2); Животное будет оставаться под водой в общей сложности 1 час.
- Подтвердите, что Xenopus потерял свою болевую реакцию, ущипнув ногу через 15 минут после эвтаназии. Если животное реагирует, верните его в раствор для эвтаназии до тех пор, пока этот ответ не будет потерян.
- Взвесьте Xenopus и проведите любые дополнительные измерения, необходимые перед отбором проб.
- Используя иглу весом 31 г, введите X. laevis 250 мкл и X. tropicalis 100 мкл гепарина 180 ЕД/мл в PBS (с шага 1.3) в мускулатуру каждой передней конечности.
- Готовят раствор 1 мл/г животного массой 54 ЕД/мл гепарина в перфузате PBS. Люди, более опытные с этим протоколом, могут обнаружить, что для полной перфузии требуется меньше среды.
- Используйте иглу для подкожных инъекций 22 г для перфузии X. laevis и иглу для подкожных инъекций 25 г для X. tropicali s. Затупите перфузионную иглу, обрезав кончик кусачками (рис. 1)14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это снижает вероятность перфорации иглы через желудочек при смещении. В дополнение к притуплению, игла может быть слегка отшлифована точильным камнем или напильником, но все же остается достаточно острой, чтобы проткнуть желудочек. - Подготовьте насос, присоединив обрезанную иглу и циркулируя гепаринизированный перфузат PBS 54 ЕД/мл (из шага 1.8). Убедитесь, что все пузырьки воздуха удалены из трубки, чтобы исключить возможность воздушной эмболии, которая приводит к снижению эффективности перфузии или отказу (см. Таблицу 1). Держите перфузионную среду на льду в течение всей процедуры.
- Если насос не программируется, с установленной иглой измерьте объем перекачиваемой среды при различных настройках, чтобы определить, какие настройки наиболее близки к 5 мл/мин и 10 мл/мин. Эти скорости потока будут использоваться независимо от вида. Если перфузионный насос является программируемым, откалибруйте его с установленной иглой, следуя инструкциям производителя.
- Поместите поверхность для вскрытия (лоток или лист пенопласта) под наклоном во вторичный контейнер или расположите ее так, чтобы облегчить дренаж крови.
- После того, как лягушка находилась в растворе в течение 1 часа, первичная эвтаназия была завершена. Извлеките лягушку и еще раз проверьте потерю болевой реакции, выполнив ущипывание ногой.
- Положите лягушку на спину и прижмите каждую конечность (рисунок 2). Если требуется сохранение тканей конечностей, тонкие штифты могут быть помещены через пальцы или U-образные скобы вокруг конечностей.
- С помощью ножниц для рассечения прорежьте кожу, вверх по средней линии, а затем сбоку, сделав два лоскута. (Рисунок 2)
- Используйте щипцы, чтобы захватить белую линию и вытащить ее из целомической полости (рис. 3). Аккуратно используйте ножницы, чтобы разрезать мускулатуру. Сделайте две створки из стенки полости и отрежьте или закрепите все створки в стороне.
- Используйте ножницы для рассечения, чтобы разрезать коракоидные кости и срезать лишнюю ткань, чтобы получить лучший доступ к сердцу (рис. 3).
- Сердце все еще должно биться. Если сердце перестало биться до перфузии, обратите внимание, что свежесть образца была нарушена.
2. Перфузия
- Определите желудок и аккуратно сдвиньте его так, чтобы он находился поверх левой доли печени (справа от зрителя), при этом его сосудистая сеть была видна на протяжении всей процедуры. Определите легкое и захватите его за кончик с помощью тканевых щипцов. Вытяните легкое за пределы целомической полости и проткните его через наконечник (рис. 4). Делайте это осторожно, так как лопнувшие кровеносные сосуды плохо перфузируются. Обратите внимание, видна ли кровь в доле, так как это повлияет на способность определить завершение процедуры.
- Сделайте снимок целомической полости, чтобы лучше оценить эффективность перфузии и потенциально идентифицировать аномальные ткани на более позднем этапе.
- Определите тонкий перикард и потяните его тканевыми щипцами (рисунок 5). Аккуратно перфорируйте перикард кончиком ножниц для иридэктомии, стараясь не порезать подлежащие ткани. Очистите перикард от трех камер сердца.
- Используйте щипцы, чтобы осторожно захватить желудочек за его вершину. Приложите ограниченное давление, чтобы между тракционными поверхностями щипцов оставалось достаточно места для прохождения перфузионной иглы (рис. 6).
- Введите иглу через закрытие щипцов в камеру желудочка, стараясь не перфорировать желудочек (рис. 7). Зажмите тканевые щипцы на месте с помощью иглодержателя с помощью гемостата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта техника стабилизирует положение иглы, которая все еще острая. Прижимание иглы непосредственно к желудочку также приведет к ненужным повреждениям, что затруднит рефиксацию в случае необходимости (см. Таблицу 1). - Запустите поток насоса примерно со скоростью 5 мл/мин. Три камеры сердца и артериального ствола набухают (рис. 8; см. таблицу 1).
- Ножницами аккуратно проткните правую ушную раковину (слева от зрителя); Кровь прольется рекой. Установите скорость потока на уровне 5 мл/мин или увеличьте ее до 10 мл/мин.
- Продолжайте до тех пор, пока сосудистая сеть желудка не побледнеет (см. Таблицу 1), затем копье левой ушной раковины сердца (справа от зрителя). Если скорость потока по-прежнему составляет 5 мл/мин, увеличьте ее примерно до 10 мл/мин.
- Используйте трансферную пипетку для промывания целомической полости в перфузионных средах, чтобы помочь сохранить видимость и лучше оценить цвет перфузата, вытекающего из ушных раковин.
- Удерживайте иглу на месте до тех пор, пока перфузат, вытекающий из ушных раковин, не станет прозрачным (см. Таблицу 1) и легкое не потеряет свой красный оттенок (см. Таблицу 1; Рисунок 9).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После успешной перфузии все ткани (за исключением печени у пигментированного ксенопуса) будут заметно светлее и менее насыщены кровью. Крупные кровеносные сосуды станут менее заметными (рис. 10), а ткани (за исключением печени) будут чисто промыты в буфере после отбора проб. Хотя успешное выполнение протокола в конечном итоге может быть подтверждено только качеством данных из обескровленных образцов тканей, несколько типичных проблем, их возможные причины и предлагаемые корректирующ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает традиционные методы диссекции для доступа к целомической полости. Другие методы также приемлемы, при условии, что они наносят минимальный ущерб тканям, сердце доступно, а легкие и желудок видны. Точно так же большинство перечисленных инструментов вскрытия можно легко заменить сопоставимыми предметами.
Несмотря на то, что были предприняты попытки оптимизировать эффективность этой процедуры, результаты могут варьироваться в зависимости от опыта и вариабельности между отде...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом NIH OD R24 OD031956 и грантом NICHD R01 HD073104. Мы благодарим Дарси Келли за полезные обсуждения и первоначальный вклад в этот протокол. Мы также хотели бы поблагодарить Саманту Джалберт, Джилл Ралстон и Уила Ратцана за их помощь и поддержку, а также трех наших анонимных рецензентов за их отзывы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 5x Увеличительное стекло со светодиодной подсветкой и подставкой | amazon.com | B08QJ6J8P1 | свет не должен выделять тепло |
| Одноразовые переводные пипетки | VWR | em>414004-036 | |
| Препарирующие тонкозаостренные щипцы | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Ножницы для препарирования острые пионты, прямые 6,5" | VWR | 76457-374 | |
| Диссекционный лоток | Fisher Scinetific | 14-370-284 | листы из пенополистирола являются приемлемой альтернативой |
| контейнеру для эвтаназии | US Plastic | Item 2860 | альтернативных непрозрачных контейнеров приемлемая |
| крышка контейнера для эвтаназии | US Plastic | Item 3047 | |
| Тонкие рассекающие штифты | Живые системы Контрольно-измерительные приборы | PIN-#3 | |
| Иглы для подкожных инъекций общего назначения, 22 г | Fisher Scientific | 14-826-5A | для X. laevisИглы |
| для подкожных инъекций, 25 г | Fisher Scientific | 14-826AA | для X. tropicalis |
| Гепарин, слизистая | оболочка кишечника свиньиMilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Иридэктомические ножницы 6" | vwr | 470018-938 | Ножницы для радужной оболочки являются приемлемой альтернативой |
| адаптеру Luer-to-barb male Luer со стопорным кольцом | amazon.com | B09PTX6M2Z | размер будет зависеть от шланга используемого |
| иглодержателя Mayo-Hegar | Fisher Scinetific | 08-966 | москитные щипцы являются приемлемой альтернативой |
| MS-222: Синкаин (ранее трикаин) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Перистальтический жидкостный насос-дозатор 5– 100 мл/мин | amazon.com | B07PWY4SM6 | любым перистальтическим насосом, способным откачивать 5-10 мл/мин допустимо |
| Точильный камень | VWR | 470150-112 | опционально; для притупления иглы |
| Бикарбонат натрия, порошок, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Образец щипцов, зубчатый | VWR | 82027-442 | |
| Т-образные штифты для препарирования | Фишера Scinetific | S99385 | |
| Ультратонкие короткие инсулиновые шприцы, 31 г | VWR | BD328438 | |
| Проволочные промывочные ножницы, 6-дюймовые ультраострые и мощные боковые ножницы | amazon.com | B087P191LP |
Ссылки
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154(2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306(2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37(2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331(2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
